CC BY
82
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
REVIEWS
© Коллектив авторов, 1997 УДК 616- 006.34-07:612.018
О. И. Костылева, Е. С. Герштейн, Н. Е. Кушлинский
ЛОКАЛЬНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА КЛЕТОК КОСТНОЙ И ХРЯЩЕВОЙ ТКАНЕЙ В НОРМЕ И ПРИ БЛАСТОМОГЕНЕЗЕ
НИИ клинической онкологии
Формирование скелета находится под контролем сложной системы регуляции роста и дифференцировки клеток, которая включает гормоны гипоталамо-гипо-физарной системы (соматотропный гормон — СТГ, пролактин, тиреотропный гормон), паратиреоидный гормон (ПТГ), факторы, опосредующие действие СТГ (соматомедины), другие эндокринные влияния (половые гормоны, гормоны надпочечников и щитовидной железы). Исследования последних лет показали, что в регуляции роста и дифференцировки клеток различных тканей немаловажную роль играют не только эндокринные, но и ауто- и /или паракринные механизмы регуляции, когда вырабатываемые клеткой парагормоны воспринимаются ею самой и/или соседними клетками. Костная ткань не является исключением. Исследования in vitro в первичных культурах неонатальных остеобластов мышей [68], в культурах клеток остеогенной саркомы человека HOS ТЕ 85 [44], SAOS-2 и PR [46], OST-1-PF [71], а также в опухолях больных с саркомами костей [12,45] показали, что неонатальные и опухолевые остеобласты синтезируют некие ростовые факторы, модулирующие пролиферацию и дифферен-цировку опухолевых клеток по ауто- и/или паракрин-ному пути.
Локальные регуляторы роста клеток тканей скелета объединяют большое количество биологически активных соединений: метаболиты арахидоновой кислоты; иммуноцитокины (интерлейкины -1 и -6; ИЛ-1 и ИЛ-6, фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) [29, 34, 40, 48, 60]; факторы роста фибробластов (ФРФ), инсулиноподобные факторы роста 1 и II (ИФР-I и ИФР-П), трансформирующий фактор роста Р (ТФР-Р), костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins — BMP), фактор роста хряща, фактор роста, выделенный из тромбоцитов (ТрФР), эпидермальный фактор роста (ЭФР) и, возможно, а-трансформирующий фактор роста (а-ТФР) [6, 13, 26, 41, 59].
Иммуноцитокины. Известно, что ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а являются агентами, ингибирующими биосинтез, усиливающими деградацию протеогликанов экстрацеллго-
O. I. Kostyleva, E. S. Gershtein, N. E. Kushlinsky
LOCAL BONE AND CARTILAGE CELL GROWTH REGULATORS IN THE NORM AND IN BLASTOMOGENES1S
Research Institute of - Clinical Oncology
Skeleton formation is controlled by a sophisticated system of regulation of cell growth and differentiation including hypothalamo-pituitary hormones (somatotropic hormone- STH, prolactin, thyroid-stimulating hormone), parathyroid hormone (PTH), STH-mediators (so-matomedins), other endocrine factors (sex hormones, adrenal and thyroid hormones). Recent studies have showed that auto- and/or paracrine regulatory mechanisms, when cell-produced parahormones are accepted by the cell itself and/or neighbor cells, contribute to the regulation of cell growth and differentiation in parallel with the endocrine mechanisms. Bone tissue is no exception. In vitro study of primary culture of murine neonatal osteoblastoma [68], cell culture of human osteosarcomas HOS TE 85 [44], SAOS-2 and PR [46], OST-l-PF [71] and human osteosarcomas [12, 45] demonstrated that neonatal and neoplastic osteoblasts synthesized certain growth factors participating in auto-and/or paracrine regulation of tumor cell proliferation and differentiation.
The local regulators of skeletal cell growth include a large number of biologically active compounds, such as arachidonic acid metabolites, immunocytokines (in-terleukine-1 and 6 (IL-1 and IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) [29, 34, 40, 48, 60], fibroblast growth factors (FGF), insulin-like growth factors I and II (IGF-I and IGF-II), transforming growth factor beta (TGF-beta), bone morphogenetic proteins (BMP), cartilage growth factor, platelet-derived growth factor (PGF), epidermal growth factor (EGF), and, probably, alpha-transforming growth factor (alpha-TGF) [6, 13, 26, 41, 59].
Immunocytokines. IL-1,11-6 and TNF-alpha are known to inhibit biosynthesis, to enhance degradation of pro-teoglycanes of cartilage extracellular matrix and to inhibit chondrocyte proliferation [9, 16, 21, 47, 60]. Of much interest are both immunocytokine effects in bone and cartilaginous tissues and the result of their interactions with other polypeptide growth factors. For instance, IL-1 inhibits TGF-beta-induced chondrocyte proliferation [16], while TGF-beta, PGF and IGF-I neutralize
лярного матрикса хрящевой ткани, а также ингибирующими пролиферацию хондроцитов [9, 16, 21, 47, 60]. Неменьший интерес представляют не только собственные эффекты иммуноцитокинов в костной и хрящевой тканях, но и результат их взаимодействия с другими полипептидными факторами роста. Так, например, показано, что ИЛ-1 ингибирует пролиферацию хондроцитов, индуцированную ТФР-fS [16], а ТФР-Р, ТрФР и ИФР-1 снимают ингибирующий эффект ИЛ-1 и ИЛ-6 и ФНО-а на синтез протеогликанов в монослойной культуре хондроцитов [9]. Кроме того, ТФР-(31 и ИЛ-1[3 индуцируют транскрипцию мРНК ИЛ-2 в артикулярных хондроцитах человека [36].
Инсулиноподобные факторы роста. ИФР-1 и -II являются важнейшими регуляторами костеобразования, оказывая анаболический и дифференцировочный эффекты на хрящ и кость: стимулируют синтез ДНК, гликозаминогликанов и протеогликанов экстрацеллю-лярного матрикса, коллагена [59, 76]. К настоящему времени свойства и физиологическая роль ИФР довольно полно охарактеризованы. ИФР-1 гомологичен соматомедину С, а ИФР-Н имеет выраженную гомологию с так называемым фактором, стимулирующим пролиферацию. Уровень ИФР регулируется, по-видимому, СТГ, и это подтверждается тем фактом, что при дефиците СТГ (гипофизарный нанизм) уровень сывороточного ИФР-1 снижается, а при акромегалии, связанной с гиперсекрецией СТГ, повышается [1, 20]. Со-матомедин С (ИФР-1) опосредует стимулирующее действие СТГ на резорбцию фосфата почками и продукцию l,25(OH)2D из 25-OHD почечной 25-ОНД-1-гидроксилазой [20].
Основная линия регуляции костеобразования, в которой участвуют ИФР, выглядит следующим образом: СТГ — соматомедины — костная/хрящевая ткань. В этом случае речь идет об ИФР в основном печеночного происхождения, поступающем в ткань-мишень по кровяному руслу (эндокринный путь регуляции). Однако в литературе представлены данные о локальной продукции ИФР и экспрессии рецепторов к ним клетками мезенхимы, в частности нормальными хондро-цитами, рядом клеточных линий фибросаркомы, хонд-росаркомы, а также остеогенной саркомы человека и животных [2, 20, 46].
