CC BY
8
УДК 616.381-007.274 © В.Б. Барканов, 2012
В.Б. Барканов
МАРКЕРЫ ФНО-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА В ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ СПАЙКАХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ (ПО МАТЕРИАЛАМ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКИХ ВСКРЫТИЙ)
ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»
Минздравсоцразвития России ГКУЗ «Волгоградское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Волгоградской области
Для изучения распределения маркеров ФНО-индуцированного апоптоза в перитонеальных спайках в зависимости от их локализации и активности воспалительного процесса проведено исследование 213 спаек, обнаруженных при 79 аутопсиях случаев насильственной смерти от механических причин. По морфологическим критериям спайки разделяли на активные и неактивные, раздельно определяли проценты макрофагов и эндотели-альных клеток, иммунопозитивых к лиганду TRAIL и каспазе-3. Свыше 25 % спаек были отнесены к категории активных. В их тканях присутствовало значительное количество TRAIL-позитивных макрофагов, что свидетельствовало о высокой чувствительности к механизмам ФНО-зависимого апоптоза. Экспрессия TRAIL и кас-пазы-3 в макрофагах зависела от локализации спайки и была максимальна в случаях их прикрепления к печени или желчному пузырю. Относительно малая вовлеченность эндотелиальных клеток в механизмы ФНО-зависимого апоптоза в спайках предположительно способствует процессам поддержания хронического воспаления и прироста соединительной ткани в активных спайках.
Ключевые слова: перитонеальные спайки, апоптоз, макрофаги, эндотелиальные клетки.
V.B. Barkanov
MARKERS OF TNF-RELATED APOPTOSIS IN PERITONEAL ADHESIONS OF DIFFERENT LOCALIZATION (MATERIALS OF MEDICO-LEGAL AUTOPSIES)
To study the distribution of markers of TNF-related apoptosis in peritoneal adhesions, depending on their localization and activity of inflammatory process, 213 revealed adhesions in 79 autopsies after violent death from mechanical causes were investigated. According to morphological criteria all adhesions were subdivided into active and inactive; the percentage of macrophages and endothelial cells, expressing TRAIL and caspase-3, was separately determined. Over 25 % of the adhesions were classified as active. These tissues presented a significant amount of TRAIL-positive macrophages, indicating a high sensitivity to the mechanisms of TNF-dependent apoptosis. The expression of TRAIL and caspase-3 in macrophages was dependent on the location of adhesions, and they were maximal in the cases of their attachment to the liver or gall bladder. A relatively small involvement of endothelial cells into the mechanisms of TNF-related apoptosis in adhesions, may presumably contribute to the maintenance of chronic inflammatory processes and the growth of connective tissue in the active adhesions.
Key words: peritoneal adhesions, apoptosis, macrophages, endotheliocytes.
Введение. Постепенное нарастание общей продолжительности жизни, прогресс в области эндоскопической хирургии и материаловедения, активная хирургическая тактика в акушерстве и гинекологии в совокупности приводят к тому, что все большее количество людей подвергается за свою жизнь неоднократным оперативным вмешательствам, свыше трети из которых приходится на брюшную полость [4, 9, 10]. Наличие и характер спаек может являться предметом изучения судебно-медицинских экспертиз [14].
Уникальная способность брюшины состоит в том, что ее естественным ответом на любую операционную травму является развитие адгезивного процесса, соединяющего ткани, то есть спайкооб-разования. Важнейшими факторами инициации образования спаек является гипоксия ткани, повреждение мезотелия, выброс ФНО и других провоспалительных цитокинов [11, 17]. Эта триада трудно устранима, поэтому специалисты отмечают, что переход к современным малоинвазивным методикам и использование дорогостоящих профилактических процедур не слишком уменьшают частоту формирования послеоперационных спаек. Их можно выявить при тщательном обследовании у 70-90 %
лиц, ранее оперированных на брюшной полости [9, 13]. Многолетнее фундаментальное исследование проф. А.А. Воробьева [4], проведенное на большом секционном материале, убедительно доказывает, что единожды сформированная спайка пожизненно интегрируется в структурно-функциональные взаимоотношения в брюшной полости данного организма. Результатом этого нередко становится очаг хронического воспаления в брюшной полости или формирование новой патологии - болевых синдромов, кишечной непроходимости, механического бесплодия, эктопической беременности [10, 12].
Поведение конкретной спайки во многом зависит от динамики и активности ее ключевых клеточных популяций. Наиболее активными клетками в спайках являются макрофаги (МФ) и эндотели-альные клетки (ЭК), которые способны высвобождать в перитонеальную полость биологически активные вещества, что является основой для поддержания местного воспалительного процесса и хронического системного воспалительного ответа со стороны организма [13, 16].
