CC BY
7МАХДЛЛИЙ BACILLUS THURINGIENSIS БАКТЕРИЯ ШТАММЛАРИНИНГ ИНСЕКТОАКАРИЦИД ФАОЛЛИГИ ВА УЛАРНИНГ ГЕНЕТИК ХУСУСИЯТЛАРИ
Халилов Илхом
УзРФА Микробиология институти, Тошкент, Узбекистан. https://doi.org/10.5281/zenodo.8367842
Аннотация. Урганилаган B. thuringiensis махаллий штаммларини барчаси гуза ширасига царши 69,3% дан 91,5% гача инсектицид фаолликни курсатди ва энг фаол B.thuringiensis 1 штамми эканлиги цайд этилди. Ургимчакканага нисбатан B.thuringiensis 1 (82,1%) ваB. thuringiensis 1 фо (87,2%) штаммлари энг юцори акарицид фаолликни намоён этган булса, B. Thuringiensis 93 штамми эса ургимчакканага умуман таъсир цилмаслиги кузатилди. Урганилган штаммларда cry1Aa-I гени йуцлиги ПЗР тахлилида аницланди. Тангачацанотли уашаротларга таъсир цилувчи cry1Ab, cry9U-I ва сгу1Ас-1 генлари цупчилик штаммларда учраши урганилди. Лекин cry2 ва vip2 гени фацат B. thuringiensis 31 штаммида борлиги детекция цилинди. Урганилган фаол инсектоакарицид штаммлар эса цишлоц хужалиги амалиёти учун цуллаш мумкин булган биоинсектицид препаратлар олиш учун истицболли манба булса, аницланган cry- ва vip-генлари эса келажакда трансген микроорганизм ва усимликларни олиш учун асос булади.
Калит сузлар: F^за шираси, ургимчаккана, B. thuringiensis, Aphis gossypii, озица мууити, энтомоцид фаоллик, cry-гени, vip-гени.
Аннотация. Все изученные местные штаммы B. thuringiensis проявили инсектицидную активность в отношении хлопковой тли от 69,3% до 91,5%, при этом наиболее активным был отмечен штамм B. Thuringiensis 1. Установлено, что штаммы B. thuringiensis 1 (82,1%) и B. thuringiensis 1 fo (87,2%) проявляют наибольшую акарицидную активность в отношении паутинного клеща, тогда как штамм B. thuringiensis 93 не оказывает влияния на паутинного клеща. Методом ПЦР-анализа определяли отсутствие сТуy1Aa-I гена у изучаемых штаммов. Гены сгу1АЬ, ст^y9U-I и сгу1Ас-1, влияющие на перепончатокрылатые, обнаружены у большинства штаммов. Однако сгу2 и vip2 гены были обнаружены только у штамма B. Thuringiensis 31. Изученные активные инсектокарицидные штаммы являются перспективным источником для получения биоинсектицидных препаратов, которые могут быть использованы в сельскохозяйственной практике, а выявленные сгу - и vip-гены станут основой для получения в будущем трансгенных микроорганизмов и растений.
Ключевые слова: Хлопковая тля, паутынный клещ, B. thuringiensis, Aphis gossypii, питательная среда, энтомоцидная активность, cry-гены, vip-гены.
Abstract. All studied local strains of B. thuringiensis showed 69.3% to 91.5% insecticidal activity against cotton aphids, and the most active B. thuringiensis strain 1 was noted. B. thuringiensis 1 (82.1%) andB. thuringiensis 1 fo (87.2%) strains showed the highest acaricidal activity against spider mites, while B. thuringiensis 93 strain did not affect spider mites at all. The absence of the cry1Aa-I gene in the studied strains was determined by PCR analysis. Cry1Ab, cry9U-I, and sry1Ac-I genes, which affect mite insects, were found to be found in most strains. However, the presence of cry2 and vip2 genes was detected only in B. thuringiensis 31 strains. The studied active insectocaricidal strains are a promising source for obtaining bioinsecticidal drugs that can be used for agricultural practice, and the identified cry- and VIP-genes will be the basis for obtaining transgenic microorganisms and plants in the future.
1816
Keywords: Cotton aphid, spider mite, B. thuringiensis, Aphis gossypii, nutrient medium, insecticidal activity, cry-genes, vip-genes.