Методами конкурентного связывания |251-меченных лигандов, Western и Nothern blot гибридизации и гибридизации в растворе доказано присутствие рецепторов ИФР-1, рецепторов ИФР-Н/маннозо-6-фосфата в клеточной линии остеогенной саркомы человека U-2 OS, а также тот факт, что клетки этой линии экспрессируют мРНК для ИФР-П, но не содержат мРНК для ИФР-1. Иммунореактивный ИФР-Н был обнаружен также в культуральной среде. Антитела a-IR3 к рецепторам ИФР-1 полностью блокировали синтез ДНК, стимулированный экзогенными ИФР-1 и ИФР-П. Таким образом, был сделан вывод о том, что ИФР-П является ауто- или паракринным регулятором роста клеток линии U-2 OS, а трансдукция сигнала ИФР-П опосредуется, по-видимому, рецепторами к ИФР-1 [46]. Ло-
tlie IL-1, 11-6 and TNF-alpha inhibiting effect on pro-teoglycane synthesis in chondrocyte monolayer culture [9]. Besides, TGF-betal and IL-lbeta induce IL-2 mRNA transcription in human articular chondrocytes [36].
Insulin-like growth factors. IGF-I and -II are most important regulators of osteogenesis exerting anabolic and differentiating effects on cartilages and bones. They stimulate synthesis of DNA, extracellular matrix gly-cosaminoglycanes and proteoglycanes, collagen [59, 76]. IGF properties and physiological role are well characterized by now. IGF-I is homological to somatomedin C, while IGF-II shows marked homology with a so called proliferation stimulating factor. IGF level seems to be controlled by STH which is proven by IGF-I fall in STH deficiency (pituitary nanism) and rise in acromegaly associated with STH hypersecretion [1,20]. The somatomedin C (IGF-I) mediates the STH enhancement of renal phosphate resorption and l,25(OH)2D production from 25-OHD by renal 25-OHD-lalpha-hy-droxylase [20].
The principal line of osteogenesis regulation with participation of IGF is as follows: STH-somatomedins-bone/cartilage tissue. In this case the IGF as a rule originates from the liver and is transported to the target tissue by circulation (endocrine regulation). However, there are published data about local IGF production and expression of IGF receptors by mesenchymal cells, in particular by chondrocytes, some cell lineages of human and animal fibrosarcoma and chondrosarcoma, osteogenic sarcoma [2, 20, 46].
It was showed by methods of competitive binding of l25I-labeled ligands, Western and Northern blot hybridization and hybridization in solution that human osteosarcoma U-2 OS contained IGF-I receptors and IGF-II/mannoso-6-phosphate receptors, and expressed mRNA for IGF-II, though had no mRNA for IGF-I. Immunoreactive IGF-II was also found in culture medium. The antibody alpha-IR3 to IGF-I receptors blocked completely DNA synthesis stimulated by exogenous IGF-I and IGF-II. These findings suggest that IGF-II is an auto- or paracrine growth regulator of U-2 OS cells, and the IGF-II signal transduction is mediated by IGF-I receptors [46]. The locally produced IGF most likely mediates estrogen effect on bone tumor estrogen-sensitive cells. 17beta-estradiol is showed to stimulate bone tissue IGF-I and IGF-II generation in culture of rat osteogenic sarcoma UMR-106 [41].
The system of IGF-binding proteins and their proteases plays a significant role in modulation of cell response to IGF. Normal human osteoblast-like cells produce IGF-binding proteins, in particular IGFBP-3 and -4, acting as potential IGF inhibitors, and protease of these proteins activated under the effect of IGF. Activity of the IGF-dependent protease is controlled at least by IGF-II and beta-TGF, while insulin, EGF, PTH, 1,25-dihydroxyvitamin D3, glucocorticoids, calcitonin, sex steroids fail to produce any significant effect on activity of this enzyme [13].
Transforming growth factor beta and related peptides. TGF-beta is an efficient regulator of bone and cartilage
кально продуцируемые ИФР, вероятно, опосредуют действие эстрогенов па эстрогепчувствительные клетки опухолей костей. Показана стимуляция образования ИФР-1 и ИФР-П в костной ткани под влиянием 17(3-эстрадиола в культуре остеогенной саркомы крыс иМЯ-Юб [41].
В модуляции ответа клеток на ИФР важную роль играет система ИФР-связывающих белков и их протеаз. Нормальные остеобластоподобные клетки человека продуцируют связывающие ИФР белки, в частности ГСРВР-З и -4, действующие как потенциальные ингибиторы эффектов ИФР, а также протеазу этих белков, для активации которой требуются ИФР. Активность ИФР-зависимой протеазы контролируется по крайней мере ИФР-П и (3-ТФР, в то время как инсулин, ЭФР, ПТГ, 1,25-дигидроксивитамин Оэ, глюкокортикоиды, кальцитонин, половые стероиды не оказывают значительного эффекта на активность этого фермента [13].
Трансформирующий фактор роста (3 и родственные пептиды. Эффективным регулятором пролиферации клеток костной и хрящевой тканей является ТФР-Р [1, 6, 15]. ТФР-Р был открыт одновременно в нескольких лабораториях благодаря свойству индуцировать рост нетуморогенных фибробластов в мягком агаре [42, 49]. Очень скоро выяснилось, что ТФР-р продуцируется многими нормальными и опухолевыми клетками и большинство их имеют специфические высокоаффинные рецепторы к ТФР-р [37].
Регуляторные функции ТФР-р выражаются в его антипролиферативном действии на большинство клеток, влиянии на дифференцировку клеток и в модификации эффектов других факторов роста [1]. В дальнейшем было показано, что ТФР-Р может стимулировать пролиферацию клеток только мезенхимального происхождения, а для большинства других клеток, особенно эпителиальных, ТФР-Р является мощным ингибитором роста [43]. Известно, что ТФР-Р влияет на процессы миогенеза, хондрогенеза, остеогенеза, дифференцировку эпителиальных клеток, функции иммунных клеток [2, 23, 32, 38, 51, 65].
ТФР-Р сам регулирует экспрессию своей мРНК в различных типах клеток. Так, например, в культурах эмбриональных клеток цыплят показано, что различные изоформы ТФР-Р (1, 2, 3) по-разному воздействуют на экспрессию соответствующих мРНК в зависимости от типа клеток. В культуре стернальных хондроцитов показано, что добавление ТФР-Р,, -Р2, -р3 приводит к увеличению уровней мРНК для ТФР-р2 и ТФР-р„ в то время как уровень мРНК ТФР-р4 не изменялся. В отличие от этого в культуре кардиомиоциов ТФР-Р|, -Р2, -Р, приводит к увеличению экспрессии ТФР-рз, -Р4 мРНК, а не ТФР-Р2 мРНК. В культуре фибробластов экспрессия мРНК для ТФР-Р2, -рЗ, -Р4 не подвержена воздействию какой-либо изоформы ТФР-р. Добавление ТрФР, ЭФР и ИЛ-1 в культуры эмбриональных клеток цыплят также оказывает различные эффекты на экспрессию ТФР-р мРНК в зависимости от типа клеток.
cell growth [1, 6, 15]. The TGF-beta was discovered simultaneously at several laboratories owing to its ability to induce growth of non-tumorigenous fibroblasts in soft agar [42, 49]. It was found soon that the TGF-beta was produced by many normal and neoplastic cells most of which had specific high-affinity TGF-beta receptors [37].
