CC BY
14
№ 4 - 2015 г. 14.00.00 медицинские науки (14.03.00 Медико-биологические науки)
УДК 616.71-018.46-089.843-092.9-076.5
ЛЮМИНЕСЦЕНТНО-ГИСТОХИМИЧЕСК ОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОАМИНОВ ПРИ ГЕТЕРОТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА
О. В. Воробьева1. Л. А. Любовцева1. Е. В. Любовцева223
1ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова» (г.
Чебоксары, Чувашская Республика) 2БУ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы» (г. Чебоксары, Чувашская
Республика)
3ГУЗ «Республиканский центр ВМИР» (г. Чебоксары, Чувашская Республика)
В эксперименте изучено влияние гетеропересадки костного мозга на распределение биогенных аминов между биоаминосодержащими структурами костного мозга. Методы исследования. Под глубоким эфирным наркозом брали из бедренной кости 1 мл костного мозга кошки помещали в 2 мл физиологического раствора и тщательно размешивали. 1 мл суспензии костного мозга вводили в хвостовую вену мышам. Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1 х 108. В дальнейшем производили
люминесцентно-гистохимическое исследование. Результаты исследования. После гетеропересадки костного мозга гранулярные и тучные клетки постепенно перестают синтезировать нейроамины, разрушаются, а новые популяции не образуются. Появляются гистамин-положительные плазмобласты, изменяется миелограмма. Выявлено, что чужой костный мозг вызывает супрессию синтеза биогенных аминов и распад клеток-регуляторов. Вывод: происходит постепенное опустошение собственных клеток от нейроаминов, быстрое старение и гибель костного мозга.
Ключевые слова: гетеротрансплантация костного мозга, катехоламины (КА), серотонин (СТ), гистамин, гранулярные люминесцирующие клетки (ГЛК), тучные клетки (ТК), мегакариоциты (МКЦ).
Воробьева Ольга Васильевна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», г. Чебоксары, е-таП: olavorobeva@mail.ru
Любовцева Любовь Алексеевна — доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической морфологии и судебной медицины ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», г. Чебоксары, е-таП: olavorobeva@mail.ru
Любовцева Евгения Вячеславовна — доктор медицинских наук, профессор, заведующий БУ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы», руководитель ГУЗ «Республиканский центр ВМИР», г. Чебоксары, е-таШ olavorobeva@mail.ru
Актуальность проблемы. Применение люминесцентно-гистохимических методов позволило ряду исследователей выявить и изучить биоаминосодержащие структуры костного мозга, которые участвуют в регуляции процессов иммуногенеза [1]. Как известно, регуляция многих органов на месте происходит при помощи особых биоаминсодержащих структур, в состав которых входят многие компоненты, в том числе тучные (ТК) и гранулярные люминесцирующие клетки (ГЛК) [4, 5]. Выявлено, что в гранулах этих клеток содержатся катехоламины (КА), серотонин (СТ) и гистамин [7]. ГЛК совместно с ТК являются клетками-регуляторами и участвуют в автономной регуляции иммунологических и кроветворных органов.
Цель исследования: изучение влияния гетеропересадки костного мозга на распределение биогенных аминов между биоаминосодержащими структурами костного мозга.
Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования проведены на 45-ти мышах, 1-я группа — интактные мыши (п = 15), 2-я группа — контрольная группа мышей (п = 15), у которых нейроаминные сдвиги в гранулярных и ТК костного мозга происходят в первые 30 мин после введения физиологического раствора в дозе 1 мл, далее их количество в клетках стабилизируется. Вследствие этого материал для изучения брали через 40 мин после введения костного мозга. В 3-й группе производили гетеротрансплантацию костного мозга. Под глубоким эфирным наркозом брали из бедренной кости 1 мл костного мозга кошки, помещали в 2 мл физиологического раствора и тщательно размешивали. 1 мл суспензии костного мозга вводили в хвостовую вену мышам. Другая часть объема полученной суспензии шла на подсчет числа клеток в полученной гетерогенной популяции клеток костного мозга с помощью проточного спектрофотометра «Ф-2000» с применением флуоресцеина изотиоцианата ^ГГС). Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1 х 108 [2, 3]. Выведение животных из эксперимента проводилось на сроке 40 мин высокой дозой наркоза [6]. Уход и все процедуры по уходу осуществлялись по нормам и правилам обращения с лабораторными животными в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 № 267).
Нами использовались следующие методы исследования:
1. Люминесцентно-гистохимический метод [8] для выявления гистамина.
2. Для избирательного выявления КА и СТ применялся люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа.