Экинлардан юкори ва сифатли хосил олиш учун замонавий агротехника усулларини куллаш билан бирга касаллик ва зараркунанда хашаротларга карши курашиш мухим омиллардан бири хисобланади. Х,озиргача дунёнинг купчилик давлатларида зараркунанда хашаротларга карши асосан кимёвий усуллардан фойдаланилади. Кимёвий усулларга мукобил равишда зарарли хашаротларга карши экологик тоза Bacillus thuringiensis бактерияси асосида тайёрланган биопрепаратлар купгина ривожланган мамлакатларда куллаб келинмокда. Бу бактериялар асосида тайёрланган биопрепаратлар экологияга хамда фойдали хашаротларга зарарли таъсир килмайди. Шунингдек, бундай турдаги биоинсектицид препаратларнинг тан нархи кимёвий препаратларга караганда анча арзондир.
Bacillus thuringiensis (Bt) - грамммусбат, таёкчасимон, спора хосил килувчи тупрок бактерияси хисобланиб, у ер юзининг турли хил экологик тизимларида, жумладан, тупрокда, сувда, нобуд булган хашаротларда, япрок баргли дарахтларнинг баргида, баъзи усимликларнинг ички тукималарида (эндофит) ва сут таркибида учраши кайд килинган [1]. B. thuringiensis бактериялари жуда кенг спектрли инсектицидли оксиллар ишлаб чикариб, хашаротларнинг хар хил туркумига кирувчи личинкаларга карши фаол таъсир этади, баъзида эса бошка типдаги хашаротларга таъсир этиши хам кузатилгандир. B. thuringiensis гурухига мансуб штаммлар усиш ва ривожланиш даврида оксил таркибли кристал (Cry) токсинлар, баъзи штаммлар эса цитолитик (Cyt) токсинлар, а-Р-у экзотоксинлар хдмда Vip токсинлар ишлаб чикариши аникланган. Бу эса уз навбатида ушбу бактериялар асосида тайёрланган махсулотлар бугунги кунда дунёда энг куп сотиладиган биологик инсектицидга айланишини изохлайди [2], чунончи, инсектицидли оксилларни кодловчи генларнинг булиши ва уларни куллаш туфайли янги турдаги трансген усимликлар яратиш имкони очилмокда [3].
Ушбу тадкикот ишидан максад институт коллекциясида мавжуд булган B. thuringiensis бактерия махаллий штаммларини гуза ширасига (Aphis gossypii) ва гуза ургимчакканасига (Tetranychus turkestani Ug. et Nik.) карши инсектоакарицид фаоллигини скрининг килиш ва айрим токсик генларини тадкик этишдан иборатдир.
Тадкикот объекти сифатида B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1 фо, B. thuringiensis 18фо, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84, B. thuringiensis 93 ва B. thuringiensis 94 штаммлари кулланилди. Штаммларнинг патогенлик фаоллигини Муратов В.С. [4] ва Сикура А.И., [5] усулидан фойдаланган холда аникланди. Стандарт биоинсектицид препарат сифатида Россияда ишлаб чикариладиган Биослип-Bt биоинсектицид препарати кулланилди. B. thuringiensis бактериялари стандарт пептон озука мухит устирилди (%): Пептон-1,0; глюкоза- 0,6; NaCl-0,5; К2НР04-0,05; MgS04-0,02, (pH-7,0). Культуралар 150 айланма/дакика тезликдаги тебратгичда, 29-31°С хароратда ва 3 сутка давомида устирилди. B. thuringiensis 7 та штаммларидан геном ДНК си модификацияланган Мармур усули ёрдамида ажратилди [6]. Бактерия штаммларидан ажратилган ДНК намуналари ПЗР-амплификацияси GenPak® PCR MasterMix китида амалга оширилди. Бунда, реакция умумий 20 мкл микдорида тайёрланиб, 10 мкл Dilution, 8,2 мкл икки марта дистилланган сув, 0,4 мклдан (27F ва 1492R) праймер ва 1 мкл ДНК намуналаридан таркиб топди. ПЗР
1817
амплификация оптимизацияси бошлангич денатурация 94°C да 3 дакика, денатурация 94°C да 40 секунд, оджиг (primer annealing) 55°C да 40 секунд, элонгация 70 °C да 90 секунд, якуний элонгация 70 °C да 7 дакика, +4 oC да ю, давомида такрорий 35 циклда олиб борилди. Ампликонлар этидиум бромид билан буялган 2 % ли агарозали гелда электрофорез ёрдамида детексия килинди.
Гуза ширасига карши инсектицид фаолликни аниклаш учун Bacillus thuringiensis бактериясининг B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1 фо, B. thuringiensis 18фо, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84, B. thuringiensis 93 ва B. thuringiensis 94 штаммлари урганилди. Аввалги бажарилган тадкикот ишимизда, B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1фо, B. thuringiensis 18фо, B. thuringiensis 31 штаммларининг мум куясига карши турли хил инсектицид фаолликни курсатган ва иссикка чидамли Р-экзотоксин хосил килиши кайд этилган эди [7]. Адабиётлардан маълумки, Р-экзотоксин синтезловчи B. thuringiensis бактерия штаммларининг гуза ширасига карши фаолликка эга булиши тадкик этилган [8]. Шунингдек, биз томондан кулланилган Р-экзотоксин синтезловчи B. thuringiensis бактерия штаммлари хам турли даражада инсектицид фаолликни номоён этган. Бундан ташкари, ушбу штаммлар хам Р-экзотоксин синтезлаши билан бирга кристалли 5-эндотоксин хосил килиши аниклангандир (1 -расм).