TGF-beta regulatory function consists of antiproliferative effect on most cells, interference with cell differentiation and modification of other growth factors’ effects [1]. It was showed further that TGF-beta could stimulate proliferation of mesenchymal cells only, while being a potent growth inhibitor for most other cells, especially of epithelial origin [43]. TGF-beta is known to interfere with myogenesis, osteogenesis, epithelial cell differentiation, immune cell functions [5,23,32,38,51,65].
TGF-beta itself regulates the expression of its mRNA in various cells. As showed in chicken embryo cell culture different TGF-beta isoforms (1,2,3) have different effects on expression of relevant mRNAs depending on cell type. Addition of TGF-betal, -beta2, -beta3 to sternal chondrocyte culture led to elevation of mRNAs for TGF-beta2 and TGF-beta3, while the level of TGF-beta4 mRNA was the same. While in cardiomyocyte culture TGF-betal, -beta2, -beta3 increased expression of TGF-beta3 and -beta4 mRNA rather than TGF-beta2 mRNA. In fibroblast culture TGF-beta2, -beta3, -beta4 mRNA expression showed no change under the effect of any of the TGF-beta isoforms. Addition of PGF, EGF or IL-1 to chicken embryo cell culture also had different effects on TGF-beta mRNA expression depending upon cell type. These findings are evidence of a complex pattern of regulation of TGF-beta gene transcription by TGF-beta, EGF, IL-1 themselves [21].
Mechanism of the TGF-beta antiproliferative action is unknown, though it is clear that the factor prevents or annihilates mitogenic effects of other growth factors [1]. This hypothesis is supported by the fact that TGF-beta neutralizes effects of EGF or alpha-TGF on NRK cells in monolayer culture, blocks EGF mitogenic effect on mjc-expressing fibroblasts [49,50]. TGF-beta together with PGF and IGF-I remit the IL-1 inhibiting effect on osteonectin synthesis in rabbit chondrocyte monolayer culture [8]. Like IGF-I, besides exerting action of its own TGF-beta mediates estrogen effects on human osteosarcoma HOS TE 85: incubation of HOS TE 85 sarcoma cells with 17beta-estradiol leads to increase in TGF-beta mRNA, while antibodies to TGF-beta reduce basal and estrogen-induced cell proliferation [28,44].
Addition of TGF-beta to proliferating rabbit articular chondrocytes in medium with low (2%) concentration of fetal calf serum (FCS) reduced cell number and inhibited DNA synthesis after 72-hour incubation. While the TGF-beta addition to cell culture in growth medium with 10% FCS increased the cell number after 48 hours of incubation without enhancement of DNA synthesis. The TGF-beta effects on chondrocyte proliferation depend considerably upon FCS concentration and time of incubation. As shown by experiments with EGF,
Полученные результаты свидетельствуют о комплексной картине регуляции транскрипции генов ТФР-Р самим ТФР-Р, ЭФР, ИЛ-1 [21].
Механизм аптипролиферативпого действия ТФР-Р неизвестен, хотя понятно, что он предотвращает или устраняет митогенный эффект других факторов роста [1]. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что ТФР-Р снимает эффект ЭФР или (а-ТФР) на клетки линии ЫЯК в монослойной культуре, блокирует митогенный эффект ЭФР на тус-экспрессирующие фиб-робласты [49, 50]. ТФР-Р, наряду с ТрФР и ИФР-1, обращает ингибирующий эффект ИЛ-1 на синтез ос-теонектипа в монослойной культуре хондроцитов кролика [8]. Так же, как и ИФР-1, ТФР-Р, помимо собственного воздействия, является посредником влияния эстрогенов на клетки остеогенной саркомы человека НОБ ТЕ 85: инкубация клеток этой линии в присутствии 17 р-э страд иола ведет к увеличению уровня ТФР-Р-мРНК, а антитела к ТФР-Р снижают базальную и эст-рогениндуцированную клеточную пролиферацию [28, 44].
Показано, что добавление ТФР-Р к пролиферирующим хондроцитам суставного хряща кролика при низкой концентрации фетальной телячьей сыворотки (ФТС) в среде (2%) приводит к снижению числа клеток и синтеза ДНК в течение .72 ч. В отличие от этого при 10% содержании ФТС в культуральной среде добавление ТФР-Р вызывало увеличение количества клеток через 48 ч без увеличения синтеза ДНК. В зависимости от концентрации ФТС и времени инкубирования эффекты ТФР-Р на пролиферацию хондроцитов значительно изменялись, а эксперименты с ЭФР показали, что действие ТФР-Р модулируется, по-видимому, неким ЭФР-подобным фактором [66].
ТФР-Р оказывает бифазное влияние на репликацию остеобластов, которое зависит от концентрации ТФР-Р и плотности клеток в монослое. На культуры клеток, находящиеся в состоянии, близком к конфлюентному, ТФР-Р оказывает стимулирующее действие, а на растущие редким слоем остеобласты — ингибирующее. Однако независимо от влияния на пролиферацию ТФР-Р стимулирует синтез коллагена остеобластами [7]. ТФР-р оказывает дифференцировочный эффект на культуру артикулярных хондроцитов кролика, обработанных ре-тиноевой кислотой для элиминации дифференцированного фенотипа, маркером которого для хондроцитов является синтез коллагена типа II и большого количества протеогликанов. Экспозиция таких клеток с ТФР-р, во вторичной культуре в бессывороточной и не содержащей ретиноевой кислоты среде ведет к реэкспрессии дифференцированного фенотипа, что выражается в стимуляции синтеза коллагена II и макромолекул экстрацеллюлярного матрикса [4]. Дифференцировочный эффект ТФР-р в хрящевой ткани подтверждается также экспериментами по изучению влияния факторов роста на метаболизм УДФ-сахаров, являющихся компонентами гликозаминогликанов экстрацеллюлярного матрикса, в хондроцитах бычьего суставного хряща [76].
the TGF-beta effect might be modulated by a certain EGF-like factor [66].
TGF-beta produces a biphase effect on osteoblast replication depending upon TGF-beta concentration and cell density in the monolayer. TGF-beta stimulates cells close to confluence and inhibits rarified osteoblasts. However, TGF-beta enhances osteoblastic collagen synthesis irrespective of the effect on the proliferation [7]. TGF-beta produces differentiation effect on rabbit articular chondrocytes pretreated with retinoic acid to eliminate the differentiated phenotype characterized by collagen II synthesis and increased proteoglycane level. Exposure of these cells to TGF-beta in secondary culture in serum-and retinoic acid-free medium leads to re-expression of the differentiated phenotype as evidenced by stimulation of synthesis of collagen II and extracellular matrix macromolecules [4]. The TGF-beta differentiation effect on cartilaginous tissue was also confirmed by experimental study of growth factor action on metabolism of UDP sugars which are components of extracellular matrix glycosaminoglycanes in bovine articular chondrocytes [76].