3. Количественно уровень КА, СТ и гистамина в структурах оценивались с помощью цитоспектрофлуориметрии.
4. Представление о количественном распределении ТК и ГЛК дает метод подсчета их в 5-ти полях зрения микроскопа при увеличении об. 40, ок. 10.
5. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна применяли для определения
степени сульфатированности гепарина и состояния ТК (Ромейс Б., 1954). Ортохромную (голубую) окраску дает моно- и дисульфатированный, незрелый гепарин.
Бета-метахроматическую (чернильно-фиолетовую) дает трехсульфатированный,
созревающий гепарин и гамма-метахроматическая (пурпурная) окраска присуща
зрелому, пятисульфатированному гепарину.
6. Миелограмму исследовали в расчете на 500 клеток после окраски препаратов по Паппенгейму.
7. Полученные цифровые данные обрабатывались статистически по специально разработанной программе «Statistica», версия 6 (Copyright@Stat Soft, 19842001, ИПЧИ 31415926535897).
Результаты исследования и обсуждение. Исследования показали, что в препаратах костного мозга через 40 мин после гетеропересадки костного мозга нами обнаружены ГЛК, число которых снижено по сравнению с интактными животными. Содержание КА и СТ в них увеличено (рис. 1).
Рис. 1. Показатели интенсивности люминесценции нейроаминов в ГЛК после гетеропересадки костного мозга во временном аспекте (у.е.)
Вторым видом аминопродуцирующих клеток являются ТК, число которых увеличено в 2,5 раза по сравнению с интактными животными. Отмечено увеличение в них КА, а СТ — снижено. Появляются КА в цитоплазме нейтрофилов и моноцитов. В миелограмме наблюдается увеличение числа клеток эритроидного ряда за счет незначительного повышения количества базофильных и оксифильных нормоцитов.
При исследовании на гистамин выявляется снижение числа гистаминсодержащих ГЛК, в них остается люминесцирующими 1-2 гранулы. Происходит истощение аминов в гранулах этих клеток.
Число ТК увеличивается в 2,5 раза, однако содержание гистамина в них снижено. Эритроциты полностью люминесцируют, т. е. содержат в себе гистамин в отличие от интактных мышей. Это говорит о том, что излишки межклеточного гистамина адсорбируются гликокаликсом этих клеток.
В миелограмме определяется увеличение процентного содержания миелобластов, клеток эозинофильного ряда, нейтрофильных метамиелоцитов и снижение числа палочко-и сегментоядерных нейтрофилов с одновременным выбросом их в кровь. Увеличивается число лимфоцитов, снижается число плазмоцитов.
При исследовании препаратов костного мозга методом Массона-Фонтаны СТ и его метаболиты в костном мозге определяются в виде следов в ядрах клеток эритроидного ряда, мегакариоцитах, в зернистости и ядрах клеток эозинофильного ряда. Появляются единичные бластные формы, где это вещество определяется в наибольшем количестве на +5.
Все клетки имеют ортохромную окраску. Однако в цитоплазме миелобластов, эозинофильных миелоцитов, эритробластов появляется слабая гамма-метахромазия. ТК имеют интенсивную бета-метахромазию.
Через 1 сутки ГЛК единичны, содержание СТ в них понижено, однако количество КА остается выше нормы. ТК начинают определяться около липоцитов. Они мелкие, зеленые, число их снижено. В них снижено содержание СТ и КА (рис. 2).
45 40 35 30 25-1 20 15 10 5 О
А
А
л у
л- Л/Г
—1
и
интактные
1с утки
Рис. 2. Показатели интенсивности люминесценции нейроаминов в ТК после гетеропересадки костного мозга во временном аспекте (у.е.)
Выявляются мелкие клетки с бобовидным ядром, имеющие одинаковую зернистость. Появляется новая генерация макрофагов, располагающихся в основном вокруг жировых клеток. АПУД-клеток очень мало, до 4,1 на весь препарат. Постепенно образуется белая жировая ткань, в которой накапливаются как КА, так и СТ. Около гемопоэтических островков размножения и липоцитов обнаруживаются отдельные фрагменты нервных волокон.
Выявляется, что содержание гистамина в структурах остается сниженным. В ГЛК определяются единичные люминесцирующие гранулы с резко сниженным содержанием гистамина.
Число ТК не увеличивается, более того наблюдается еще большее снижение в них гистамина.
Появляются белые жировые клетки, содержание гистамина в которых повышается в 1,4 раза. Появляются гистаминположительные плазмобласты.