Основным механизмом, регулирующим численность клеток в ткани в подобных условиях (фактически - в очаге хронического воспаления), является программированная клеточная гибель - апоп-тоз [8, 15].
В экспериментах на животных и опытах in vitro показано, что МФ и ЭК высоко чувствительны к гипоксии, окиси азота, бактериальным липополисахаридам и ФНО [6]. По несколько отличным путям они стимулируются этими факторами и вначале резко увеличивают свою синтетическую активность, а затем подвергаются ФНО-зависимому апоптозу [2, 7].
Внедрение в клиническую морфологию современных иммуногистохимических методов исследования позволяет на новом уровне охарактеризовать процесс апоптоза клеток в перитонеальных спайках, а отсутствие подобных характеристик в доступной литературе делает целесообразным проведение в данном направлении специального клинико-морфологического исследования.
Цель: изучить гистотопографическое распределение маркеров ФНО-индуцированного апопто-за в перитонеальных спайках в зависимости от их локализации и активности воспалительного процесса в брюшной полости.
Материал и методы исследования. Первичный материал для исследования составили 213 спаек, обнаруженных при аутопсии 79 трупов (44 мужчины и 35 женщин). Такой объем был получен на базе Волгоградского областного бюро судебно-медицинской экспертизы в течение 20082011 гг. при аутопсиях 1034 трупов с насильственным характером смерти от механических травм или механической асфиксии (частота выявления - 7,6 %). Ограничение по причинам смерти позволило исключить наличие изменений, связанных с декомпенсированными формами различных хронических заболеваний. Возраст на момент наступления смерти в выборке был ограничен периодом от 35 до 74 лет. Почти в половине случаев на аутопсии выявлялось две или более абдоминальных спайки.
По всем отобранным случаям была проанализирована доступная медицинская документация учреждений, на учете в которых состояли умершие лица. Предметом анализа были данные о перенесенных заболеваниях или травмах брюшной полости, которые могли послужить причиной спаечного процесса. Был проведен анализ операционных вмешательств, выявляемых по факту аутопсии.
При заборе спаек сохраняли точки их фиксации к внутренним органам и тканям для гистологического исследования. Все обнаруженные спайки были описаны в соответствии с классификацией А.А. Воробьева [4], документирована распространенность и топография спаечного процесса, описан макроскопический морфологический тип внутрибрюшинных сращений.
Для проведения морфологического исследования спайки фиксировали в нейтральном забуфе-ренном 10 % водном растворе формалина, материал заливали в парафин по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, по Зербино. Полученные микропрепараты были описаны, типичные из них оцифрованы на микроскопе Микмед-6 (ЛОМО, Россия), оснащенном фотокамерой DCM 130 (Hangzhou Scopetek Opto-Electric Co., Ltd., China). На основании гистологического исследования в области точек фиксации спаек, наличия признаков воспаления в прилежащей ткани внутренних органов и/или наличия воспалительного перитонеального экссудата, они были разделены, как это было предложено ранее [3], на активные и неактивные спайки.
Для выявления процессов апоптоза в ткани печени использовали моноклональные антитела (DakoCytomation, Дания) к антигенам TRAIL-рецептора ФНО, запускающего каскад апоптоза, и кас-пазы-3 - нуклеазы общего конечного пути апоптоза, экспрессия которой свидетельствует о необратимости запущенного процесса программированной гибели клетки [8].
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител [5].
Морфометрический анализ был проведен в соответствии со сложившимися принципами количественных морфологических исследований [1]. Определяли долю иммунопозитивых клеток раздельно среди МФ и ЭК (%) в различных частях спайки с использованием программного пакета Image Tool for Windows, v.3.00 (UTHSCSA, USA. 2002). В объем каждой выборки вошли результаты в 5 полях зрения при 2 стеклах в 12 блоках - всего по 120 значений. Статистическая обработка проводилась непосредственно из общей матрицы данных программы MS Excel 2003 (Microsoft, USA) и после проверки выборки на нормальность распределения, включала в себя определение показателей средней, ее среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности.
Результаты исследования и их обсуждение. Макроскопически все обнаруженные перитоне-альные спайки имели пленчатое (73 находки, 34,3 %) или пластинчатое (140 находок, 65,7 %) строение. Активные спайки (чуть более четверти от выявленных в работе) имели мозаичное строение. Помимо участков зрелой соединительной ткани в них присутствовали островки и поверхностные отложения грануляционной ткани. В этих участках выявлялось большое количество капилляров, множество скоплений МФ и лимфоцитов. Количество фибробластов и соединительнотканного матрикса в таких очагах было незначительно. Можно было наблюдать небольшие поверхностные или перива-скулярные скопления полиморфноядерных лейкоцитов, полнокровие сосудов и тканевой отек. По поверхности спайки при окраске по Зербино обнаруживались гранулы и нити свежевыпавшего и «зрелого» фибрина.