Exogenous TGF-beta is showed to reversibly prevent in vitro terminal differentiation of rat epiphysal chondrocytes into hypertrophied cells. TGF-betal stabilizes phenotype of prehypertrophied epiphysal chondrocytes by preservation of expression of the collagen II gene and coordination of expression of genes coding collagen and stromelysin metalloproteases. This TGF-beta effect may be important in enchondral ossification as an element of chondrocyte growth and differentiation regulation via modulation of extracellular matrix molecule and metalloprotease expression [3].
Chondrocyte-produced TGF-beta is showed in vitro to interfere with cartilage vascularization inhibition, while EGF/alpha-TGF stimulates tubular morphogenesis of microvascular endotheliocytes cocultured with chondrocytes [57].
There was increase in synthesis of osteopontin, a protein of bone tissue extracellular matrix, in response to PTH, EGF, TGF-beta and PGF in confluent cultures of normal rat osteoblasts and in cells of RCA-11 lineage (rat calcaneus osteoblast clone) [24]. TGF-beta blocked collagenase gene expression in osteoblast lineages of human osteosarcomas MG-63 and U-2 induced by other factors contained in FCS added to the culture medium [60].
Bone tissue demonstrates a 10-fold greater concentration of TGF-beta-like proteins as compared with other tissues [7]. Some of them are characterized rather well. First of all these include a chondrogenesis-inducing epithelium growth inhibitor (CIF A and CIF B) [18,55]. The CIF A and CIF B are polypeptides derived from demineralized bones; they are able to enhance chon-drogenesis and to induce growth of NRK-49F cells in soft agar in the presence of EGF. Both the factors stimulate in vitro synthesis of chondrospecific macromolecules and differentiation of mesenchymal embryo cells [55]. Bone morphogenetic proteins, the only factors known to induce the in vivo synthesis were also extracted from bovine demineralized bones. Most of these proteins
Выявлено, что экзогенный ТФР-ß обратимо предотвращает терминальную дифференцировку эпифизаль-ных хондроцнтов крыс in vitro в гипертрофированные клетки. ТФР-ß, стабилизирует фенотип прегипертро-фированных эпифизальных хондроцитов путем сохранения экспрессии гена коллагена типа II и координации ингибирования экспрессии генов, кодирующих метал-лопротеазы коллагена и стромелизина. Возможно, этот эффект ТФР-ß важен во время энхондральной осси-фикации как регулятор роста и дифференцировки хондроцитов путем модуляции экспрессии молекул экстра-целлюлярного матрикса и металлопротеаз [3].
Показано in vitro, что ТФР-ß, продуцируемый хонд-роцитами, вовлечен в ингибирование васкуляризации хряща, в то время как ЭФР/а ß-ТФР, наоборот, стимулируют тубулярный морфогенез микроваскулярных эн-дотелиоцитов, кокультивированных с хондроцитами [57].
В конфлюентных культурах нормальных остеобластов крыс и в клетках линии RCA-11 (клон остеобластов пяточной кости крыс) в ответ на ПТГ, ЭФР, ТФР-ß и ТрФР наблюдалось увеличение синтеза остеопонтина, одного из белков экстрацеллюлярного матрикса костной ткани [24]. ТФР-ß блокировал экспрессию гена кол-лагеназы в остеобластах линий остеосарком человека MG-63 и U-2, индуцированную другими факторами, содержащимися в ФТС, добавленной в среду [60].
В костной ткани обнаруживается в 100 раз более высокий уровень содержания ТФР-Р-подобных белков, чем в других тканях [7]. Некоторые из них хорошо охарактеризованы. Прежде всего это ингибитор роста эпителия, индуцирующий хрящеобразование (CIF А и CIF В) [18, 55]. CIF А и CIF В — полипептиды, выделенные из деминерализованных костей и способные ускорять хрящеобразование, а также индуцировать рост клеток NRK-49F в мягком агаре при наличии ЭФР. Оба фактора стимулируют in vitro синтез хрящеспецифических макромолекул и дифференцировку эмбриональных клеток мезенхимального типа [55]. Также из деминерализованных бычьих костей были выделены костные морфогенетические белки, единственные известные сегодня факторы, которые индуцируют остеогенез in vivo. Большинство этих белков является членами семейства полипептидов, кодируемых генами ТФР-ß (костные морфогенетические белки 2, 3, 4, 5, 6, 7 —BMP 2-7) [69, 70].
Показано, что костные морфогенетические белки ВМР-2, -4 индуцируют процесс энхондральной осси-фикации in vivo [69, 70], что подразумевает важную роль этих пептидов в формировании кости; мРНК ВМР-2, -4 были обнаружены в различных эмбриональных эпителиальных и мезенхимальных тканях мышей, однако сами белки в этих тканях не определялись [22, 35]. У человека ни белки BMP, ни их мРНК в нормальных тканях не изучались. Однако в экстрактах из остеогенной саркомы человека [63, 72—75] и клонах клеток, полученных из остеогенной саркомы [58], обнаруживалась костная морфогенетическая активность, возможно, опосредованная одним или несколькими морфогенети-
belong to the polypeptide family coded by TGF-beta genes (bone morphogenetic proteins 2, 3, 4, 5, 6, 7- BMP 2 to 7) [69,70].
The BMP-2 and -4 arc showed to induce enchondral ossification in vivo [69,70] which suggests the important role of these peptides in bone generation. BMP-2 and -4 mRNAs were found in various murine embryo epithelial and mesenchymal tissues though the proteins were not detected in these tissues [22,35]. Although there was no study of BMP proteins or their mRNA in normal human tissues, extracts from human osteogenic sarcoma [63,72-75] and osteosarcoma cell clones [58] demonstrated some bone morphogenetic activity most likely mediated by one or several morphogenetic proteins. In 1993 it was showed immunohistochemically that human osteosarcoma contained BMP-2 and -4, and no other proteins of this family [72]. BMP expression was observed in 57% of osteosarcomas and failed to be detected in chondrosarcoma and Ewing sarcoma. There is a tendency to higher BMP-2 and -4 expression in metastatic tumors as compared with primary ones. BMP-positive tumors have poorer prognosis as concerns lung metastasis [72-75]. BMP expression is more marked in fibrohistiocytic osteosarcoma characterized by minimal tumor cell differentiation and lower level of tumor osteoid as compared to the osteoblastic subtype [72]. Thus BMP-2 and -4 production does not lead directly to release of tumor osteoid. It is probable that the tumor contains cells producing BMP-2 or BMP-4 or both, together with not-BMP-producing cells responding to BMP by osteoblast differentiation and osteoid synthesis. In other words, BMP seem to perform their function by the auto- and/or paracrine routes [72].
It was demonstrated immunohistochemically that BMP are found mostly in tumor cell cytoplasm and in a small part in the.osteoid, though most BMP studied was extracted from extracellular matrix [53,63]. These results were obtained in extracts from normal bones, while mechanisms of the proteins’ secretion and association with the matrix in blastomogenesis were studied neither in animals nor in man.