В миелограмме снижается число миелобластов и эозинофилов, и увеличивается число юных форм (миелоцитов и метамиелоцитов). В цитоплазме эозинофилов появляются базофильные гранулы. ТК разрушены. В большом числе выявляются макрофаги с цитоплазматическими включениями. Обнаруживается увеличение лимфоцитоподобных клеток и липоцитов.
Появляются липоциты, около которых располагаются кровеносные сосуды и мелкие ортохромные ТК.
Через 2-е суток после гетерогенной пересадки костного мозга люминесцируют лишь единичные гранулы в гранулярных клетках. В отдельных гранулах содержание КА повышено, а СТ — снижено.
Происходит дальнейшее увеличение жировой ткани, около ее клеток увеличивается
число ТК, однако размеры мельче обычных в 1,4 раза. В них содержание КА и СТ снижено. Очевидно, это молодые формы ТК. Нервные волокна определяются в виде отдельных фрагментов в основном около групп жировых клеток.
Число положительно импрегнированных жировых клеток резко возросло. В гепопоэтических клетках метахромазия не обнаруживается, что говорит о полном отсутствии сульфатации гепарина. Очень много ортохромных жировых клеток на разной стадии созревания. Появляются единичные, интенсивно окрашенные лимфобласты. ТК определяются только между жировых клеток. Они окрашиваются бета-метахроматично и в таком состоянии разрушаются.
Регистрируется сниженное содержание гистамина во всех структурах этого органа. В гранулярных клетках люминесцируют единичные гранулы, происходит их полный распад. Образуются поля из таких гранул.
Увеличивается число люминесцирующих липоцитов. В них гистамин определяется в ядрах, оболочках этих клеток и части цитоплазмы вокруг ядра. Около липоцитов располагаются мелкие, зеленые, слабо люминесцирующие ТК. Мегакариоциты — тусклые, гистамин в них выявляется в виде ободка около цитолеммы и в ядре.
В миелограмме наблюдается распад клеточных форм. Много обломков клеток. Наблюдается выброс гранул из эозинофилов, нейтрофилов. Число липоцитов увеличивается в 3,5 раза, также увеличивается их размер.
Таким образом, при гетеропересадке в костном мозге происходит нарушение регуляции и дифференцировка клеток. Снижение содержания СТ, КА вследствие разрушения биоаминпродуцирующих клеток приводит вначале к появлению лимфоцитоподобных клеток, а в дальнейшем к разрушению клеток костного мозга. ГЛК и ТК перестают синтезировать нейроамины, разрушаются, а новые популяции не образуются. Подвергаются тотальной дегрануляции. Угнетается синтез гепарина вплоть до полного отсутствия сульфатации.
Выводы
1. После гетеропересадки развивается постепенная супрессия синтеза нейроаминов в аминосодержащих структурах, истощение депо биогенных аминов и накоплением их в липоцитах.
2. Происходит выброс и опустошение клеток от нейроаминов, приводящий к изменению дифференцировки клеток в костном мозге.
3. Происходит опустошение собственных клеток костного мозга от нейроаминов
с последующим жировым перерождение костного мозга. Происходит гибель клеток — продуцентов нейроаминов в костном мозге.
Список литературы
1. Гривцова Л. Ю. Субпопуляции трасплантируемых стволовых кроветворных клеток / Л. Ю. Гривцова, Н. Н. Тупицын // Онкогематология. — 2006. — Т. 8, № 1. — С. 65-71.
2. Количественный учет гемопоэтических стволовых клеток. Проточная цитометрия в медицине и биологии / Е. Е. Зуева [и др.]. — Алматы, 2011. — 261 с.
3. Карноухов Н. А. Люминесцентные параметры ядерных клеток крови в процессе иммунного ответа организма / Н. А. Карноухов // Биофизика. — 1984. — № 2. — С. 276-279.
4. Любовцева Л. А. Биоаминсодержащие структуры костного мозга при системных заболеваниях крови / Л. А. Любовцева, Е. В. Любовцева // Морфология. — 2012. — № 3.
— С. 95-96.
5. Богданов Р. Ф. Субпопуляции Т-лимфоцитов периферической крови больных гемобластозами на фоне трасфузий лимфоцитов донора после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток / Р. Ф. Богданов, И. В. Гальцева // Гематология и трансфузиология. — 2013. — Т. 58, № 4. — С. 5-12.
6. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях / Под ред. Н. Н. Каркищенко, С. В. Грачева. — М. : Медицина, 2010.
— 344 с.
7. Ставинская О. А. Роль гистамина и серотонина в поддержании иммунного гомеостаза. Национальная конференция «Аллергология и клиническая иммунология — междисциплинарные проблемы» / О. А. Ставинская // Рос. аллергол. журн. — 2008.
