CC BY
21
https://doi.org/10.1 7116/molgen201 8360411 99
Маркерная хромосома, несущая гены рРНК, сопряженная с интеллектуальной недостаточностью: клинический случай
А.С. ТЕЛЕПОВАь 2, С.А. РОМАНЕНКО1 2, Н.А. ЛЕМСКАЯ1, Ю.В. МАКСИМОВА3' 4, А.Р. ШОРИНА4, Д.В. ЮДКИН1' 2
]ФГБУН «Институт молекулярной и клеточной биологии» СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; 2ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», 630090, Новосибирск, Россия; 3ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 630091, Новосибирск, Россия; 4ГБУЗ Новосибирской области «Городская клиническая больница №1 », 630047, Новосибирск, Россия
Маркерные хромосомы — это структурно ненормальные хромосомы, которые могут быть как сверхчисленными в карио-типе, так и заменять одну из хромосом. Очень часто маркерные хромосомы являются причиной развития различных патологий, в частности интеллектуальной недостаточности. Данное исследование посвящено молекулярно-цитогенети-ческому анализу акроцентрической маркерной хромосомы пациента с аутизмом и интеллектуальной недостаточностью. С помощью локализации пэйнтинг-проб хромосом человека показано ее происхождение из прицентромерных районов p и q плеч хромосомы 1 5. Для более детального установления района происхождения данной хромосомы была проведена ее микродиссекция с последующей локализацией на метафазных пластинках как здорового контроля, так и пациента. Подтверждено ее происхождение из ядрышконесущей хромосомы 15. В результате локализации плазмиды, несущей рДНК, на хромосомах пациента были выявлены два кластера генов рибосомных РНК. Окрашивание с помощью нитрата серебра показало, что оба кластера являются активными. Рассмотрен возможный вклад выявленной хромосомной патологии в формирование клинической картины.
Ключевые слова: маркерная хромосома, район 15q11—q13, гены рРНК, аутизм, интеллектуальная недостаточность.
Marker chromosome containing genes of rRNA related to intellectual disability: case report
A.S. TELEPOVA1 2, S.A. ROMANENKO1 2, N.A. LEMSKAYA1, YU.V. MAKSIMOVA3 4, A.R. SHORINA4, D.V. YUDKIN1 2
institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS, 630090, Novosibirsk, Russia; 2Novosibirsk State University, 630090, Novosibirsk, Russia; ■'Novosibirsk State Medical University, 630091, Novosibirsk, Russia; 4Novosibirsk City Clinical Hospital No. 1, 630047, Novosibirsk, Russia
Marker chromosomes are structurally abnormal chromosomes. It can be super numeral or replace one of the normal chromosomes. Frequently marker chromosomes can be a reason for different abnormalities including intellectual disability. This study is due to molecular cytogenetic of marker chromosome in patient with autism and intellectual disability. Localization of human chromosomes painting probes revealed marker chromosome is derivate from centromeric regions of p- and q-arms of chromosome 1 5. For accurate study of origination of marker chromosome we have done microdissection of it followed by localization on chromosomes of healthy control and patient. Origination of marker chromosome from chromosome 15 is confirmed. Chromosome 1 5 is NOR-containing. We localized plasmid containing rDNA on patient chromosomes and detected two clusters if rRNA genes. Ag-NOR-staining revealed both clusters are active. Phenotype forming is discussed.
Keywords: arker chromosome, region 15q11 —q 13, rRNA genes, autism, intellectual disability.
