CC BY
49
УДК 535.321
ЛОКАЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ СВЕТА ДНК
B.C. Горелик, A.C. Крылов, В. П. Свсрбштъ
Зарегистрированы спектры комбинационного рассеяния света твёрдотельной фазы дезоксирибонуклеиновой кислоты в широком диапазоне частот: от 7 до 4000 смГ1. Обнаружено, что в области низких частот присутствует интенсивная, полоса с максимумом вблизи 26 см-1, которая, на порядок интенсивнее полос в средней и высокочастотной областях. Эта интенсивная, низкочастотная, полоса соответствует колебаниям пар комплементарных нуклеиновых оснований. В диапазоне средних частот (600-1800 смГ1) присутствует ряд резких линий, соответствующих внутримолекулярным модам, нуклеиновых оснований.
Ключевые слова: комбинационное рассеяние, лазер, спектр, колебания, нуклеиновые основания, низкочастотная мода.
Введение. Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) П р еД1^С TäBJI Я6 Т собой двойную спираль, упакованную в различные пространственные структуры. Молекула формируется из двух цепей сахарофосфатньтх нитей, соединённых между собой парами комплементарных нуклеиновых оснований [1]. Нуклеиновые основания соединены между собой в длинные полину клеотидные цепи. Эти цепи в подавляющем большинстве случаев (за исключением некоторых вирусов, имеющих одноцепочечный ДНК-геном) попарно объединяются при помощи водородных связей во вторичную структуру. Двойная спираль ДНК стабилизирована водородными связями, расположенными между обращенными друг к другу нуклеиновыми основаниями входящих в неё цепей. В природе эта спираль, чаще всего, является правозакрученной. Ширина двойной спирали составляет 2.2 2.4 нм. длина каждого нуклеотида 0.33 нм [1].
Микроструктура ДНК непосредственно связана со спектрами вторичного излучения. в частности, со спектрами комбинационного рассеяния (KP). Молекулы ДНК мо-
ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail: [email protected].
гут существовать в различных конформациях в зависимости от внешних условий [1]. При переходе из одной конформадии в другую может изменяться колебательный спектр молекулы ДНК. Это изменение можно обнаружить по изменению спектров комбинационного рассеяния света.
В работах [2 6] были получены спектры КР ДНК теленка в водном растворе в области 600-1800 см-1. В работе [7] зарегистрированы спектры КР А- и В-форм ДНК в виде
водного геля в области 50-300 см 1. В работах [8-11] был исследован вид спектров КР
-1
-1
При этом мощность возбуждающего излучения на образце составляла 200 мВт.
В работе [13] исследовались низкочастотные спектры КР ДНК в виде кристаллических тонких пленок. Авторы работы [14] изучали низкочастотные колебания другой биологической молекулы глицина.
В цитируемых работах спектры КР ДНК регистрировались от достаточно большого объёма образцов. Отметим, что до настоящего времени не было получено информации о полном спектре КР ДНК в широком спектральном диапазоне, включающем как низкочастотную область, так и область частот внутренних колебаний молекулярных групп, входящих в состав ДНК. Кроме того, не выполнялись исследования локальных
спектров КР ДНК. полученных методом микроскопии КР. В данной работе ставилась
-1
пространственным разрешением (7 мкм).
На рис. 1 приведена блок-схема используемой установки. В качестве источника излучения (1) использовался аргоновый лазер с длиной волны генерации Л = 514.5 нм, работающий в непрерывном режиме с максимальной мощностью 15 мВт. После системы поворотных зеркал (2. 3) и делителя (4) лазерное излучение с помощью микрообъектива (5) фокусировалось на образце (6). Использовался 50-кратный объектив (/ = 0.8 мм) с численной апертурой 0.75. Размер пятна возбуждающего излучения на волокнах ДНК составлял 7 мкм. В качестве объекта исследования была выбрана ДНК теленка в виде высушенных волокон (приготовлена по методике [15]).
Рассеянное излучение регистрировалось в обратном направлении (180-градусная геометрия) с использованием объектива (5), поворотного зеркала (7) и линзы (8). Спектры регистрировались при Т = 23 °С на тройном монохроматоре (9) НопЬа ,1оЫп \7уоп Т64000. В качестве приёмника излучения использовалась ССБ-матрица (10). сигнал с которой обрабатывался компьютером (11). Для получения спектров КР в качестве
и
Рис. 1: Оптическая схема эксперимента: I - лазер, 2, 3 7 - зеркала, 4 - светоделитель, 5 - объектив микроскопа, Q - образец, 8 - линза, 9 - монохроматор, 10 -CCD-матрица, 11 - компьютер.
