CC BY
33
ХИМИЯ
УДК 543.426
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ДОКСИЦИКЛИНА В ПРИСУТСТВИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИОНАМИ ЕВРОПИЯ
Т. Д. Смирнова, Е. А. Желобицкая, Т. Г. Данилина
Смирнова Татьяна Дмитриевна, профессор кафедры аналитической химии и химической экологии Института химии, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, доктор химических наук. E-mail: smirnovatd@ mail.ru
Желобицкая Елена Александровна, аспирант кафедры аналитической химии и химической экологии Института химии, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г Чернышевского. E-mail: [email protected]
Данилина Татьяна Григорьевна, аспирант кафедры аналитической химии и химической экологии Института химии, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского. E-mail: [email protected]
В настоящей работе рассмотрено влияние наночастиц серебра на флуоресцентные свойства доксициклина (ДЦ) и его комплекса с европием. Полученные наночастицы имеют сферическую форму, узкий диапазон распределения по размерам со средним диаметром 20 ± 1.5 нм, Z-потенциал - 30 мВ. Стабильность характеристик сохраняется в течение 14 суток. С целью сокращения расстояния между металлической поверхностью и молекулой ДЦ наночастицы серебра модифицированы ионами европия. Ранее нами показано, что ДЦ образует хелат с ионами европия, который характеризуется переносом энергии возбуждения. Особенностью комплексообразования является появление в спектре флуоресценции ДЦ новой полосы, характерной для эмиссии иона европия (^фл= 615 нм). Нами установлено, что Z-потенциал модифицированных наночастиц зависит от концентрации ионов европия в растворе. В присутствии ионов европия Z-потенциал наночастиц возрастает от -30 мВ до нулевого значения (4-10-4М) и в условиях дальнейшего роста концентрации ионов металла (до 1.25-10-3М) значение потенциала возрастает (+85 мВ), что обусловливает высокую стабильность коллоидной системы. Нами установлено, что сигнал сенсибилизированной флуоресценции в присутствии модифицированных нано-частиц зависит от кислотности среды и концентрации серебряных наночастиц. Найдены оптимальные условия получения максимального аналитического сигнала. На основании проведенных исследований разработана флуориметрическая методика определения ДЦ в лекарственном препарате «Доксициклин», ООО «Озон». Ключевые слова: доксициклин, люминесценция, европий, наночастицы серебра.
DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-370-375
Флуоресцентная спектроскопия является рутинным инструментом исследования клеточной и молекулярной визуализации, проточной цитометрии, медицинской диагностики, судебно-медицинской экспертизы, генетического анализа, а также аналитическим методом благодаря высокой чувствительности, низкой стоимости, простоте использования. Однако большинство доступных органических красителей, используемых для получения оптического сигнала, имеют ряд важных ограничений, таких как гидрофобность, низкий квантовый выход и невысокая фотостабильность. Дальнейшее развитие люминесцентного метода, связанное с совершенствованием
существующих флуорофоров, не всегда эффективно, поэтому в последние годы исследователи обращаются к применению различных наномате-риалов, которые используются в качестве нано-реакторов или участников пары донор-акцептор энергии электронного возбуждения.
Особый интерес представляют металлические наночастицы, которые могут увеличить или уменьшить время жизни флуоресценции флуорофоров, повысить эффективность резонансного переноса энергии в системе донор - акцептор в результате взаимодействия возбужденного состояния флуо-рофора со свободными электронами наночастиц металла. Согласно теории электронного газа электроны внешних валентных оболочек металла свободно перемещаются внутри металлической частицы, обусловливая высокую электропроводность. Под действием переменного электрического поля светового луча подвижные электроны смещаются. Если размер частицы много меньше длины волны падающего света, то перемещение электронов способствует возникновению диполя. В случае совпадения частоты колебаний падающего света с собственной частотой колебаний электронов проводимости наночастиц наблюдается явление поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Колеблющийся диполь вблизи поверхности частицы называют поверхностным плазмоном. Возникающие заряды вблизи поверхности наноча-стицы вызывают поляризацию молекул окружения частиц металла. Такие эффекты выражены сильнее при возрастании способности к поляризации адсорбированных молекул и диэлектрической проницаемости окружающей среды.
