CC BY
75
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 3 (1), с. 138-144
УДК 57.576.315.42
ЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКА P53 ВО ФРАКЦИЯХ ХРОМАТИНА И ПРЕПАРАТАХ ЯДЕРНОГО МАТРИКСА КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
© 2011 г. М.А. Лапшина, И.И. Пархоменко, А.А. Терентьев
Институт проблем химической физики РАН, г. Черноголовка lapshina@icp .ac.ru
Поступила в редакцию 24.01.2011
Белок р53, эволюционно консервативный опухолевый супрессор, может ассоциировать с ядерным матриксом. Проведены фракционирование ядер и очистка ядерного матрикса из клеток нескольких типов и исследовано содержание белка р53 во фракциях клеточного ядра. Показано, что локализация р53 во фракциях хроматина и степень его ассоциации с ядерным матриксом зависят от типа клеток.
Ключевые слова: ядерный матрикс, фракционирование хроматина, р53.
Введение
Ядерный матрикс (ЯМ) включает в себя внутриядерную фибриллярную или фиброгранулярную сеть, периферическую ламину с по-ровыми комплексами и остаточное ядрышко. Компоненты ЯМ включают белки ядерных телец, регуляторы клеточного цикла, тканеспецифичные транскрипционные факторы, факторы сплайсинга РНК, а также ферменты и белки, ответственные за апоптоз [1].
Известно, что многие факторы транскрипции могут связываться с компонентами ЯМ, например, в ЯМ обнаружены белки ОСТ-1, SP-1, YY-
1, ATF, базальный фактор транскрипции TFIID и многие другие [2]. В клеточном ядре, подобно другим факторам транскрипции, белок р53 обнаруживается в компартменте ЯМ. Депперт с соавторами идентифицировали белок р53 в ассоциации с ЯМ в клеточных линиях, трансформированных вирусом SV40, а также в нетранс-формированных клетках [3]. Джианг М. с соавторами показали, что р53 связывается с ЯМ в нетрансформированных клетках человека и животных и что эта ассоциация возрастает при повреждениях ДНК [4].
Опухолевый супрессор белок р53 активируется при повреждениях ДНК, транспортируется в ядро и регулирует транскрипцию своих генов-мишеней. Продукты этих генов вовлечены во многие клеточные процессы, такие как остановка клеточного цикла, репарация ДНК, апопотоз, ингибирование ангиогенеза [5]. Мутации и де-леции гена р53 наблюдаются в ~50% случаев злокачественных заболеваний человека. В результате различных мутаций гена р53 белок р53 утрачивает способность специфично взаимодействовать с ДНК и регулировать гены, которые участвуют в остановке клеточного деления
или в индукции апоптоза. Таким образом, белок p53 является главным компонентом механизма, который отвечает за защиту организма от возникновения и распространения мутаций, то есть за поддержание стабильности генома [б].
В данной работе представлены результаты изучения локализации белка p53 в различных фракциях хроматина и его ассоциации с ЯМ в клетках разных типов. Показано, что степень ассоциации белка p53 с ЯМ, т.е. его относительное содержание в растворимых (матрикс-несвязанных) фракциях хроматина и в ЯМ, различна и зависит от типа клеток. Важно отметить, что от типа клеток зависит не только степень ассоциации белка p53 с ЯМ, но и устойчивость самого ЯМ к процедурам экстракции мат-рикснесвязанного хроматина.
Экспериментальная часть
Клеточная культура. Эксперименты проводили на клеточных культурах различных типов: НЕК293 - клетки почечного эпителия эмбрионов человека, трансформированные фрагментом генома аденовируса 5 серотипа; HeLa - аденокарцинома шейки матки человека; MCF-7 -аденокарцинома молочной железы человека; COS-7 - фибробластоподобные клетки почки африканской зеленой мартышки, трансформированные большим Т-антигеном вируса SV-40. Клеточные культуры выращивали в атмосфере 5% CO2 в среде DMEM, содержащей 10%-ную сыворотку новорожденных телят (PAA Laboratories).
