CC BY
29
УДК 612.014.1.017 : [616.24-002 + 616.921.5]
Т.Ф. Боровская, Э.Х. Курпас, В.И. Резник, Е.П. Когут
МАРКЕРЫ АКТИВАЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ИММУННЫХ КЛЕТОК В РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ У БОЛЬНЫХ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ ПРИ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСНОГО АГЕНТА В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ БРОНХОВ
Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Хабаровском крае; Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск
Характер воспалительного процесса и иммунный ответ зависят не только от особенностей реакции макроорганизма, но и определяются видом возбудителя. Вирусная инфекция часто является пусковым моментом развития заболевания, и в дальнейшем, при присоединении бактериальной инфекции, развивается местный воспалительный процесс [5]. При этом вирус в очаге воспаления сохраняется определенное время в течение заболевания. Учитывая возможность вирусного влияния на течение и исход заболевания, был проведен анализ показателей клеточного звена системного и местного иммунитета в остром периоде болезни при детекции вирусов респираторной группы в бронхиальных смывах и в зависимости от его вида у больных внебольничной пневмонией.
Материалы и методы
Обследовано 110 больных внебольничной пневмонией в возрасте от 18 до 24 лет, без сопутствующих заболеваний, в том числе органов дыхания, находившихся на лечении в профильных отделениях 301 Окружного военного клинического госпиталя и торакальном отделении Детской краевой многопрофильной клинической больницы №2. Средний возраст обследованных больных составил 19+0,11 лет. В группу контроля вошли 12 практически здоровых лиц в возрасте от 14 до 19 лет, которые поступили в клиники г. Хабаровска по поводу удаления инородного тела бронха и которые по результатам клинико-инструментального обследования были признаны здоровыми.
Иммунофенотипирование клеток проводили в соответствии со стандартизованным методом иммуно-флюоресценции [3]. Для проведения иммунофлюо-ресцентного анализа количественного состава иммунных клеток слизистой оболочки крупных бронхов (СОКБ) клеточную суспензию лимфоцитов получали по методике С.Л. Нестерчук с соавт. [1]. Фенотип иммуноцитов — активационные маркеры пролиферации (CD71 +) и апоптоза (CD95+) — определяли в трех биологических средах: периферической крови, бронхиальных смывах и СОКБ. Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре "FACScan" фирмы "Beckton Dickinson" (США). Для идентификации
Резюме
Структурный, в том числе иммунный гомеостаз поддерживается равновесием между популяциями делящихся и отмирающих клеток. Изучали соотношение проли-ферирующих (CD75+) и готовых к апоптозу (CD95+) иммуноцитов в различных биологических средах при детекции в бронхиальных смывах вирусов респираторной группы у больных внебольничной пневмонией. Показано изменение числа клеток исследуемых популяций и их соотношения в зависимости от вида вирусного агента.
T.F. Borovskaya, Е.Н. Kurpas, V.I. Reznik, Е.Р. Kogut
THE MARKERS OF IMMUNE CELLS PROLIFERATION ACTIVATION AND APOPTOSIS IN DIFFERENT BIOLOGICAL SUBSTANCES
IN PATIENTS WITH COMMUNITY ACQUIRED PNEUMONIA AT THE VIRAL AGENTS' DETECTION IN BRONCHI MUCOUS
Khabarovsk affiliate of the Far-Eastem research center of respiratory pathology and physiology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences - Mother and child care institute, the center for sanitary and epidemiological supervision in the Khabarovsk Territory, Far-Eastem state medical university
Summary
Structural, including immune homeostasis, is supported by the equilibrium between the populations of multiplying and destroying cells. The correlation between proliferating (CD75+) and ready for apoptosis (CD95+) immuno-cytes in different biological substances with detected respiratory viruses in bronchi lavage from patients with community acquired pneumonia was investigated. The change m cell number of investigated populations and their correlation depending on viral agent type was revealed.
иммунных клеток использовали моноклональные антитела фирмы "Caltag" (ВигНг^ате, СА), применяемыми как для клинических, так и для исследовательских целей.