В настоящей работе рассмотрено влияние наночастиц серебра на флуоресцентные свойства доксициклина и его комплекса с европием.
Широкое использование антибиотиков те-трациклинового ряда в клинике и ветеринарии вызывает опасность в превышении их остаточных концентраций предельно допустимых значений в пищевых продуктах и объектах окружающей среды. Совершенствование известных флуориметрических способов определения те-трациклинов с использованием наночастиц серебра является задачей настоящего исследования.
Материалы и методы
Реактивы. Доксициклин фирмы «Sigma», содержание основного вещества не менее 98%. Исходный раствор с концентрацией 1.0-10-2М готовили растворением точной навески в 0.1 М НС1; кислота уксусная, ГОСТ 61-75, х.ч.; аммиак водный, ГОСТ 3760-79, ч.д.а.; вода бидистилли-рованная ГОСТ 6709-72; серебро азотнокислое
99,9% ч.д.а. «РеаХим»; натрий лимоннокислый трехзамещенный 5,5-водный, ч.д.а., «РеаХим»; боргидрид натрия, х.ч., «РеаХим»; нитратевро-пия (III) шестиводный, 99.9% , «АагаОщап^».
Аппаратура и техника измерений. Спектры флуоресценции регистрировали на спек-трофлуориметре СагуЕсНр8е «А§Иеп1ТесЬпо1о §1е8»(Австралия) с источником возбуждения -импульсной ксеноновой лампой. Ширина щели возбуждения - 10 нм, флуоресценции - 20 нм. Скорость регистрации спектров - 300 нм/мин. Измерения проводили в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. Сигнал регистрировали под углом 90°С к возбуждающему свету. Оптическую плотность растворов в видимой и УФ-области спектра измеряли на спектрофотометре ИУ-1800 «Shimadzu» (Япония) на кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см, «Shimadzu». Значение рН контролировали на рН-метре (рН-673 М) со стеклянным индикаторным электродом и хлоридсеребряным электродом сравнения. Электронные аналитические весы НЯ-200 фирмы «А&Бсотрапу», Япония. Измерение размера и ^-потенциала наночастиц серебра проводили с помощью «ZetasizerNanoZS», Великобритания.
Наночастицы серебра синтезировали по методике [1]: смешивали 1 мл раствора AgN0з (10 мМ), 1 мл цитрат-иона (500 мМ) и 47 мл бидистиллированной воды в течение 10 мин при комнатной температуре, добавляли 600 мкл №БН4 (10 мМ). Реакция восстановления продолжалась 30 мин, оставляли в холодильнике на 10-12 часов для завершения роста наночастиц. Концентрацию наночастиц рассчитывали согласно закону Бугера - Ламберта - Бера, где е равно 2,87-1010 М-1 см-1 [2].
Результаты и их обсуждение
Свойства наночастиц серебра. Полученные наночастицы серебра (AgNPs) стабилизированы цитрат-ионом. Известно, что на положение полосы ППР наночастиц влияют характеристики индивидуальных частиц и диэлектрические свойства окружающей среды [3]. Нами установлена корреляция результатов структурно-фазовых и оптических исследований образцов полученных коллоидных растворов серебра. Так, в спектрах поглощения (рис. 1) синтезированных наноча-стиц присутствует ярко выраженная резонансная полоса ППР. Сравнительный анализ результатов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и оптической спектроскопии коллоидных растворов позволяет отметить период активного формирования наночастиц (первые 24 часа),
который сопровождается значительным увеличением оптической плотности и батохромным смещением положения полосы ППР на 15 нм. В последующие 14 дней изменения в спектрах не значительны. По данным ПЭМ, полученные наночастицы имеют сферическую форму, узкий диапазон распределения по размерам со средним диаметром 20 ± 1.5 нм, ^-потенциал -30 мВ. Стабильность характеристик сохраняется в течение 14 суток.
фл.