Антитела. Первичные антитела: поликлональные кроличьи антитела против белка p53 (Santa Cruz Biotechnology, США). Вторичные антитела: козьи антитела против кроличьих IgG,
конъюгированные с пероксидазой хрена (Amer-sham Biosciences, США).
Получение ядерного и цитозольного экстрактов. Клетки были собраны с помощью трипсина, промыты в растворе 1*PBS и лизиро-ваны в буфере А (10 мМ Hepes (pH 7.9), 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0.1% NP-40, 0.5 мМ ДТТ) при +4°C в течение 10 мин. Цитозольный экстракт был получен после центрифугирования суспензии при 9000 g в течение 20 мин. Осадок был повторно ресуспендирован в буфере А с последующим центрифугированием при тех же условиях. Промытый осадок ресуспендировали в буфере С (20 мМ Hepes (pH 7.9), 25%-ный глицерин, 1.5 мМ MgCl2, 420 мМ NaCl, 0.2 мМ ЕДТА, 0.5 мМ ФМСФ, 0.5 мМ ДТТ) и инкубировали при перемешивании при +4oC в течение 30 мин. Ядерный экстракт был получен после центрифугирования суспензии при 9000 g в течение 20 мин [7].
Очистка ядер. Ядра были очищены по методу Рубина и Хилла [В] с небольшими модификациями. Клетки были собраны с использованием трипсина, затем были промыты в растворе 1*PBS и ресуспендированы в буфере 0.25 STC (0.25 М сахароза, 50 мМ Трис-HCl (pH 9.0), 5 мМ CaCl2, 20 мМ NH4Cl, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ), который содержал 0.2% тритон X-100. Суспензию клеток наслаивали на подушку -буфер 1 STC, идентичный буферу 0.25 STC, но содержащий 1 М сахарозу. Центрифугировали при 900 g в течение 10 мин. Затем проводили повторную отмывку суспензии через подушку -буфер 1 STC и две отмывки без подушки в буфере 0.25 STC при тех же условиях центрифугирования. Концентрацию хроматина определяли спектрофотометрически при длине волны 2б0 нм.
Получение ЯМ методом Штауфенбиля и Депперта [9]. Вначале ядра подвергались нук-леазной обработке, а затем для экстракции мат-рикснесвязанного хроматина применяли 2 M NaCl, поэтому этот способ получения ЯМ условно обозначен как метод DN (DNase - NaCl).
Очищенные ядра ресуспендировали в нукле-азном буфере (0.25 М сахароза, 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ) до концентрации хроматина б мг/мл и добавляли ДНКазу I (SERVA) до концентрации 250 едениц фермента на 1 мг хроматина. Нуклеазная обработка хроматина проводилась при +4°C в течение 30 мин. Нуклеазная фракция (фракция «Н») была отобрана после центрифугирования при 1200 g в течение 5 мин. Осадок был промыт в буфере TM (10 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 0.2 мМ MgCl2, 2 мМ ФМС, 1 мМ ДТТ), и после центрифугирования при 1200 g в
течение 5 мин супернатант был собран как отмывочная фракция (фракция «ТМ»). Далее осадок ресуспендировали в ТМ буфере, содержащем 2 M NaCl, с последующим центрифугированием при 1400 g в течение 10 мин. Супернатант был собран как высокосолевая фракция (фракция «ВС»). Осадок был промыт в буфере ТМ, супернатант был собран как фракция отмывки (фракция «О»). Затем осадок повторно промывали буфером ТМ, после центрифугировали при 1400 g в течение 5 мин. Конечный осадок - ядерный матрикс - ресуспендировали в 100-200 мкл буфера TM и использовали для дальнейших процедур.
Получение ЯМ методом Хе и Никерсона. Согласно данному методу [10], матрикснесвязан-ный хроматин экстрагировали с использованием сернокислого аммония после обработки хроматина ДНКазой I, поэтому этот способ получения ЯМ условно обозначен как метод DA (DNase - ammonium sulfate).