Выявление вируса и/или вирусного антигена респираторной группы (гриппа А и В, аденовирусов, РС-
Маркеры пролиферации (С1)71 +) и апоптоза (СЭ95+) в различных биологических средах в остром периоде впебольиичной пневмонии при детекции вирусов респираторной группы в бронхиальных смывах, %
Показатель Вирус (+) Группа сравнения, п-12 Достоверность
Вирус (-), п-74 Вирус (+), п-36 РС-вирус, п=15 Грипп А и В, п—10 Аденовирус, п-5 Р Р1 Р2 Рз
В периферической крови
Лейкоциты 7,61+0,24 8,16±0,83 8,52+1,50 7,06±0,61 10,00±1,90А 6,85±0,16 >0,05 >0,05 >0,0 >0,05
Лимф.(отн.) 27,2б±1,19с 26,68±2,18л 28,46+3,68* 25,88+2,32° 18,67±4,90с 37,82±1,07 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Лимф.(абс.) 1,98+0,08*** 1,94+0, 12*** 2,02±0, 16* 1,83±0,24*** 1,69±0,29с 2,51±0,08 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
С071 + 20,25±2,98 19,92±3,15 19,71±4,98 22,47±0,89 9,88±1, 52** 28,77+3,51 >0,05 >0,05 <0,001 >0,05
СОЭ5+ 26,31 ±2,77 22,63±5,62 24,46±8,84 19,44±2,45 32,71 + 1,41 28,00±4,53 >0,05 >0,05 <0,01 >0,05
В бронхиальных смывах
СЭ71 + 22,95±1,74 21,59+2,94 13,26± 1,41 32,35±3,93А 31,00±3,90* 17,30+3,03 >0,05 <0,001 >0,05 <0,001
С095+ 28,11 ±2,76 34,49±4,18** 42,67±4,92с 18,98±2,43 31,19+0,98* 16,06±3,83 >0,05 <0,002 <0,005 >0,05
В слизистой оболочке крупных бронхов
С071 + 20,85± 1,95 29,57±3,63 27,64±4,09 35,10±4,14** 18,40±2,70 21,68±2,89 <0,02 >0,05 <0,02 >0,05
С 095+ 27,32+2,18 27,72±4,47 32,80±4,18** 18,04±4,62 22,85±2,65 14,35+5,56 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05
Примечания. Различия с группой сравнения достоверны: * — р<0,05; ** — р<0,02; *** — р<0,()1; А — р<0,005; в — р<0,002; с — р<0,001. р — достоверность различий между показателями групп—вирус (+) и вирус (-); р, — достоверность различий между показателями групп—вирус (+), РС-вирус и вирус гриппа А и В; р2 — достоверность различий между показателями групп—вирус (+) гриппа А и В и аденовирус; р., — достоверность различий между показателями групп—вирус (+), РС-вирус и аденовирус.
вируса) проведено на 110 образцах бронхиальных смывов. Для детекции вирусов гриппа использовали два метода:
1) выделение вирусов заражением культуры тканей МББК пробами бронхиальных смывов с последующей индикацией вирусов в культуральной жидкости в реакции торможения гемагглютинации;
2) определение антигенов вирусов гриппа непосредственно в образцах бронхиальных смывов в им-муноферментном анализе.
РС-вирус и аденовирусы изолировали заражением культуры тканей Л-41 пробами бронхиальных смывов с последующей идентификацией в реакции связывания комплемента. Для диагностических реакций использовали коммерческие тест-системы производства Института гриппа МЗ РФ.
Положительный результат получили в 36 наблюдениях: РС-вирус выделен в 15 случаях, вирус гриппа А и В — в 10, аденовирус — в 5, и в 6 наблюдениях регистрировали микст-инфекцию — РС-вирус и вирус гриппа А. Больных с наличием микст-инфекции в данную разработку не включали.
Все вирусологические исследования проводились в вирусологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора в Хабаровском крае.