Введение
Малые сверхчисленные маркерные хромосомы — это структурно ненормальные хромосомы, которые могут быть как дополнительными по отношению к нормальному карио-типу, так и заменяющими какую-либо хромосому. Их размер, как правило, меньше, чем размер хромосомы 20 на этой же метафазной пластинке [1]. В 86% случаев малые сверхчисленные маркерные хромосомы происходят из акроцен-трических хромосом, в частности 75% происходят из хромосомы 15 [2]. Район 15q11—q13 известен своей нестабильностью и частыми перестройками. В результате появляются
© Коллектив авторов, 201 8
малые сверхчисленные маркерные хромосомы благодаря инверсии и дупликации проксимального конца хромосомы 15. Это приводит к тетрасомии 15p и частичной тетрасомии 15^ Клинические проявления у таких пациентов выражаются ранней центральной гипотонией, задержкой развития и интеллектуальной недостаточностью умеренной степени, эпилепсией и аутизмом. Описаны два типа маркерных хромосом, относящихся к ^ dup (15) с различными фенотипиче-
Для корреспонденции: Юдкин Дмитрии Владимирович — канд. биол. наук, заведующий сектором хромосомных патологий ИМ КБ СО РАН, e-mail: dim@mcb.nsc.ru
For correspondence: Dmitry V. Yudkin. PhD (biology), head of group of chromosome pathology IMCB SB RAS, e-mail: dim@mcb.nsc.ru
скими признаками. Первый тип — метацентрическая или субметацентрическая гетерохроматиновая хромосома, у носителей которой в фенотипе не проявляются синдромы Пра-дера—Вилли/Ангельмана (критический район 15q11). Второй тип включает проявления синдрома Прадера—Вилли/ Ангельмана, а маркерная хромосома содержит эухромати-новый участок (критический район 15q12 или 15q13). Большинство изодицентрических хромосом 15q12 или 15q13 возникает из двух гомологичных материнских хромосом во время мейоза, и их частота образования коррелирует с возрастом матери при беременности [2].
Материал и методы
Этика. Пациент вовлечен в исследование строго в соответствии с международными стандартами, которые включают в себя осведомленность об исследовании, согласие на участие в исследовании и гарантии конфиденциальности. Все исследования соответствовали этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации с поправками, внесенными в 2000 г.
Описание клинического случая. Пробанд — пациент мужского пола, возраст 6 лет. Во время беременности у его матери развилась преэклампсия, были угрозы прерывания. При рождении оценка по шкале Апгар 7/8 баллов, показана задержка внутриутробного развития по гипопластиче-скому типу. Выявлена задержка психомоторного развития: удержание головы с 7 мес, научился сидеть к 1-му году жизни, в 2 года мог ходить с посторонней поддержкой. На момент обследования пациент использует в речи 5—6 простых слов, на обращенную речь не реагирует, навыков самообслуживания нет. Визуально отмечаются малые аномалии развития: макроцефалия с умеренно выражен-
ной акроцефалией, высокий лоб, гипертелоризм, эпикант, широкое уплощенное переносье, маленький короткий нос, «рот карпа», расщелина мягкого неба, низкое расположение ушных раковин, макротия, сходящееся косоглазие, клинодактилия V пальцев кистей, конусовидная деформация концевых фаланг кистей. Нижние конечности с валь-гусной деформацией, частичная кожная синдактилия II-III пальцев стоп. Со стороны половой системы отмечены двусторонний крипторхизм, паховая ретенция. По результатам ЭхоКГ отмечены малые сердечные аномалии: добавочная хорда левого желудочка, открытое овальное окно.
Получение суспензий клеток и GTG-окрашивание хромосом. Препараты метафазных хромосом были получены из кратковременных культур В-лимфоцитов венозной крови по стандартному протоколу [3]. GTG-окрашивание проводилось соответственно ранее описанной методике [3]. Ме-тафазные пластинки анализировали с помощью микроскопа Olympus BX 53 и программного обеспечения ВидеоТест Карио 3.1 («iMicroTec», Россия).
Микродиссекция метафазных хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ. Маркерные хромосомы были диссекти-рованы по описанной ранее методике [4] с использованием микроскопа Olympus IX 51 и микроманипулятора Eppendorf Transferman NK2. ДНК диссектированных хромосом была амплифицирована с помощью набора для полногеномной амплификации GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit («Sigma-Aldrich», США). Полученные зонды метили дигоксигенином. Каждая библиотека была получена из одной копии маркерной хромосомы.