Epidermal and alpha-transforming growth factors. There are few data on the role of EGF and their receptors in generation of skeletal tissues, pathogenesis of bone tumor rapid growth and metastasis development [31,39,52,77]. High-affinity EGF receptors were discovered on cell membranes of human osteosarcoma OST-1PF. EGF, alpha-TGF and FGF are potential mitogens for this osteosarcoma line [71]. Rabbit rib chondrocyte culture demonstrated high-affinity (Kd = 0.3 nM) and low-affinity (Kd = 1.6 nM) EGF binding sites similar to EGF receptors (EGFR) in breast tissue [26,27]. Protein kinase C activators can reduce EGFR expression by 60-75% probably due to inhibition of expression of the high-affinity EGFR population [8,11,19,54].
Data about EGF physiological effects in skeletal tissues are equivocal. On the one hand, there is evidence of the fact that EGF and TGF-alpha inhibit significantly proteoglycane synthesis in murine patella chondrocytes
ческими белками. В 1993 г. иммуногистохимическими методами было показано наличие ВМР-2, -4 и отсутствие других белков этого семейства в остеогенной саркоме человека [72]. Установлено, что экспрессия костных морфогенетических белков наблюдается в 57% случаев остеогенной саркомы и не обнаруживается у больных хондросаркомой и саркомой Юинга. Обнаружена тенденция к более высокому уровню экспрессии ВМР-2, -4 в метастатических опухолях по сравнению с первичными. Показано также, что ВМР-позитивные опухоли имеют неблагоприятный прогноз в отношении возникновения метастазов в легких [72—75]. Экспрессия костных морфогенетических белков в наибольшей степени выражена в остеогенной саркоме фиброгистио-цитарного типа. Этот гистотип характеризуется минимальной степенью дифференцировки опухолевых клеток, продуцирующих меньшее количество опухолевого остеоида, чем остеобластический подтип [72]. Таким образом, продукция ВМР-2, -4 не ведет прямо к образованию опухолевого остеоида. Возможно, в опухоли содержатся клетки, продуцирующие ВМР-2 или ВМР-4 или сразу оба пептида, и клетки, не синтезирующие костные морфогенетические белки, а только отвечающие на появление ВМР дифференцировкой остеобластов и синтезом остеоида, т. е. костные морфогенетические белки, вероятно, осуществляют свою функцию ауто- и/или паракринным путем [72].
Иммуногистохимическими методами было показано, что основная часть костных морфогенетических белков локализуется в цитоплазме опухолевых клеток и очень немного в остеоиде. Однако большая часть изученных ВМР экстрагировалась из экстрацеллюлярного матрикса [53, 63]. Правда, эти результаты были получены на экстрактах из нормальной кости, а механизмы секреции этих белков и ассоциации с матриксом при бластомогенезе ни у животных, ни у человека не изучены.
Эпидермальный и а-трансформирующий факторы роста. Немногочисленные данные представлены в литературе о роли ЭФР и их рецепторов в формировании тканей скелета и в патогенезе быстрого роста опухолей костей и их метастазировании [31, 39, 52, 77]. Высокоаффинные рецепторы ЭФР обнаружены на мембранах клеток линии остеогенной саркомы человека 08Т-1-РР. ЭФР, а-ТФР, ФРФ — потенциальные митогены для этой линии остеосаркомы [71]. В культуре реберных хондроцитов кролика обнаружено 2 типа мест связывания ЭФР: высокоаффинные (Ка = 0,3 нМ) и низкоаффинные (Кд= 1,6 нМ), аналогичных рецепторам ЭФР (РЭФР), обнаруженным в ткани молочной железы [26, 27]. Активаторы протеинкиназы С способны снижать экспрессию РЭФР на 60—75%, что происходит, вероятно, за счет угнетения экспрессии популяции высокоаффинных РЭФР [8, 11, 19, 54].
О физиологических эффектах ЭФР в тканях скелета имеются противоречивые сведения. С одной стороны, получены данные о том, что ЭФР и ТФР-а в присутствии ИФР-1 вызывают значительное угнетение синтеза протеогликанов хондроцитами надколенника
in the presence of IGF-I, but neither factor produced any effect on patella cells if the IGF-I was absent [64]. The supposition may be made that IGF-I somehow mediates the EGF and TGF-alpha actions. On the other hand, EGF together with IGF, androgens and calcitonin are known to enhance chondrocyte proliferation, collagen and proteoglycane synthesis in rabbit differentiated chondrocyte culture [15]. As demonstrated on murine osteoblast lineage MOB-3-4-F2, EGF stimulates DNA synthesis [25]. EGF stimulates cell proliferation in a dose-dependant manner in G292 osteoblasts and primary culture of rat neonatal osteoblasts [56,78]. In cell culture of osteogenic sarcoma UMR-106 [14] and culture of articular chondrocytes of adult pigs [40] EGF enhanced mitogenesis with stimulation of c-fos and c-jun gene expression being observed in parallel. In the line UMR-106 the EGF induced mRNA of the primary response gene Egr-1 and reduced the number of binding sites for l,25(OH)2D3, but unlike PTH and prostaglandine E2, the EGF failed to increase the intercellular cAMP pool [14, 30]. Since the induction of mRNA c-fos was observed both after addition of tetradecanoylphorbol acetate and forskolin, while mRNA Egr-1 was induced under the effect of tetradecanoylphorbol acetate only, it may be supposed that EGF signal transduction in the UMR-106 line was effected via activation of Egr-1 which may contribute to EGF mitogenic effect, rather than through stimulation of protein kinase A [14]. In-domethacin, a cyclooxygen kinase inhibitor, and protein kinase C inhibitors partially suppress the EGF-induced mitogenesis [25].
The EGF/alpha-TGF at least partially produce their effects via activation of EGFR internal tyrosine kinase and other protein kinases including protein kinase C
[14]. This observation is confirmed by effects of inhibitors of protein kinases, such as genistein, tyrfostins and ret-inoic acid, that inhibit the ligand-induced EGFR autophosphorylation, on various human osteosarcoma and human and animal osteoblast lines [56, 62, 78]. Genistein inhibited the EGF effect in the line G292 [78]. Tyrfostin 25 inhibited the EGF proliferative effect in G292 osteoblasts and in primary culture of osteoblasts isolated from rat neonatal calcaneus [56]. In the normal murine osteoblast-like cell line MC3T3-E1 retinoic acid also inhibited the EGF-induced mitogenesis while failing to affect EGFR expression [62]. There was in vitro study of the effect of sumarin, a non-specific blocker of EGF-receptor binding. Suramin produced a significant inhibiting effect on human osteosarcoma SAOS-2 and rat embryo osteoblast lines FRC, while the culture medium of human prostate carcinoma PC3 cells (producing a large amount of EGF and alpha-EGF) stimulated considerably cell growth in these two bone cultures. Antibodies to EGF and alpha-TGF inhibited growth of PC3 cells, while the conditioning medium after this treatment inhibited cell growth in bone cultures transferred in this medium [10]. Suramin was showed to inhibit resorption of murine calcaneus induced by PTH, TNF and EGF [67].