А
г А
1,6
1,2
0,8
0,4
4
350
400
■150
500
550 600
А, нм
Рис. 1. Спектры поглощения наночастиц серебра, стабилизатор - цитрат-ион, полученные: 1 - через 20 мин после синтеза, 2 - 24 ч, 3 -14 сут, 4 - 30 сут. СНЧ = 2-10-4 М
Флуориметрические свойства доксици-клина. Спектр флуоресценции ДЦ характеризуется невысокой интенсивностью (^возд 390 нм, Хфл= 520-550 нм). Известно [4], что усиление собственной флуоресценции молекулы на поверхности наночастицы серебра возможно, если спектр ППР наночастиц перекрывается со спектром возбуждения флуоресцирующей молекулы (рис. 2). В случае сорбции молекул ДЦ на поверхности наночастицы серебра можно ожидать усиление сигнала флуоресценции ДЦ в результате межмолекулярного переноса энергии возбуждения. Однако в условиях высокой плотности заряда стабилизатора цитрат-ионов значительное расстояние между анионами тетрациклина и поверхностью наночастиц препятствует их взаимодействию и проявлению влияния локального поля поверхностного плазмона на флуориметрические свойства молекулы антибиотика. В таких условиях интенсивность флуоресценции ДЦ практически не изменяется.
Модификация наночастиц серебра ионами европия. С целью сокращения расстояния между донором энергии (металлической поверхностью) и акцептором (ДЦ) осуществлена модификация поверхности наночастиц серебра ионами Еи3+.
0,4
1,2
0,3 0,6
о,г
200 150 300 350 400 450 500 550 600 А, нм
Рис. 2. Спектр возбуждения ДЦ (1); спектр поглощения
СДЦ :
наночастиц серебра (2). СА^Р; = 2-10-4 М, Сдц = 1 • 10-5 М
Известно [5], что ДЦ образует хелат с ионами европия, который характеризуется переносом энергии возбуждения. Особенностью комплексообразования является появление в спектре флуоресценции ДЦ новой полосы, характерной для эмиссии иона Еи3+(Хфл= 615 нм). Механизм возникновения сенсибилизированной флуоресценции заключается в поглощении электромагнитного излучения молекулой ДЦ и дальнейшего внутримолекулярного переноса энергии возбуждения на излучательные уровни иона редкоземельного элемента (РЗЭ) с последующей его флуоресценцией. Спектр флуоресценции комплексов Еи3+ характеризуется узкой полосой с Хфл = 615 нм (5Б0^7р2 переход). При этом интенсивность сенсибилизированной флуоресценции превышает собственную люминесценцию антибиотика и эмиссию самого иона Еи3+ до 30 раз. В то же время интенсивность флуоресценции бинарного комплекса европия с тетрациклином недостаточно высока для его эффективного использования во флуориметриче-ском определении остаточных содержаний антибиотиков в пищевых продуктах и биологических жидкостях. Использование наночастиц благородных металлов во флуориметрии позволяет в некоторых случаях увеличить сигнал эмиссии флуоресцирующих молекул [4].
Модификация наночастиц серебра ионами Еи3 + заключается в следующем: в пробирки объемом 2 мл вносят 1 мл раствора наночастиц серебра 2 •Ю-4 М, 1 мл Еи3+ 10-2 М, перемешивают и центрифугируют (12000 об/мин) 20 мин. Осадок модифицированных наночастиц растворяют в спирте (2 мл).
Нами установлено, что ^-потенциал модифицированных наночастиц зависит от концентрации ионов Еи3+в растворе (рис. 3). При увели-
Ç-потенциал
-Яр— 3,6 3,2 3,1 2,9 2,7
pC
Рис. 3. Зависимость Ç-потенциала наночастиц серебра
от концентрации ионов Eu3+. СНЧ = 7,5^ 10-5 М
чении концентрации ионов металла Z-потенциал наночастиц возрастает от -30 мВ до нулевого значения (4-10-4MEu3+) и в условиях дальнейшего роста концентрации РЗЭ (1.25-10-3MEu3+) значение потенциала увеличивается (+85 мВ), что обусловливает высокую стабильность коллоидной системы.
Комплексообразование положительно заряженной наночастицы серебра, модифицированной ионами европия, с анионами доксици-клина способствует сближению компонентов, значительному повышению эффективности как межмолекулярного, так и внутримолекулярного переносов энергии возбуждения и усилению сигнала сенсибилизированной флуоресценции образующегося хелата. способствует также участие цитрат-иона в образовании разнолигандного комплекса европия с ДЦ.