Неактивные спайки (основная часть выявленных в работе) были представлены типичной зрелой соединительной тканью с небольшим количеством сосудов. Среди клеток доминировали фибробла-сты, встречались немногочисленные МФ и лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты отсутствовали. В некоторых крупных спайках можно было выявить небольшие лимфоцитарные скопления, расположенные периваскулярно. Основная масса ткани была выполнена однородным коллагеновым матриксом. При окраске по Зербино было видно, что на поверхности спайки фибрин отсутствует.
Этиологический анализ по результатам исследования медицинской документации и аутопсий-ных признаков подтвердил, что наиболее часто формирование перитонеальных спаек связано с перенесенными операциями на органах брюшной полости или малого таза (свыше половины находок), далее по частоте следуют хронические заболевания органов пищеварения (гастриты, язвенная болезнь, холециститы и панкреатиты) без оперативного вмешательства. В части случаев причины спаек не могли быть установлены. Распределение активных и неактивных спаек в зависимости от выявленной этиологии приведено в таблице 1
Таблица 1
Причины обнаруженных абдоминальных спаек при судебно-медицинских аутопсиях_
Заболевания и состояния Обнаружено спаек (%)
Активные Неактивные Всего
Перенесенные абдоминальные операции 24 (11,3 %) 93 (43,7 %) 117 (54,9 %)
Травмы брюшной полости (неоперационные) 3 (1,4 %) 12 (5,6 %) 15 (7,1 %)
Заболевания органов пищеварения (неоперированные) 16 (7,5 %) 13 (6,1 %) 29 (13,6 %)
Заболевания мочеполовой системы (неоперированные) 7 (3,3 %) 2 (0,9 %) 9 (4,2 %)
Не установлено 6 (2,8 %) 37 (17,4 %) 43 (20,2 %)
Всего 56 (26,3 %) 157 (73,7 %) 213 (100%)
Как видно из представленных данных, активные спайки с богатой клеточной инфильтрацией (чаще у мест прикрепления) наиболее часто можно было обнаружить в случаях адгезивного процесса, развивающегося после абдоминальных операций или неоперированных заболеваний пищеварительной или мочеполовой системы. Посттравматические спайки и спайки с неустановленной этиологией чаще всего были неактивными с малым количеством МФ и ЭК в плотном веществе соединительной ткани.
Почти половина обнаруженных случаев была представлена межкишечными спайками и сращениями между печенью и кишечником, все остальные варианты встречались примерно с равной частотой - от 8,0 до 11,3 %. Наиболее часто активные спайки обнаруживались среди сращений, прикрепленных к печени, желчному пузырю или матке, реже всего - в межсальниковых сращениях (табл. 2).
Таблица 2
Причины обнаруженных абдоминальных спаек при судебно-медицинских аутопсиях_
Локализация Обнаружено спаек (%)
Активные Неактивные Всего
Кишечник - кишечник 6 (2,8 %) 49 (23,0 %) 55 (25,8 %)
Кишечник - печень 9 (4,2 %) 26 (12,2 %) 35 (16,4 %)
Кишечник - сальник 4 (1,9 %) 20 (9,4 %) 24 (11,3 %)
Кишечник - матка 7 (3,3 %) 15 (7,0 %) 22 (10,3 %)
Печень - желчный пузырь 13 (6,1 %) 11(5,2 %) 24 (11,3 %)
Печень - сальник 7 (3,3 %) 10 (4,7 %) 17 (8,0 %)
Желчный пузырь - сальник 9 (4,2 %) 8 (3,8 %) 17 (8,0 %)
Сальник - сальник 1 (0,5 %) 18 (8,5 %) 19 (8,9 %)
Всего 56 (26,3 %) 157 (73,7 %) 213 (100%)
Различия в частоте обнаружения маркеров апоптоза в МФ и ЭК активных и неактивных спаек с зависимости от места их прикрепления представлены в таблице 3.
Обращало на себя внимание относительно более частое присутствие TRAIL на мембране МФ в тканях активных спаек, тогда как частота выявления этого лиганда в МФ неактивных спаек не превышала 10 %. При анализе показателя в связи с локализацией точки прикрепления спайки было обнаружено, что наиболее часто TRAIL выявляется в МФ области прикрепления спайки к печени и желчному пузырю. Частота экспрессии каспазы-3 в МФ перитонеальных спаек была явно меньше: близка к 5 % в активных спайках, прикрепленных к желчному пузырю и печени, около 2 % - в большинстве остальных локализаций. В неактивных спайках, прикрепленных к сальнику и кишечнику, каспаза-3 в макрофагах не обнаруживалась вовсе.