Для локализации генов рРНК использовали плазмиду pHr13, несущую гены 18S, 28S и 5,8S рРНК [5], которую амплифицировали и метили с помощью набора для полногеномной амплификации WGA («Sigma-Aldrich») как описано выше.
Рис. 1. GTG-окрашенный кариотип пробанда.
mar — маркерная хромосома.
Рис. 2. Результаты флуоресцентной гибридизации in situ.
а — локализация библиотеки хромосомы 15 на метафазных хромосомах пробанда; б — локализация библиотеки диссектированной маркерной хромосомы на метафазных хромосомах здорового контроля; в — локализация библиотеки диссектированной маркерной хромосомы на метафазных хромосомах пробанда; г — локализация генов рРНК на метафазных хромосомах пробанда. На рис. а, в, г стрелкой указана маркерная хромосома.
Флуоресцентную гибридизацию in situ всех использованных в исследовании зондов проводили по ранее описанной методике [4]. Метафазные пластинки анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX 53 и программного обеспечения ВидеоТест FISH 2.0 («iMi-croTec», Россия).
Результаты и обсуждение
Анализ кариотипа пробанда (рис. 1) показал наличие маркерной хромосомы в 100% метафазных пластинок (n=74). Анализ кариотипов родителей показал отсутствие хромосомных патологий. Маркерная хромосома пациента представляет собой акроцентрическую хромосому, размером сопоставимую с хромосомой 20. Для установления происхождения маркерной хромосомы мы локализовали библиотеку сортированных хромосом человека на метафазных пластинках пациента. На маркерной хромосоме локализовалась библиотека хромосомы 15 (рис. 2, а), при этом метилась проксимальная часть р-плеча. Для визуализации границ перестройки необходимо было провести реципрокный
пэйнтинг. Для этого была выполнена микродиссекция маркерной хромосомы с последующей локализацией полученной библиотеки на метафазных пластинках пациента и здорового контроля. Всего было получено 3 библиотеки из индивидуальных маркерных хромосом. Локализация всех полученных библиотек на метафазных пластинках здорового контроля показала их гомологию с прицентромерными районами хромосомы 15 (см. рис. 2, б), а на хромосомах пациента — также с дистальным и проксимальным концами маркерной хромосомы (см. рис. 2, в). Хромосома 15 содержит ядрышкообразующие районы, которые показали гомологию участкам маркерной хромосомы. В связи с этим было принято решение локализовать гены рРНК на метафазных пластинках пациента. Результат локализации показал наличие двух кластеров генов рРНК на проксимальном и дистальном концах маркерной хромосомы (см. рис. 2, г).
Для оценки активности кластеров рДНК на маркерной хромосоме проведенно окрашивание хромосом пробанда с помощью нитрата серебра. В результате показано, что оба кластера рДНК на маркерной хромосоме являются активными (рис. 3).
Рис. 3. Окрашивание активных ядрышкообразующих районов на метафазных хромосомах пробанда.
Стрелкой указана маркерная хромосома.
Описанная перестройка затрагивает район 15q11—q13, известный своей нестабильностью. В нем часто формируются точки разрыва с последующим формированием маркерных хромосом, что приводит к тетрасомии 15p и частично 15q. Клиническая и цитогенетическая картина, характерная для этого пациента, соответствует синдрому дупликации 15q11—q13, который зачастую сопровождается синдромами Прадера—Вилли или Ангельмана, так как затронут критический район для этих синдромов [6—9]. Особо следует отметить увеличение копийности генов рРНК, при котором на маркерной хромосоме экспрессируются дополнительные копии, что также может вносить вклад в развитие клинической картины. Ранее показано, что правильная сборка рибосом очень важна для дифференцировки нервных клеток, в частности для формирования дендритов [10], при этом нарушения синтеза рРНК приводили к развитию нейродеге-нерации у мышей [11]. Таким образом, данная перестройка приводит не только к дупликации критического района 15q11—q13, но и к появлению двух дополнительных районов ядрышкового организатора, нарушению количества рДНК и соответственно рРНК, что вносит свой вклад в формирование патологического фенотипа.