мышей. В отсутствие ИФР-I оба фактора не оказывают никакого воздействия на клетки надколенника [64]. В этом случае можно предположить, что действие ЭФР и ТФР-а неким образом опосредуется ИФР-I. С другой стороны, известно, что в культуре дифференцированных хондроцитов кролика ЭФР наряду с ИФР, андрогенами и кальцитоиином стимулирует пролиферацию хондроцитов, а также синтез ими коллагена и протеогликанов
[15]. На клеточной линии остеобластов мышей МОВ-3-4-F2 показано, что ЭФР стимулирует синтез ДНК [25]. В остеобластах линии G292 и первичной культуре неонатальных остеобластов крыс показано, что ЭФР дозозависимо стимулировал пролиферацию клеток [56, 78]. В культуре клеток линии остеогенной саркомы UMR-106 [14] и в культуре суставных хондроцитов взрослых свиней [40] ЭФР стимулировал митогенез, при этом наблюдалась стимуляция экспрессии c-foc и c-jun генов. В линии UMR-106 под действием ЭФР наблюдались также индукция мРНК гена первичного ответа Egr-J и уменьшение количества сайтов связывания для 1,25 (OH)2D3, но в отличие от ПТГ и простагландина Е2 ЭФР не увеличивал внутриклеточный пул цАМФ [14, 30]. Поскольку индукция c-fos мРНК наблюдалась и при добавлении тетрадеканоилфорболацетата, и при добавлении форсколина, a Egr-1 мРНК — только под воздействием тетрадеканоилфорболацетата, то, вероятно, трансдукция сигнала ЭФР в линии UVR-106 осуществляется не посредством активации протеинкиназы А, а путем активации Egr-1, который может играть роль в реализации митогенного эффекта ЭФР [14]. Ин-дометацин, ингибитор циклооксигеназы, и ингибиторы протеинкиназы С частично подавляют ЭФР-индуциро-ванный митогенез [25].
ЭФР/а-ТФР опосредуют свои эффекты, по крайней мере частично, через активацию внутренней тирозин-киназной активности рецептора ЭФР и другие протеинкиназы, включая протеинкиназу С [14]. Это подтверждают также исследования эффектов ингибиторов протеинкиназ генистеина, тирфостинов и ретиноевой кислоты, подавляющих лигандиндуцированное ауто-фосфорилирование РЭФР, на различные линии остеогенной саркомы человека и остеобластов человека и животных [56, 62, 78]. Генистеин ингибировал эффект ЭФР в линии G292 [78]. Тирфостин 25 ингибировал пролиферативный эффект ЭФР в остеобластах линии G292 и в первичной культуре остеобластов, изолированных из неонатальной пяточной кости крыс [56]. В линии нормальных остеобластоподобных клеток мышей МСЗТЗ-Е1 ретиноевая кислота также подавляет ЭФР-индуцированный митогенез, не оказывая влияния на уровень экспрессии РЭФР [62]. In vitro исследовали также влияние сурамина — неспецифического блока-тора связывания ЭФР с рецепторами. Сурамин оказывал значительный ингибирующий эффект на клетки линии остеогенной саркомы человека SAOS-2 и линии эмбриональных остеобластов крыс FRC, а среда, в которой культивировали культуру клеток рака предстательной железы человека РСЗ (продуцирующих большое количество ЭФР и а-ТФР), приводила к значительной
TGF-alpha which is known to have a common receptor with EGF produces EGF-Iike effects in most EGF target tissues [33]. It can potentiate adenylate cy-clasc activity and bone resorption induced by PTH and PTH-like protein. EGF and fibroblast growth factor reduce PTH receptors and extracellular matrix glycosami-noglycane synthesis in rabbit rib chondrocyte culture which suggests elimination of differentiation phenotype of the cell culture [59]. The study of growth factor effects on differentiation in primary culture of neonatal mouse calcaneus osteoblasts showed that EGF and PGF inhibited expression of alkaline phosphatase which is a main marker of osteoblast differentiation phenotype. In the presence of atoxic ascorbic acid the culture cells formed many-layer arrangements and secreted organic extracellular matrix mainly consisting of collagen I. In the presence of beta-glycerophosphate and calcium phosphate the culture demonstrated active mineralization resulting in matrix generation and mineralization characteristic of lamellar bones. EGF and PGF inhibited calcification in the culture [68]. The osteoblast conditioning medium contained some growth factors which enhanced proliferation of Balb/c 3T3 mesenchymal cells placed in the medium though failed to stimulate their differentiation [68].
However, there are reports of opposite effects of EGF and alpha-TGF on cartilage cell differentiation [17, 61, 76]. In combination with osteogenin EGF has a differentiation effect on monolayer culture of dedifferentiated rabbit chondrocytes as manifested by restoration of their ability to produce collagen II and pro-teoglycanes characteristic of mature chondrocytes [17]. EGF stimulates augmentation of intracellular UDP-glu-coronate pool and [35S] sulphate uptake by glycosami-noglycanes synthesized by bovine articular chondrocytes [76]. TGF-alpha and IGF-I can induce differentiation of two human metastatic chondroma cell lines: the tumor cells stop division and start to intensely produce mucopolysaccharides characteristic of completely differentiated chondrocytes of intervertebral disk fibrous cartilage [61].
Conclusion. Dysregulation of cell proliferation and differentiation is a principal mechanism of generation and development of malignant tumors. Recent researches have showed that tumor cell growth may go out of control due to production of local regulators of these processes by the tumor cells themselves or by surrounding stromal cells. Although the lack of factual data does not allow us to make final conclusions on mechanisms of action and interaction of the growth factors in question, it is clear that they play an important role in formation of skeleton tissues and bone neoplastic pathogenesis. Interference in growth factor secretion and especially in accepting and transduction of the growth modulating signal may be a reasonable approach to bone sarcoma therapy.
стимуляции роста клеток этих двух костных культур; антитела к ЭФР и а-ТФР ингибировали рост клеток культуры РСЗ, а среда кондиционирования после такой обработки, в которую помещали костные культуры, приводила также к значительному ингибированию их роста [10]. Показано, что сурамин дозозависимо подавляет резорбцию пяточной кости мышей, индуцированную ПТГ, ФИО и ЭФР [67].
ТФР-а, который, как известно, имеет общий с ЭФР рецептор, вызывает ЭФР-подобные эффекты в большинстве тканей-мишеней ЭФР [33]. Он способен потенцировать активность аденилатциклазы и резорбцию костных балок, индуцированные ПТГ и ПТГ-подобным протеином. ЭФР и фактор роста фибробластов вызывает снижение количества рецепторов ПТГ и синтеза гликозаминогликанов экстрацеллюлярного матрикса в культуре реберных хондроцитов кролика, что свидетельствует об элиминации дифференцированного фенотипа клеток культуры [59]. Исследование влияния факторов роста на процесс дифференцировки в первичных культурах неонатальных остеобластов пяточной кости мышей показало, что ЭФР и ТрФР ингибируют экспрессию щелочной фосфатазы, которая является одним из основных маркеров дифференцированного фенотипа остеобластов. В присутствии аскорбиновой кислоты, не оказывающей токсического эффекта, клетки культуры формировались многослойно и секретировали органический экстрацеллюлярный матрикс, состоящий преимущественно из коллагена типа I. В присутствии Р-глицерофосфата и фосфата кальция идет активный процесс минерализации в культуре, в результате чего наблюдается картина формирования матрикса и минерализации, характерная для ламеллярной кости. ЭФР и ТрФР ингибировали кальцификацию в культуре [68]. Среда кондиционирования этих остеобластов содержала некие факторы роста, которые вызывали при помещении в нее штамма мезенхимальных клеток Ва1Ь/с ЗТЗ активизацию их пролиферации, но не дифференцировки [68].