Таблица 3
Присутствие маркеров апоптоза в макрофагах и эндотелиальных клетках _перитонеальных спаек различной локализации (Ж ± т)_
Точка фиксации Характер спаек
Активные Неактивные
Доля макрофагов, иммунопозитивных к TRAIL, %
Печень 25,7 ± 1,8 10,2 ± 0,6 *
Желчный пузырь 29,4 ± 2,2 9,7 ± 0,6 *
Сальник 14,8 ± 1,0 8,5 ± 0,4 *
Кишечник 15,9 ± 1,2 9,3 ± 0,5 *
Матка 17,5 ± 1,4 7,7 ± 0,4 *
Доля макрофагов, иммунопозитивных к каспазе-3, %
Печень 4,5 ± 0,3 2,0 ± 0,3 *
Желчный пузырь 5,7 ± 0,6 1,7 ± 0,2 *
Сальник 2,0 ± 0,2 0 *
Кишечник 3,1 ± 0,3 0 *
Матка 2,6 ± 0,3 1,0 ± 0,1 *
Доля эндотелиальных клеток, иммунопозитивных к TRAIL, %
Печень 17,4 ± 2,5 11,0 ± 0,7 *
Желчный пузырь 20,3 ± 1,8 12,6 ± 1,1 *
Сальник 15,2 ± 1,1 0 *
Кишечник 18,3 ± 1,5 0 *
Матка 11,8 ± 0,7 0 *
Доля эндотелиальных клеток, иммунопозитивных к каспазе-3, %
Печень следы 0
Желчный пузырь следы 0
Сальник 0 0
Кишечник 0 0
Примечание: * - достоверные различия между группами (р < 0,05)
Количество ЭК, иммунопозитивных клеток к TRAIL, составляло в активных спайках от 15 до 20 %, лишь в области прикрепления к матке несколько меньше. В ЭК неактивных спаек TRAIL практически обнаруживать не удавалось. Соответственно, нам не удалось обнаружить убедительные следы реализуемого ФНО-зависимого апоптоза в ЭК активных и неактивных спаек брюшной полости.
Проведенное исследование было призвано показать особенности экспрессии маркеров ФНО-зависимого апоптоза в МФ и ЭК спаек брюшной полости в связи с их локализацией и активностью. Обнаруженные спайки были бессимптомными или малосимптомными, во всяком случае, ни в одном из 79 случаев их присутствие нельзя было связать с танатогенезом.
Важной находкой работы явилось то, что МФ (особенно в активных спайках) довольно часто экспрессируют TRAIL. Это делает МФ, в отличие от ЭК, высокочувствительными к любым внешним воздействиям, сопровождающимся выбросом ФНО. Источником медиатора могут стать клетки, приносимые в спайку гематогенно, или перитонеальные МФ [16].
Программированная гибель клеток - очень скоротечный процесс, занимающий всего несколько десятков минут [8, 15]. При хроническом процессе, когда отсутствует интенсивная пролиферация, не следует ожидать одновременного вовлечения в апоптоз значительного количества клеток. Именно этим объясняется невысокий процент обнаруженных в спайках клеток, иммунопозитивных к каспазе, то есть с реализуемыми механизмами апоптоза [18]. Даже при этих невысоких значениях отчетливо проявляются различия между МФ и ЭК. По-видимому, последние в перитонеальных спайках не вовлечены в процессы ФНО-зависимого апоптоза.
Гипотетическая модель событий, связанная с апоптозом МФ и ЭК в спайках, представлена на рисунке.
Рис. Участие ФНО-зависимого апоптоза в механизмах стабилизации или роста перитонеальной спайки
Реализация апоптоза макрофагов при сохранении эндотелиальных клеток способствует адге-зиогенезу.
Исследование подтверждает, что в длительно существующей активной спайке реализуется преимущественно часть процесса, связанная с апоптозом МФ. В итоге стабилизация спайки не достигается, в условиях богатой васкуляризации продолжается прирост вещества спайки за счет новообразования соединительной ткани.