Образование комплексов с переносом энергии в исследуемой системе подтверждается появлением в спектре флуоресценции ДЦ характерной полосы сенсибилизированной эмиссии РЗЭ (Хфл=615 нм, Хвозб = 397нм). Установлено, что флуоресценция в растворе ДЦ в присутствии модифицированных наночастиц серебра увеличивается в 10 раз (рис. 4).
Изучены оптимальные условия получения максимального сигнала сенсибилизированной флуоресценции ДЦ в присутствии модифицированных наночастиц. Установлено, что интенсивность флуоресценции зависит от кислотности среды (рис. 5) и концентрации серебряных на-ночастиц.
Методика определения ДЦ. На основании проведенных исследований разработана флу-ориметрическая методика определения ДЦ в лекарственном препарате «Доксициклин» (ООО «Озон»). Методика определения: 5 таблеток препарата растирают в ступке, навеску, соответ-
300
200
100
фл.
400 450
Л, НМ
Рис. 4. Спектр возбуждения ДЦ в отсутствие (1) и в присутствии наночастиц серебра, модифицированных ионами Еи3+(2). СДёОТ;= 3,810-7 М, СЕи3+= 2,5-10-5 М, СДЦ = 110-6 М, Хфл = 615 нм
1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2
фл.
4 5 6 7 8 9 „ 10
pH
Рис. 5. Влияние кислотности среды на интенсивность флуоресценции ДЦ в присутствии модифицированных наночастиц серебра. Сдц = 110-6 M, CAgNPs = 3.8 10-7 M.
^б^95^ V= 615 нм
ствующую одной таблетке, растворяют в колбе емкостью 25 мл, отделяют раствор фильтрованием (фильтр с синей лентой).
К аликвотной части раствора, предварительно разбавленного в 100 раз, добавляют 1 мл буфера (рН 9), 0.4 мл 210-4 М модифицированных наночастиц серебра, 0.4 мл 7.5 10-5 М Еи3+, буфер до 4.0 мл. Измеряют интенсивность флуоресценции с временной задержкой 0,03 мс (Хвозб= 397 нм, ^фл= 615 нм) и по градуировоч-ному графику определяют содержание ДЦ в лекарственном препарате.
Кроме ДЦ в состав таблетки входит крахмал. Установлено, что при данных соотношениях крахмал не оказывает мешающего действия.
2
Диапазон определяемых концентраций составляет 5 •Ю-8 - 6-10-5М. Предел обнаружения (3а) 2-10-8М, Sr= 0.11.
В табл. 1 представлены результаты определения ДЦ в лекарственном препарате. Правильность контролируют методом «введено - найдено» (табл. 2).
Табяица 1
Результаты определения доксициклина в лекарственном препарате «доксициклин» (ООО «Озон») (п = 3, р = 0,95)
Заявленное содержание, мг Найдено, мг
х ± Дх
100 103 ± 14 0.11
Таблица 2
Контроль правильности определения доксициклина методом «введено - найдено» (п = 3, р = 0,95, ¿табл = 4,30)
Введено, мг Найдено, мг ^экспер
8 8.2±1.6 0.27 2.1
11 11.2 ± 2.8 1.2 2.8
57 49.8 ± 8.9 3.6 3.7
Выводы. Установлено, что эффект увеличения интенсивности флуоресценции раствора ДЦ в 10-30 раз в присутствии наночастиц серебра достигается только в случае предварительной модификации поверхности наночастиц ионами Eu3+.
На основании проведенных исследований предложена флуориметрическая методика определения ДЦ, апробированная в анализе лекарственного препарата. Диапазон определяемых концентраций 5-10-8 - 6-10-5М. Предел обнаружения (3а) составляет 2-10-8М, Sr= 0.11.
Список литературы
1. Tan H., Chen Y. Silver nanoparticle enhanced fluorescence of europium (III) for detection of tetracycline in milk // Sens. Actuators. B. 2012.Vol. 173. P. 262-267.