Однако в литературе имеются данные и о противоположных эффектах ЭФР и а-ТФР на дифференци-ровку клеток хрящевой ткани [17, 61, 76]. В комбинации с остеогенином ЭФР оказывает дифференцировочный эффект па монослойную культуру дедифференцирован-ных суставных хондроцитов кролика, что выражается в восстановлении их способности продуцировать коллаген типа II и протеогликаны, характерные для зрелых хондроцитов [17]. ЭФР стимулирует увеличение пула внутриклеточного УДФ-глюкуроната и включение [3\9] сульфата в гликозаминогликаны, синтезируемые хонд-роцитами бычьего суставного хряща [76]. ТФР-а и ИФР-1 могут вызывать дифференцировочный эффект на клетки двух линий хордомы, полученных из метастатических хордом человека, что заключается в прекращении деления опухолевых клеток и активной наработке ими мукополисахаридов, характерных для полностью дифференцированных хондроцитов фиброзного хряща межпозвоночных дисков [61].
Заключение. Нарушение регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток является одним из основных механизмов возникновения и развития злокачественных опухолей. В исследованиях последних лет доказано, что одним из путей ухода опухолевых клеток из-под рострегулирующего контроля организма может быть продукция ими или окружающими стромальными клетками местных регуляторов этих процессов. Несмотря на то что недостаток фактического материала не позволяет сделать окончательные выводы о механизмах действия и взаимодействия рассмотренных факторов роста, понятно, что они играют важную роль в формировании тканей скелета и патогенезе опухолей костей. Вмешательство в процессы секреции ростовых факторов и, особенно, в процессы восприятия и передачи их ростмодулирующего сигнала может оказаться перспективным подходом к терапии сарком костей.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Иващенко Ю. Д., Быкорез А. И. Полипептидные факторы роста и канцерогенез. — Киев, 1990. — С. 66—93.
2. Adams S. О. II Nature. — 1983.—№ 302. — Р. 150.
3. Ballock R. Т., Heydemann A., Wakefield L. М. et al. // Dev. Biol. — 1993,—Vol. 158, N 2.— P. 414—429.
4. Benya P. D., Padilla S. R. II Exp. Cell Res. — 1993. — Vol. 204, N 2. — P. 268—277.
5. Bujia Siitinger М., Wilmes E., Hammer С. II Acta otolaryng. (Stockh.)— 1994.—Vol. 114, N 5.— P. 539—543.
6. Butler M. G., Dahir G. A., Schwartz H. S. II Cancer Genet. Cytogenet. — 1993. — Vol. 66, N 2. — P. 108—112.
7. Centrella W., McCarthy T. L., Canalis E. II J. biol. Chem. —
1987. —N 262, —P. 2869—2874.
8. Chandrasekhar S., Harvey A. K., Johnson M. G., Becker G. W. II Biochim. biophys. Acta. — 1994. — Vol. 1221, N 1. — P. 7—14.
9. Chen T. L., Chang L. Y., DiGregorio D. A. et al. // Endocrinology. — 1993, — Vol. 133, N 3, —P. 1382—1389.
10. Corral D. A., Sicker D. C., Salup R. R. II Proc. Ann. Meet. Am. Ass. Cancer Res. — 1994. — Vol. 35. — P. A 1669.
11. Davis R. II J. biol. Chem.— 1988, — Vol. 263, N 19. — P. 9462—9469.
12. Duda R. B., Cundiff D„ August C. Z. et al. // Cancer. — 1993. — Vol. 71, N 11, —P. 3526—3530.
13. Durham S. K., Riggs B. L., Conover С. A. II J. chin. Endocr. Metab. — 1994. — Vol. 79, N 6. — P. 1752—1758.
14. Fang M. A., Kujttbu D. A., Halm T. J. II Endocriniligy. — 1992. — Vol. 131, N 5.— P. 2113—2119.
15. Franchimont P., Bassleer С. НУ Rheumatol. Suppl. — 1991. — Vol. 27.— P. 68—70.
16. Guerne P. A., Sublet A., Lotz M. // J. cell. Physiol. — 1994. — Vol. 158, N 3. — P. 476—484.
17. Harrisson E. Т., Luyten F. P., Reddi A. H. H Exp. Cell Res. —
1991, —Vol. 192, N 2.— P. 340—345.
18. Holly R. W., Bohlen P., Fava R. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. — 1980. — Vol. 77. — P. 5989—5992.
19. Hosot K„ Eddin М. II Ibid. — 1989. — Vol. 103, N 6 — P. 87—94.
20. Howard G. A., Spencer E. А/. Endocrine Controle of Bone and Colcium Metabolism, Eds D. V. Cohn et al. — Elsevier, —
1984. — P. 129—130.
21. Jakowlew S. B., Cubert J., Danielpour D. et al. И J. cell. Physiol. —
1992.— Vol. 150, N 2.— P. 377—385.
22. Jones C. M.. Lyons K. M.. flagan B. L. M. II Development. —
1991, — Vol. 111. —P. 531—542.
23. Ignotz R. A.. Massague J. II Ibid. — 1985. — Vol. 82. — P. 8530—
8534.
24. Kasugai S.. Zhang Q., Overall C. M. et al. // Bone Miner. —
1991, —Vol. 13, N 3. — P. 235—250.
25. Kawase T., Orikasa M.. Suzuki A. II Pharmacol. Toxicol.— 1991. Vol. 69, N 5.— P. 330—337.
26. Kinoshila A., Takigawa M., Suzuki F. II Biochem. biophys. Res. Commun.— 1992. — Vol. 183, N 1. — P. 14—20.
27. Klijn J. G., Berns P. M., Schmitz P. M., Schmitz P. I., Foekens J. A. II Endocr. Rev. — 1992. — Vol. 13, N 1. — P. 3—17.
28. Komm B. S., Terpening C. M., Benz D. J. et al. // Science. —
1988.— Vol. 241, N 4861, —P. 81—84.
29. Lazarus D. D., Moldawer L. L„ Lowry S. F. II Lymphokine Cytokine
Res. — 1993. — Vol. 12, N 4. — P. 219—223.
30. Van Leeuven J. P., Pols H. A., Schilte J. P. et al. // Calcif. Tiss.
Int. — 1991, —Vol. 49, N 1, —P. 35—42.