Заключение. Таким образом, свыше 25 % спаек, выявляемых как случайные находки при судебно-медицинских аутопсиях, могут быть отнесены к категории активных. В их тканях присутствует значительное количество макрофагов, экспрессирующих на своей мембране TRAIL, что делает их чувствительными к механизмам ФНО-зависимого апоптоза. Активность этого процесса зависит от локализации спайки и максимальна в случаях их прикрепления к печени или желчному пузырю. Относительно малая вовлеченность эндотелиальных клеток в механизмы ФНО-зависимого апоптоза в спайках может способствовать дальнейшей их нестабильности и приросту соединительной ткани.
Список литературы
1. Автандилов, Г. Г. Основы количественной патологической анатомии / Г. Г. Автандилов. -М. : Медицина, 2002. - 240 с.
2. Антонова, О. А. Повреждение и активация эндотелиальных клеток при гипоксии in vitro / О. А. Антонова, С. А. Локтионова, Н. В. Голубева и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, № 10. - С. 384-386.
3. Барканов, В. Б. Анализ распределения клеточных элементов в сформированных спайках верхнего этажа брюшной полости / В. Б. Барканов, А. А. Воробьев, С. В. Поройский и др. // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2009. - № 2. - С. 48-51.
4. Воробьев, А. А. Морфологические и хирургические аспекты профилактики послеоперационного спайкообразования / А. А. Воробьев, С. В. Поройский, В. Б. Писарев и др. - Волгоград : Изд-во ВолГМУ, 2005. - 136 с.
5. Иммуногистохимические методы : руководство / под ред. Г. Кумара и Л. Рудбека. - М., 2011. - 224 с.
6. Калашникова, С. А. Индукция ФНО-зависимого апоптоза и формирование патологии печени при эндогенной интоксикации и тиреоидной дизрегуляции у крыс / С. А. Калашникова, В. В. Но-вочадов, А. Н. Горячев // Морфологические ведомости. - 2008. - № 3-4. - С. 38-40.
7. Малышева, Е. В. Внутриклеточный и внеклеточный NO дифференциально модулирует стресс-ответ и апоптоз в макрофагах, подвергнутых воздействию биологических или физических факторов / Е. В. Малышева, С. В. Круглов, В. А. Назаров и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 6. - С. 614-618.
8. Тяжелова, В. Г. TRAIL- и Wnt-сигнальные пути в апоптозе / В. Г. Тяжелова // Иммунология.
- 2005. - № 6. - С. 377-384.
9. Федоров, В. Д. Хирургическая «эпидемиология» образования спаек в брюшной полости / В. Д. Федоров, В. А. Кубышкин, И. А. Козлов // Хирургия. - 2004. - № 6. - С. 50-53.
10. Чекмазов, И. А. Спаечная болезнь брюшины / И. А. Чекмазов. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008.
- 160 с.
11. Atta, H. M. Prevention of peritoneal adhesions : a promising role for gene therapy / H. M. Atta // World J. Gastroenterol. - 2011. - Vol. 17, № 46. - P. 5049-5058.
12. Binnebosel, M. Morphology, quality, and composition in mature human peritoneal adhesions / M. Binnebosel, U. Klinge, R. Rosch et al. // Langenbeck's Arch. Surg. - 2008. - Vol. 393. - P. 59-66.
13. Brokelman, W. J. Peritoneal changes due to laparoscopic surgery / W. J. Brokelman, M. Lensvelt, I. H. M. Borel-Rinkes et al. // Surg. Endosc. - 2011. - Vol. 25, № 1. - P. 1-9.
14. Ellis, H. Medico-legal consequences of post-operative intra-abdominal adhesions / H. Ellis, A. Crowe // Int. J. Surg. - 2009. - Vol. 7. - P. 187-191.
15. Elmore, S. Apoptosis : a review of programmed cell death / S. Elmore // Toxicol. Pathol. - 2007. -Vol. 35, № 4. - P. 495-516.
16. Epstein, J. C. Human peritoneal adhesions show evidence of tissue remodeling and markers of an-giogenesis / J. C. Epstein, M. S. Wilson, S. Wilkosz et al. // Dis. Colon. Rectum. - 2006. - Vol. 49. -P.1885-1892.
17. Fletcher, N. M. Hypoxia-generated superoxide induces the development of the adhesion phenotype / N. M. Fletcher, Z. L. Jiang, M. P. Diamond et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2008. - Vol. 45. - P. 530-536.
18. Todorovic, V. The matrix protein CCN1 (CYR61) induces apoptosis in fibroblasts / V. Todorovic, C. С. Chen, N. Hay, L. F. Lau // J. Cell. Biol. - 2005. - Vol. 171, № 3. - P. 559-568.
Барканов Вячеслав Борисович, кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой судебной медицины, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, начальник ГКУЗ «Волгоградское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Волгоградской области, Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1, тел.: 88442375627, e-mail: barkanoif@mail.ru.