источника возбуждения было использовано излучение 514.5 нм Аг+ лазера (Spectra Physics Stabilité 2017) мощностью 0.2 мВт на образце, что соответствует плотности лазерного излучения 500 Вт/см2. С целью максимального ослабления крыла упругого рассеяния для получения низкочастотных спектров использовался режим тройного мо-нохроматора со сложением дисперсии, при этом спектральное разрешение составляло 2 см-1, что соответствует использованию дифракционных решёток 1800 штрихов/мм и ширине входной щели 0.1 мм.
На рис. 2 приведена микрофотография участка волокна ДНК, с которого была произведена регистрация спектра КР. Время накопления полного спектра составляло около трёх часов.
Зарегистрированный спектр КР в диапазоне 7-4000 см-1 от участка, показанного в виде светлого пятна на рис. 2, приведен на рис. 3. Как видно из этого рисунка, спектр КР состоит из ряда полос и резких линий, находящихся в различных спектральных диапазонах: в низкочастотной области колебаний молекулярных групп, входящих в состав ДНК, в диапазоне частот внутримолекулярных мод этих групп, а также в высокоча-
(а) (Ь)
Рис. 2: Фотографии участка волокна ДНК, с которого был зарегистрирован спектр КР (середина изображения); (а) размер по горизонтали 700 мкм, (Ь) размер по горизонтали 140 мкм, размер лазерного пятна при съемке 7 мкм.
26
°0 1000 2000 3000 4000
V, сш-1
Рис. 3: Спектр КР ДНК телёнка в виде волокон при Т = 23 °С в широком диапазоне 7-4000 см-1.
стотной области, соответствующей колебаниям СН-группы. В области низких частот -1
ет интенсивность полос, соответствующих внутримолекулярным колебаниям нуклеино-
вьтх оснований и Сахаров. В области высоких частот присутствует хорошо выраженная полоса с максимумом 2956 см-1, соответствующая колебаниям СН-группы.
Таблица 1 Относительные интенсивности линий в спектре КР ДНК
Частоты пиков Интенсивности Частоты пиков Частоты пиков Отнесение
в спектре пиков в спектре КР в спектре КР колебаний
КР ДНК, (наши A-формы ДНК. В-формы ДНК. [4]*
см-1 (наши данные) см"1 [4] см-1 [4]
данные)
26 670 А-Т, Г-Ц
327 10 335 329 А
386 8 394 390 d
497 12 499 499 Г; Т
534 7 537 535 А
593 4 592 595 Ц;Г
625 3 622 А; Ц; Т
645 4 642 643 А;Ц
666 10 663 669 Т; Г; А
682 9 682 681 Г
729 20 727 729 А
743 И 748 751 Т; d
783 43 781 787 д
1012 13 1011 1013 d
1060 15 1055 1054 d(CO)
1100 23 1099 1094 d(PO")
1181 20 1182 1182 Т;Ц
1243 44 1243 1237 Т
1308 43 1301 1304 А
1335 55 1336 1339 А
1372 53 1373 1376 Т; А; Г
1418 29 1418 1422 Т; d(CH2)
1460 22 1461 1463 d(CH2)
Таблица 1 (продолжение)
Частоты пиков Интенсивности Частоты пиков Частоты пиков Отнесение
в спектре пиков в спектре КР в спектре КР колебаний
КР ДНК, (наши А-формы ДНК, В-формы ДНК, [4]*
см-1 (наши данные) см-1 [4] см-1 [4]
данные)
1484 50 1483 1489 А; Г
1508 18 1512 1511 А
1528 14 1537 1538 Ц
1577 53 1574 1577 Г; А
1664 28 1669 1669 Т; Г(С=0)
2892 6 2894 2896 с!(СН)
2957 17 2950 2964 с!(СН)
2968 <1(СН)
* А - аденозин, Г - гуанин, Т - тимидин, Ц - цитозин, с1 - дезоксирибоза сахарофос-фатного остова.
70
60
. 50 с з
-о 40
&
^ 30 20 10
Г\ _I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_
0 40 80 120 160
V, ст_1
Рис. 4: Спектр КР ДНК телёнка в виде волокон при Т = 20 °С в диапазоне 7-200 см-1.