спора кристалный токсин крнстапнын токсин спора
1-расм. В. thuringiensis 18фо (А) ва В. thuringiensis 1 (Б) бактерия штаммларининг микроскопик куриниши (1000 марта катталаштирилган).
Тажрибада кулланилган В. thuringiensis 84 штамми уртача даражада Р-экзотоксин фаолликка эга булган булса, В. thuringiensis 93 ва В. thuringiensis 94 штаммлари Р-экзотоксин синтез килиши кузатилмаган, лекин 5-эндотоксин фаолликка эга эканлиги асал мум куртида урганилган.
2-расмдан куриниб турибдики, В. thuringiensis 1 ва В. thuringiensis 18 фо штаммлари 14-кунлик тажриба давомида Биослип-В (83,7%) препаратидан хам юкори инсектицид фаолликни намоён этди ва мос равишда 91,5% ва 88,7% хашаротларни нобуд килиши аникланди (2-расм). В. thuringiensis1фо (83,4%) ва В. thuringiensis 31 (82,3%) инсектицид фаоллиги эса Биослип-В препарати билан тенглиги кузатилди. В. thuringiensis 84, В. thuringiensis 93 ва В. thuringiensis 94 штаммлари эса урта инсектицид фаолликни намоён этиб, мос равишда 77,6%, 69,3% ва 79,2% хашаротларни нобуд килганлиги аникланди.
Шуни таъкидлаш мухимки, ушбу урганилган штаммларнинг энг юкори инсектицид фаолликни намоён этиш вакти 7 - ва 10 - кунлар булиб, бунда жами хисобланган инсектицид фаолликнинг 60% шу кунларда кайд этилган.
А
Б
1818
Адабиётлардан маълумки, B. thuringiensis штаммлари нафакат инсектицид балки акарицид фаоликни х,ам намоён этади [9]. Бактерияларни бундай кенг камровли биоконтроль агент булиши улар таркибидаги турли структурага эга токсинларнинг булишига богликдир.
2-расм. Bacillus thuringiensis бактерия штаммларини гуза ширасига карши инсектицид фаоллиги.
Юкорида келтирилган B. thuringiensis бактериясини B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1 фо, B. thuringiensis 18фо, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84, B. thuringiensis 93 ва B. thuringiensis 94 штаммларини акарицидлик фаоллигини аниклаш учун гуза ургимчакканасига (Tetranychus turkestani Ug. et Nik.) карши фаоллиги скрининг килинди (3-расм).
3-расм. Bacillus thuringiensis бактерия штаммларини ургимчакканага карши акарицид фаоллиги.
3-расмдан куриниб турибдики, B. thuringiensis бактериясининг инсектицид фаоллиги акарицид фаоллигидан баъзи штаммларда фарк килиши кузатилди. Жумладан, 14 кун давомида олинган натижалар шуни курсатдики, B.thuringiensis 1 (82,1%) ва B. thuringiensis 1 фо (87,2%) штаммларнинг акарицид фаоллиги инсектицид фаоллигига ухшаш булсада, лекин стандарт биоинсектицид препарати Биослип-Bt дан (58,4%) акарицид хусусияти юкори эканлиги кузатилди. B.thuringiensis 18фо штамми эса Биослип-Bt га ухшаш уртача акарицидликни намоён этди. B.thuringiensis 31 ва B.thuringiensis 84 штаммлар паст
1819
фаолликни курсатиб, мос равишда 34,2% ва 35,6% ургимчакканани нобуд килиши тадкик этилди. Шуни айтиш лозимки, 14 кун давомида B. thuringiensis 93 штаммида умуман акарицид фаоллик аникланмади.
B.thuringiensis штаммларини токсиклик хусусиятини билдирувчи cry ва vip-генларини аниклаш учун ПЗР тахлили амалга оширилди. 1-жадвалдан куринадики, cry-генларини амплификация килиш учун cry1Aa-I, cry1Ab, cry9U-I, cry2 ва сгу1Ас-1 ген праймерларидан фойдаландик. Бунда, cry1Aa-I гени урганилган бирорта B.thuringiensis штаммларида аникланмади. crylAb гени B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1 фо, B. thuringiensis 18фо, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 93 ва B. thuringiensis 94 штаммларда борлиги кузатилди, лекин B. thuringiensis 84 штаммида кайд этилмади.