2. Штыков С. Н., Русанова Т. Ю. Наноматериалы и нанотехнологии в химических и биохимических сенсорах: возможности и области применения // Рос. хим. журн. 2008. Т. LII, № 2. С. 92-100.
3. Шевцова В. И., Гайду П. И. Положение полосы поверхностного плазмонного резонанса в коллоидных растворах наночастиц серебра и золота // Вестн. БГУ Сер. 1. 2012. № 2. С. 15-18.
4. GhoshD., ChattopadhyayN. Gold and silver nanoparticle based Superquenching of fluorescence : Areview // J. Lumin. 2015. Vol. 160. P. 223-232.
5. Смирнова Т. Д., Штыков С. Н., Кочубей В. И., Хряч-кова Е. И. Перенос энергии возбуждения в хелате европия с доксициклином в присутствии второго лиганда в мицеллярных растворах неионогенных ПАВ // Оптика и спектроскопия. 2011. Т. 110, № 1. С. 65-71.
Luminescent Properties of Doxycycline in the Presence of Silver Nanoparticles Modified by Ions of Europe
T. D. Smirnova, E. A. Zhelobitskaya, T. G. Danilina
Tatyana D. Smirnova, ORCID 0000-0002-3391-1092, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia, [email protected]
Elena A. Zhelobitskaya, ORCID 0000-0001-9918-3465, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia, [email protected]
Tatiana G. Danilina, ORCID 0000-0001-7956-2716, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia, [email protected]
Fluorescence spectroscopy is a routine tool for studying cellular and molecular visualization, flow cytometry, medical diagnosis, forensic medical examination, genetic analysis, and also an analytical method. However, most available organic dyes used to produce an optical signal have a number of important limitations, such as hydrophobicity, low quantum yield, and low photostability. Further development of the luminescent method associated with the improvement of existing fluorophores is not always effective, so in recent years researchers have turned to the use of various nanomaterials that are used as nanoreactors or participants in the donor electron acceptor pair of electron excitation energy. Of particular interest are metallic nanoparticles that can increase or decrease the fluorescence lifetime of fluorophores, increase the efficiency of resonant energy transfer in the donor-acceptor system as a result of the interaction of the excited state of a fluo-rophore with free electrons in metal nanoparticles. In the present work, the influence of silver nanoparticles on the fluorescent properties of doxycycline (DC) and its complex with europium is considered. The nanoparticles obtained are spherical, a narrow range of size distribution with an average diameter of 20 ± 1.5 nm, and a Z-potential of -30 mV. The stability of the characteristics is maintained for 14 days. In order to reduce the distance between the metal surface and the DC molecule, the silver nanoparticles are modified by europium ions. Earlier we showed that the DC forms a chelate with europium ions, which is characterized by the transfer of excitation energy. A peculiarity of complexation is the appearance in the fluorescence spectrum of a new band, which is characteristic for the emission of the europium ion (Xfl = 615 nm). We have established, that the Z-potential of modified nanoparticles depends on the concentration of europium ions in the solution. In the presence of europium ions, the Z-potential of the nanoparti-
cles increases from -30 mV to zero (4-10-4M Eu3+) and under the conditions of further growth of the metal ion concentration (up to 1.25 10-3M) the potential value increases (+85 mV), which causes a highstability of the colloidal system. We have established, that the signal of sensitized fluorescence in the presence of modified nanoparticles depends on the acidity of the medium and the con-
centration of silver nanoparticles. Optimal conditions for obtaining the maximum analytical signal are found. Based on the studies carried out, a fluorimetric method for determination of DC in the drug "Doxycycline", LLC "Ozone" was developed. Key words: doxycycline, luminescence, europium, silver nano-particles.
Образец для цитирования:
Смирнова Т. Д., Желобицкая Е. А., Данилина Т. Г. Люминесцентные свойства доксициклина в присутствии наночастиц серебра, модифицированных ионами европия // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 4. С. 370-375. DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-370-375.
dte this article as:
Smirnova T. D., Zhelobitskaya E. A., Danilina T. G. Luminescent Properties of Doxycycline in the Presence of Silver Nanoparticles Modified by Ions of Europe. Izv. Saratov Univ. (N.S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2017, vol. 17, iss. 4, pp. 370-375 (in Russian). DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-370-375.