— № 1. — С. 283-285.
8. Cross S. A. M. A Stindi of the methods available for the cytochhem : cal localization
of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetadehude / S. A. M. Cross, S. W. B. Ewen, E. W. D. Rost // J. Histochem. — 1971. — Vol. 6. — Р. 471-476.
LUMINESCENT AND HISTOCHEMICAL RESEARCH OF NEUROAMINES
AT MARROW HETEROTRANSPLANTATION
O. V. VorobyevaL. A. Lyubovtseva'. E. V. Lyubovtseva23
1FSBEIHPE «Chuvash state university n. a. I. N. Ulyanov» (Cheboksary, The Chuvash Republic) 2BE «Republican Bureau of Forensic Medical Examination» (Cheboksary, The Chuvash
Republic)
3SHE «Republican Center of RMAR» (Cheboksary, The Chuvash Republic)
Influence of marrow heterotransplantation on distribution of biogenic amines between bioaminocontaining marrow structures is studied during the experiment. Research methods. Under a deep etherization 1 ml of a cat's marrow from a femur was placed in 2 ml of normal saline solution and carefully stirred. 1 ml of suspension of marrow was entered into a caudal vein to mice. The cells amount was 2,1 x 108 peer 1 ml of suspension. Luminescent and histochemical research was performed after that. Results of research. After marrow heterotransplantation granular and mast cells gradually cease to synthesize neuroamines, then blasted, and new populations aren't formed. Histamine-positive plasmablasts upstart, myelogram changes. It is revealed that non self marrow causes a suppression of biogenic amines synthesis and disintegration of cells regulators. Conclusion: there is a gradual devastation of self cells from neuroamines, fast aging and marrow death.
Keywords: marrow heterotransplantation, catecholamins (CA), serotonin (ST), histamine, granular luminescing cells (GLC), mast cells (MC), megacaryocytes (MCC).
About authors:
Vorobyeva Olga Vasilyevna — candidate of medical science, assistant professor of chair of general and clinical morphology and forensic medicine at FSBEI HPE «Chuvash state university n. a. I. N. Ulyanov», e-mail: olavorobeva@mail.ru
Lyubovtseva Lyubov Alekseevna — doctor of biological science, professor, head of chair of general and clinical morphology and forensic medicine at FSBEI HPE «Chuvash state university n. a. I. N. Ulyanov», e-mail: olavorobeva@mail.ru
Lyubovtseva Evgenia Vyacheslavovna — doctor of medical science, professor, head of BE «Republican Bureau of Forensic Medical Examination», principal of SHE «Republican Center of RMAR», e-mail: olavorobeva@mail.ru
List of the Literature:
1. Grivtsova L. Y. Subpopulations transplant of hematopoietic stem cells / L. Y. Grivtsova, N. N. Tupitsyn // Haemato-oncology. — 2006. — Vol. 8, N 1. — P. 65-71.
2. Quantitative accounting of haematopoietic stem cells. Flowing cytometry in medicine and biology / E. E. Zuyeva [et al.]. — Almaty, 2011. — 261 p.
3. Karnoukhov N. A. Luminescent parameters of nuclear blood cells in the course of the immune reaction of the body / N. A. Karnoukhov // Biophysics. — 1984. — N 2. — P. 276-279.
4. Lyubovtseva L. A. Bioaminocontaining marrow structures at general diseases of blood / L. A. Lyubovtseva, E. V. Lyubovtseva // Morphology. — 2012. — N 3. — P. 95-96.
5. Bogdanov R. F. Subpopulations of T-lymphocytes of peripheric blood of patients with hemoblastoses against transfusion of lymphocytes of the donor after transplantation of haematopoietic stem cells / R. F. Bogdanov, I. V. Galtseva // Hematology and transfusiology. — 2013. — Vol. 58, N 4. — P. 5-12.
6. The guide to laboratory animals and alternative models in biomedical technologies / Under the editorship of N. N. Karkishchenko, S. V. Grachev. — M. : Medicine, 2010. — 344 p.
7. Stavinsky O. A. Role of histamine and serotonin in maintenance of immune homeostasis. The national conference «Allergology and Clinical Immunology — Interdisciplinary Problems» / O. A. Stavinskaya // Rus. journal of allergology. — 2008. — N 1. — P. 283-285.
8. Cross S. A. M. A Stindi of the methods available for the cytochhem : cal localization
of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetadehude / S. A. M. Cross, S. W. B. Ewen, E. W. D. Rost // J. Histochem. — 1971. — Vol. 6. — P. 471-476.