1-жадвал.
B.thuringiensis штаммларининг cry ва vip-генларининг ПЦР тахлили
Т/р Bt ^улланилган праймерлар ёрдамида cry генларининг
штаммлари мавжудлиги
cry1Aa-I cry1Ab cry9U-I cry2 cry1Ac-I vip-1 vip-2 vip-3
1 Bt 1 - + + - + - - -
2 Bt 1фо - + + - + - - -
3 Bt 18фо - + + - - - - -
4 Bt 31 - + - + - - + -
5 Bt 84 - - + - + - - -
6 Bt 93 - + + - - - - -
7 Bt 94 - + + - - - - -
Примечание: - cry генлар мавжуд эмас, + cry генлари мавжуд
Шунга ухшаш cry9U-I гени B. thuringiensis 31 штаммидан бошка барча штаммларда борлиги аникланди. cry2 узига ген булиб, у хам иккиканотли ва каттикканотли хашаротларга таъсир килади. cry2 гени факатгина B. thuringiensis 31 штаммида борлиги ПЗР ёрдамида тахлил килинди. cry1Ac-I гени факатгина B.thuringiensis 1, B. thuringiensis 1 фо, B. thuringiensis 84 штаммларида амплификация булганлиги кайд этилди. 3 та гурух vip-генларини аниклаш шуни курсатдики, факатгина vip-2 гурухи генлари B. thuringiensis 31 штаммида локализация булиши кузатилди.
Шундай килиб, урганилган B.thuringiensis штаммларининг купчилиги гуза шираси юкори инсектицид фаолликни курсатди, лекин бу штаммлар ургимчакканага нисбатан факат баъзиларигина акарицид фаолликни намоён этиши кузатилди. B.thuringiensis штаммлари генетик жихатдан ухшаш ва фарк томонлари булиб, кейинчалик бу генларни трансген бактерия ва усимликлар олишда куллаш мумкин. Шунингдек, урганилган фаол инсектоакарицид штаммлар эса кишлок хужалиги амалиёти учун куллаш мумкин булган биоинсектицид препаратлар олиш учун истикболли манба хисобланади.
REFERENCES
1. Roh, J.Y.; Choi, J.Y.; Li, M.S.; Jin, B.R.; Je, Y.H. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J. Mol. Biol. 2007, 17, 547-559.
2. Schnepf, E.; Crickmore, N.; van Rie, J.; Lereclus, D.; Baum, J.; Feitelson, J.; Zeigler, D.R.; Dean, D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998, 62, 775-806.
1820
3. Sanchis, V. From microbial sprays to insect-resistant transgenic plants: History of the biospesticide Bacillus thuringiensis. A review. Agron. Sustain. Dev. 2011, 31, 217-231.
4. Муратов В.С., Бондаренко Т.Ф., Ириков В.А. и. др. Метод определения качества препаратов, полученных на основе бактерий группы Bacillus thuringiensis. //Биотехнология, 1990. Масква. С. 67-68.
5. Сикура А.И., Сикура Л.В. Энтомопатогены - грибы, бактерии, простейшие, нематоды// Колорадский картофелный жук. М.: Наука, 1981.- С.12.
6. 6. Sa^-Serra F. , Svensson-Stadler L. , Busquets A., Jaйn-Luchoro D., Karlsson R., Moore E. R. B., Gomila M. Culture Collection University of Gothenburg (CCUG). A protocol for extraction and purification of high-quality and quantity bacterial DNA applicable for genome sequencing: a modified version of the Marmur procedure. Method in Protocol Exchange. 2018. DOI: 10.1038/protex.2018.084.
7. Кадырова Г.Х., Шакиров З.С., Халилов И.М. Скрининг местных штаммов энтомопатогенных бактерий группы Bacillus thuringiensis по способности к синтезу Р-экзотоксина// ДАН. 2010. №4. С. 85-89.
8. Monnerat, R. G., Melatti, V., Praça, L., Martins, Érica, Sujii, E., & Berry, C. Selection of Bacillus thuringiensis Strains Toxic Against Cotton Aphid, Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae). 2010. BioAssay, 5:2. P.1-4.
9. Zenkova A.A., Grizanova E. V., Andreeva I. V., Gerne D.Y., Shatalova E,I., Cvetcova V. P., Dubovskiy I. M.Effect of fungus Lecanicillium lecanii and bacteria Bacillus thuringiensis, Streptomyces avermitilis on two-spotted spider mite Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) and predatory mite Phytoseiulus persimilis (Acari: Phytoseiidae)// Journal of Plant Protection Research 2020;60(4):415-419.
1821