На рис. 4 приведен низкочастотный спектр в диапазоне 7-200 см-1. Как видно из
этого рисунка, в области низких частот присутствует интенсивная полоса с максимумом -1 -1
26
1335
1372
J_I_I_I_I_I_I_I_I_I_с
800 1600 2400
V, сггг1
Рис. 5: Спектр КР ДНК телёнка в виде волокон при Т = 20 °С в диапазоне 20032000 см-1.
В диапазоне средних частот (600-1800 см-1) присутствует ряд резких линий (рис. 5), соответствующих внутримолекулярным модам нуклеиновых оснований. Данные о частотах и относительных интенсивностях линий в зарегистрированном нами спектре КР приведены в табл. 1. Для сравнения приводятся данные о соответствующих частотах и типах колебаний, взятые из работы [4].
Для анализа колебаний молекулы ДНК предлагались различные модели [16-19].
-1
[16, 17], соответствует "твист'-модам комплементарных пар нуклеиновых оснований.
Такое предположение представляется естественным, поскольку "твист'-моды характеризуются большой амплитудой и малым затуханием. Таким образом, интенсивность "твист'-мод является наибольшей.
Таким образом, в данной работе были зарегистрированы спектры комбинационного рассеяния света твёрдотельной фазы ДНК в широком диапазоне частот: от 7 до -1
-1
превышает интенсивность максимумов в средней и высокочастотной областях. Эта полоса соответствует колебаниям пар комплементарных нуклеиновых оснований, распо-
ложенных в соседних цепях ДНК. В диапазоне средних частот (600-1800 см-1) присутствует ряд резких линий, соответствующих внутримолекулярным модам нуклеиновых
оснований. В высокочастотной области обнаруживается полоса с максимумом вблизи -1
тистически значимых различий.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты ЖД"2 13-02-90420. 13-02-00449).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Биофизика. Под ред. П. Г. Костюка (Киев. Вытца ттткола. 1988).
[2] S. С. Erfurth, W. L. Peticolas, Biopolymers 14, 247 (1975).
[3] Ruixin Dong. Xunling Van, Xiaofeng Pang. Shenggang Liu. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 60(3), 557 (2004).
[4] B. Prescott. W. Steinmetz, G. J. Thomas. Jr.. Biopolymers 23. 235 (1984).
[5] John G. Duguid. Victor A. Bloomfield, James M. Benevides. George J. Thomas. Jr.. Biophysical J. 71, 3350 (1996).
[6] С. M. Muntean, G. M. J. Segers-Xolten, Biopolymers 72, 225 (2003).
[7] Om. P. Lamba, A. H.-J. Wang, George J. Thomas Jr., Biopolymers 28(2), 667 (1989).
[8] H. Urabe and Y. Tominaga, Biopolymers 21, 2477 (1982).
[9] S. M. Lindsay, S. A. Lee, J. W. Powell, et al., Biopolymers 27, 1015 (1988).
[10] Hisako Urabe, Yasunori Tominaga, and Ivenji Ivubota, J. Chem. Phys. 78(10), 5937 (1983).
[11] C. Demarco, S. M. Lindsay, M. Pokorny, et al., Biopolymers 24, 2035 (1985).
[12] Paul C. Painter, Lue Mosher, Carol Rhoads, Biopolymers 20, 243 (1981).
[13] H. Urabe, Y. Sugawara, M. Ataka and A. Rupprecht, Biophysical Journal 74, 1533 (1998).
[14] X. V. Surovtsev, V. Iv. Malinovsky, and E. V. Boldyreva, Journal of Chemical Physics 134, 045102 (2011).
[15] A. A. Akhrem, V. P. Egorova, A. S. Egorov, et al., Biopolymery i Ivletka 5(5), 44 (1989).
[16] Ivuo-Chen Chou, Biochem. J. 221, 27 (1984).
[17] Ivuo-Chen Chou, Gerald M. Maggiora, Boryeu Mao, Biophys. J. 56, 295 (1989).
[18] S. X. Volkov, A. M. Ivosevich, G. E. Wainreb, Biopolimery i Ivletka 5(6), 32(1989).
[19] S. M. Perepelytsya, S. X. Volkov, Eur. Phys. J. 24, 261 (2007).
Поступила в редакцию 5 мая 2014 г.