31. Li N., Shen L. H., Zhu Q F. II Chung, hua Ping, Li. Hsueh. Tsa. Chin. — 1994.—Vol. 23, N 1, —P. 37—39.
32. Liesveld J. L.. Rush S., Kempski M. C. et al. // Exp. Hemat. — 1993, — Vol. 21, N 10, —P. 1342—1352.
33. Lippman M. E., Dickson R. B., Gellman E. P. et al. // Steroid Biochem.— 1988.— Vol. 30, —P. 53—61.
34. Lotz M., Terkeltaub R., Villiger P. M. II J/ Immunol. — 1992. —
Vol. 148, N 2. — P. 466—473.
35. Lyons K. M., Pelton R. W., Hogan B. L. M. II Development. —
1990, —Vol. 109, —P. 833—844.
36. Maier R., Ganu V., Lotz M. II J. biol. Chem. — 1993. — Vol. 268, N 29.— P. 21527—21532.
37. Massague J. II Progr. med. Virol. — 1985. — Vol. 32. — P. 142—158.
38. Massague J., Cheifetz S., Endo T., Nadal—Ginard B. II Ibid. — 1986. — Vol. 83.— P. 8206—8210.
39. Matsuda N.. Kumar N. M., Ramakrishnan P. R. et al. // Arch. Oral. Biol. — 1993, —Vol. 38, N 7. — P. 559—569.
40. Mitchell P. G„ Cheung H. S. II J. cell. Physiol. — 1991. — Vol. 149, N 1, —P. 132—140.
41. Mohan S., Baylink D. J. II Clin. Orthopaed. Related Res. — 1992. —
Vol. 263 N 2, —P. 30—43.
42. Moses H. L., Branum E. L., Proper J. A., Robinson K. A. II Cancer Res.—1981, —Vol 41, —P. 2482—2848.
43. Moses H. L., Tucker R. F., Leof E. B. et al. // Cancer cells/Eds J. Feranisco, B. Ozanne, C. Styles. — Spring Harbor., 1985.— Vol. 3. —P. 65—71.
44. Munch R. R„ Lloyd B. A., Estes K. et al. // Proc. Nebr. Acad. Sei.— 1992, —P. 63.
45. Naegele R. J., Yee J. A., Llod B. A., McGuire M. H. II Ibid.
46. Raile K., Hojlich A., Kessler U. et al. // J. cell. Physiol. — 1994. — Vol. 159. N 3. — P. 531—541.
47. Rayan V., Hardingham T. II Matrix Biol. — 1994. — Vol. 14, N 3. — P. 263—271.
48. Ren W., Kinniburgh A. J.. Dziak R. II Calcif. Tiss. Int. — 1992. — Vol. 50.— P. 372—377.
49. Roberts A. B.. Anzano M. A.. Lamb L. C. et al. // Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1981.— Vol. 78. — P. 5339—5343.
50. Roberts A. B., Anzano M. A., Wakeßcld L. M. et al. // Ibid. —
1985.— Vol. 82.— P. 119—123.
51. Rook A. M., Kehrl J. H., Wakefield L. M. et al. // J. Immunol. —
1986.— Vol. 136, —P. 3616—3620.
52. Salomon D. S., Kim N., Saeki T., Ciardiello F. II Cancer Cell. —
1990.— Vol. 2, N 12.— P. 357—361.
53. Sampath T. K., Muthukumaran N.. Reddi A. H. II Proc. nat Acad. Sci. USA. — 1987.—Vol. 84. — P. 7109—7113.
54. Satake T. II Kanagava Scigacu. — 1990. — Vol. 24, N 4. — P. 692—701.
55. Segedin S. M., Thomson A. Y., Bentz I. et al. II J. biol. Chem. —
1986.— Vol. 261, —P. 5693—5695.
56. Stephan E. B„ Dziak R. // Calcif. Tiss. Int.— 1994.— Vol. 54, N 5 —P. 409—413.
57. Tada K., Fukunaga T., Wakabayashi Y. et al. // Biochim. biophys. Acta. — 1994, — Vol. 1201, N 2. — P. 135—142.
58. Takaoka K, Yoshikawa H., Masuhara K. et al. // Chin. Orthop. —
1989, —Vol. 244, —P. 258—264.
59. Takigawa M., Kinoshita A., Enomoto M. et al. // Endocrinology. —
1991, —Vol. 129, N 2.— P. 868—876.
60. Tamura M. II Kokubyi. Gakkai. Zasshi.— 1991. — Vol. 58, N 1. —P. 284—299.
61. Tibbets L. M. II Proc. ann. Meet. Am. Ass. Cancer Res.—
1993. — Vol. 34, —P. A206.
62. Tsukamoto T„ Matsui T„ Takaishi T. et al. // Cell. Growth Differ. — 1994. — Vol. 5, N 2. — P. 207—212.
63. Urist M. R., Grant T. 7., Lindholm T. S. et al. // J. Bone Jt Surg. — 1979, —Vol. 61, —P. 1207—1216.
64. Verschure P. J., Joosten L. A., van der Kraan P. M., van den Berg W. B. II Ann. rheumat. Dis. — 1994. — Vol. 53, N 7.— P. 455—460.
65. Vukicevic S., Kleinman H. K., Luyten F. P. et al. // Exp. Cell Res.— 1992.—Vol. 202, N 1, —P. 1—8.
66. Vivien D., Galera P., Loyau G„ Pujol J. P. II Eur. J. cell. Biol. —
1991, — Vol. 54, N 2, —P. 217—223.
67. Walter M. M„ Kragel P. J., Trahan T. et al. // Endocrinology. —
1992, —Vol. 131. N 5, —P. 2263—2270.
68. Wigzell C. II U. K. Diss. Abstr. Int. [B], — 1991,— Vol. 52, N 6. —P. 2946.
69. Wozney J. M. II Prog. Growth Factor Res. — 1989.— Vol. 1, —P. 267—280.
70. Wozney J. M., Rosen V., Byrne M. et al. // J. Cell Sci. Suppl. —
1990, —Vol. 13, —P. 149—156.
71. Yamada K., Yoshitake Y., Norimatsu H., Nishikawa K. II Cell. Struct. Funct. — 1992, — Vol. 17, N 1, —P. 9—17.
72. Yoshikawa //., Rettig W. J., Takaoka K., Alderman E. et al. // Cancer.— 1994.— Vol. 73, N I. —P. 85—91.
73. Yoshikawa H.. Takaoka K., Hamada H., Ono K. // Ibid. —
1985. — Vol. 56.— P. 1682—1687.
74. Yoshikawa H., Takaoka K., Hashimoto K. et al. / Frontiers in osteosarcoma research / Ed. J. Novak. New York, 1991. — P. — 125—135.
75. Yoshikawa 11., Takaoka K, Masuliara K. et al. // Cancer. —
1988. — Vol. 61, —P. 569—573.
76. Ysart G. E., Mason R. M. II U. K. Biochem. J. — 1994.—
Vol. 303, Pt 3. — P. 713—721.
77. Yudoh K., Matsui 11., Kanamori M. et al. // lap J. Cancer.
Res. — 1994. Vol. 85, N 1, —P. 63—71.
78. Zhang W., Dziak R. M.. Aletta J. M. II J. cell. Physiol. —
1995. — Vol. 162, N 3. — P. 348—358.
nocTynnjia 19.10.95/Submitted 19.10.95