Результаты и обсуждение
У больных внебольничной пневмонией в остром периоде болезни на фоне абсолютной и относительной лимфопении при наличии/отсутствии вирусного агента в бронхиальных смывах выявили достоверное отличие числа С071+ клеток только в СОКБ, причем в группе вирус(+) этот показатель был в 1,4 раза выше, что свидетельствует о локальном (местном) усилении пролиферативной активности иммуноцитов в присутствии вирусного агента. Группа вирус(+) включает три вируса респираторной группы, поэтому анализ мнто-
тического гомеостаза в отдельно взятой группе позволил более точно выявить характер процессов пролиферации и апоптоза иммунных клеток в различных биологических средах (таблица).
При идентификации в бронхиальных смывах аденовируса в периферической крови регистрировали достоверное уменьшение по отношению к группе сравнения числа пролиферирующих (СЭ71 +) клеток. При этом число клеток, готовых к апоптозу (СБ95+), превышало показатели группы сравнения в 1,2 раза (р>0,05). Угнетение в присутствии данного вируса пролиферативного компартмента и активация апоп-тотического процесса иммуноцитов кровяного русла, возможно, свидетельствуют о деструктуризации гомеостаза системного иммунитета. В то же время при выявлении в бронхиальных смывах вирусов респираторной группы можно говорить и о перераспределении С071+ клеток из периферической крови в очаг воспаления на фоне увеличения числа клеток, готовых к апоптозу (СБ95+) в кровяном русле.
При идентификации РС-вируса и вируса гриппа А и В выявлено уменьшение числа как СВ71+, так и С095+ клеток (р>0,05). Соотношения лимфоцитов, несущих на мембране клеток рецепторы к СБ71+ и СБ95+ маркерам, в бронхиальных смывах имеют другие закономерности, чем в периферической крови больных внебольничной пневмонией.
Так, при детекции аденовируса регистрировали равномерное, по отношению к группе сравнения, увеличение пула пролиферирующих (С071+) клеток и популяции клеток, готовых к апоптозу (СБ95+) (р<0,05 и р<0,05), что обеспечивает сохранный митотический потенциал за счет увеличения обеих популяций клеток. При идентификации вируса гриппа А и В выявлено достоверное, по отношению к контролю, увеличение С071+клеток при неизмененном числе клеток, готовых к апоптозу, что указывает на активацию про-
лиферативных процессов иммуноцитов бронхиальных смывов. Наличие в бронхиальных смывах РС-вируса выявило диаметрально противоположные закономерности в сравнении с вирусами гриппа А и В: регистрировали увеличение числа клеток, готовых к апоптозу (СОЭ5+) на фоне неизмененного показателя СБ71+. То есть, в бронхиальных смывах выявили различные механизмы нарушения митотического гомеостаза: за счет увеличения пролиферативного и апоптотическо-го пулов при детекции аденовируса, за счет увеличения пролиферативного компартмента при детекции вируса гриппа А и В и за счет усиления процессов апоптоза при выявлении РС-вируса.
Существует мнение, что состав иммунных клеток бронхиальных смывов отражает локальное состояние иммунитета слизистых оболочек. С целью выяснения, насколько данные исследования числа иммунных клеток в бронхиальных смывах соответствуют местному тканевому иммунному ответу, был проведен анализ изменений иммунных реакций пулов лимфоцитов СОКБ в зависимости от вида вируса.
Нарушение митотического гомеостаза клеток СОКБ наблюдали в группе с наличием РС-вируса и вирусов гриппа А и В. Причем, уровень числа клеток с фенотипом С071+ был выше, чем численность клеток, готовых к апоптозу (СБ95+) в группе с наличием вируса гриппа А и В, а СБ95+ клеток — выше в группе больных с наличием РС-вируса (р<0,02). То есть, при выявлении в бронхиальных смывах вируса гриппа А и В и РС-вируса в СОКБ наблюдали аналогичные закономерности, что и при исследовании митотического гомеостаза в бронхиальных смывах. При детекции же аденовируса увеличения числа клеток СБ71 + и СОЭ5+ как в бронхиальных смывах, так и в СОКБ не наблюдали, а по отношению к группе контроля эти изменения носили недостоверный характер.