Благодарность. Авторы выражают благодарность М. Фергюсон-Смиту (Кембриджский университет, Великобритания) за предоставленные библиотеки хромосом человека.
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, грант 15-15-10001.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Liehr T, Cirkovic S, Lalic T, Guc-Scekic M, de Almeida C, Weimer J, et al. Complex small supernumerary marker chromosomes — an update. Molecular Cytogenetic. 2013;6:46. https://orcid.org/10.1186/1755-8166-6-46
2. Jafari-Ghahfarokhi H, Moradi-Chaleshtori M, Liehr T, Hashemza-deh-Chaleshtori M, Teimori H, Ghasemi-Dehkordi P. Small supernumerary marker chromosomes and their correlation with specific syndromes. Advanced Biomedical Research. 2015;4:140. https://orcid.org/10.4103/2277-9175.161542
3. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Новосибирск: Наука; 1988. [Grafodatsky AS, Radzhabli SI. Chromosomes of agricultural and laboratory mammals. Novosibirsk: Nauka; 1988. (In Russ.)].
4. Liehr T, ed. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) — Application Guide. 2nd Ed. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag; 2017.
5. Maden BEH, Dent CL, Farrell TE, Garde J, McCallum FS, Wakeman JA. Clones of human ribosomal DNA containing the complete 18 S-rRNA and 28 S-rRNA genes. Biochem J. 1987;246:519-527.
6. Bundey S, Hardy C, Vickers S, Kilpatrick MW, Corbett JA. Duplication of the 15q 11-13 region in a patient with autism, epilepsy and ataxia. Dev Med Child Neurol. 1994;36:736-742.
7. Yang J, Yang Y, Huang Y, Hu Y, Chen X, Sun H, et al. A study of two Chinese patients with tetrasomy and pentasomy 15q11q13 including Prader— Willi/Angelman syndrome critical region present with developmental delays and mental impairment. BMC Med Genet. 2013; 14:9. https://orcid.org/10.1186/1471-2350-14-9
8. Battaglia A. The inv dup (15) or idic (15) syndrome (Tetrasomy 15q). Or-phanet Journal of Rare Diseases. 2008;3:30. https://orcid.org/10.1186/1750-1172-3-30
9. Dittrich B, Buiting K, Korn B, Rickard S, Buxton J, Saitoh S, et al. Imprint swithing on human chromosome 15 may involve alternative transcripts of the SNRPN gene. Nat Genet. 1996;14(2):163-170.
10. Slomnicky LP, Pietrzak M, Vashishta A, Jones J, Lynch N, Elliot S, et al. Requirement of neuronal ribosome synthesis for growth and maintenance of the dendritic tree. J Biol Chem. 2016;291(11):5721-5739.
11. Parlato R, Kreiner G, Erdmann G, Rieker C, Stotz S, Savenkova E, et al. Activation of an endogenous suicide response after perturbation of rRNA synthesis leads to neurodegeneration in mice. J Neurosci. 2008;28(48):12759-12764.
Поступила в редакцию 07.09.17 После доработки 07.09.17 Принята к публикации 18.05.18
Сведения об авторах:
Телепова Алена Сергеевна (Alena S. Telepova) — старший лаборант, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия
Романенко Светлана Анатольевна (Svetlana A. Romanenko) — к.биол.н., старший научный сотрудник, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия
Лемская Наталья Анатольевна (Natalya A. Lemskaya) — к.биол.н., научный сотрудник, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия
Максимова Юлия Владимировна (Yulia V. Maksimova) — д.м.н., проф., заведующая кафедрой медицинской генетики, Новосибирский государственный медицинский университет, 630091, Новосибирск, Россия
Шорина Асия Ринатовна (Asia R. Shorina) — врач-генетик, Новосибирская городская клиническая больница № 1, 630047, Новосибирск, Россия
Юдкин Дмитрий Владимирович (Dmitry V. Yudkin) — к.биол.н., заведующий сектором хромосомных патологий, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: dim@mcb.nsc.ru