Известно, что вид вирусной инфекции играет определенную роль в формировании системных и местных иммунных реакций организма. При антигенном воздействии лимфоциты собственной пластинки слизистой оболочки мигрируют в эпителиальный слой для дальнейшей дифференцировки [9]. По-видимо-му, от спектра и численности субпопуляций иммуноцитов зависит целостность структуры эпителия [7].
В клинических условиях эти закономерности усложняются первичным или вторичным действием антигена на иммунную систему, а кроме того, имеет значение непосредственный цитопатический эффект возбудителя и продуктов его жизнедеятельности [8].
Различные механизмы воздействия вирусов респираторной группы на процессы пролиферации и апоптоза иммунных клеток, по-видимому, обусловлены особенностями строения их ДНК. Так, геном вирусов гриппа А и В и РС-вируса образован одно-нитевой ("минус нитевой") РНК, а аденовируса - однолинейной молекулы двунитчатой ДНК.
РС-вирус обладает цитопатическим действием на культуры клеток. Репродукция РС-вируса, так же как и гриппа А и В, происходит в цитоплазме [4]. Аденовирус обладает цитолитическим действием, так как ^Синтез ДНК происходит в ядре, вирусные белки син-
тезируются на цитоплазматических рибосомах, а структурные компоненты вирионов накапливаются в ядрах зараженных клеток. То есть, весь синтезированный вирус кумулируется в клетках [2, 4].
Каждый из респираторных вирусов оказывает повреждающее действие на разных уровнях слизистой оболочки дыхательных путей, вызывая явления катарального воспаления. Изменения на органном, клеточном и субклеточном уровнях определяют нарушения основных функций эпителия респираторного тракта, количественные и качественные изменения специфической и неспецифической клеточной иммунной защиты. Под влиянием респираторных вирусов внутриклеточные бактерицидные процессы блокируются. Показано, что биологически активные вещества вирусов могут оказывать депрессивное влияние на функцию иммуноцитов, в том числе макрофагов, что влечет за собой размножение патогенных бактерий внутри них, и не происходит уничтожения клетками вирусов [6].
Таким образом, изменение митотического гомеостаза (CD71+ — пул пролиферирующих клеток и CD95+ — маркер, характеризующий готовность иммуноцитов к апоптозу) в остром периоде болезни в различных биологических средах связано с видом вирусного агента. В присутствии аденовируса происходит угнетение пула пролиферирующих клеток (CD71+) в периферической крови и усиление процессов пролиферации и апоптоза в бронхиальных смывах, вируса гриппа А и В — активация пула пролиферирующих клеток (CD71+) в бронхиальных смывах и СОКБ, РС-вируса — активация экспрессии CD95+ на мембране клеток бронхиальных смывов и СОКБ.
Работа выполнена при поддержке Регионального общественного фонда содействия отечественной медицине.
Литература
1. Нестерчук С.Л., Сулейманова Н.С., Ткаченко Э.Р. и др. // Бюл. эксперим. биол. мед. 1994. №1. С. 68-71.
2. Поздеев О.Н. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. 768 с.
3. Стандартизация методов иммунофенотипиро-вания клеток крови и костного мозга человека: Метод. рек. // Медицинская иммунология. 1999. Т1, №5. С. 21-43.
4. Фролов A.B., Шевченко А.Ф., Широбоков В.П. // Практическая вирусология. Киев: Здоровья, 1989. 243 с.
5. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Чернеховс-кая Н.Е. // Пневмония. М.: Экономика и информатика, 2002. 480 с.
6. Anderson R.G.G., Kuo J.F., Norby К. et al. // Virchows Arch. 1974. Vol 37, №3. P. 245-250.
7. Borovskaya T.F., Kurpas E.H., Bachaldin S.L. et al.// International Journal on Immunorehalitation. 2002. Vol. 4, №2. P. 269.
8. Mahbub А., Тоге M„ Andres U. // 10th World Congresses of Gastroenterology. Los Angeles, 1994. P. 98.
9. Taguchi M., Sampath D., Koga T. et al. //J. Exp. Med. 1998. Vol. 187, №12. P. 1927-1940.
□ □□