Нуклеазная обработка ядер проводилась как указано выше. После обработки ДНКазой I в суспензию ядер по каплям добавляли 1 M (NH4)2SO4 до конечной концентрации 0.25 M. Далее суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и после центрифугирования при 1400 g в течение 10 мин супернатант был собран как нуклеазно-высокосо-левая фракция (фракция «НВС»). Осадок был промыт в буфере ТМ, супернатант был собран как фракция отмывки. После повторной промывки буфером ТМ получали конечный осадок - ЯМ.
Получение ЯМ методом Березни и Коффи. Оригинальный метод Березни и Коффи основан на том, что высокосолевая экстракция хроматина предшествовала нуклеазной обработке [11], поэтому условно этот способ обозначили как метод ND (NaCl - DNase).
Очищенные ядра ресуспендировали в буфере ТМ, который содержал 1.5 M NaCl до концентрации хроматина 6 мг/мл. Затем суспензию инкубировали при +4°C в течение 5 мин, центрифугировали в течение 20 мин при 1400 g, и супернатант был собран как высокосолевая фракция (фракция «ВС»). Осадок был промыт в буфере TM и после центрифугирования при 1400 g в течение 10 мин супернатант был собран как первая фракция отмывки (фракция «ТМ»). Далее проводили нуклеазную обработку ядер как указано выше, после этого суспензию центрифугировали при 1400 g в течение 10 мин и супернатант был собран как нуклеазная фракция. Осадок был промыт в буфере ТМ, супернатант был собран как фракция отмывки. После
а р53-
ц я ця
НЕК293 HeLa
Я н тмвс о ям
б р53-
г р53-
тт *J
Я НДС О ям
— т\
Я ВС ТМ Н О ям
*
Рис. 1. Содержание белка p53 в цитозольном, ядерном экстрактах и в ядерных фракциях. а - Содержание белка p53 в цитозольном и ядерном экстрактах клеток НЕК293 и HeLa, Ц - цитозольный экстракт, Я - ядерный экстракт; б, в, г - содержание белка p53 в очищенных клеточных ядрах (Я), растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса (ЯМ), полученных методами «DN» (б), «DA» (в) и «ND» (г) из клеток НЕК293 in vitro
повторной промывки буфером ТМ получали конечный осадок - ЯМ.
Электрофорез белков в ПAAГ и иммунобло-тинг. Содержание количества белка в клеточных лизатах, ядрах, препаратах ЯМ и фракциях матрикснесвязанного хроматина определяли методом Лоури. Белки подвергали денатурирующему электрофорезу в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Перенос белков с гелей на нитроцеллюлоз-ную мембрану Hybond-C Extra (Amersham Biosciences, Великобритания) осуществляли в буфере для переноса (25 мМ Трис-HCl, 19.3 мМ глицин, 20%-ный метанол) при +4°C и силе тока в 100 мA в течение 1б ч. После переноса мембрану инкубировали в блокирующем растворе, содержащем буфер ТBST (100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 0.1% Tween-20), 5% бычий сывороточный альбумин и 0.02% NaN3, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембрана инкубировалась в блокирующем растворе, содержащем первичные антитела в разведении 1:1000 в течение 1 ч, и промывалась буфером TBST трижды по 10 мин. Далее мембрана инкубировалась в блокирующем растворе без 0.02% NaN3, содержащем вторичные антитела в разведении 1:5000, и промывалась TBST трижды по 10 мин. Реакцию хемилюминесценции проводили с использованием смеси ECL растворов: в 14 мл раствора А (100 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 1.25 мМ люминол) добавляли 140 мкл раствора В (0.бВ мМ Н-гидрокумаровая кислота в DMSO) и 5 мкл 30% H2O2. Мембрану инкубировали в реакционной смеси в течение 1 мин, а
затем сигнал экспонировали на рентгеновскую пленку.
Результаты и их обсуждение
Для изучения степени ассоциации белка р53 с ЯМ в клетках различных типов сравнивали его содержание не только в конечных препаратах ЯМ, но и во фракциях матрикснесвязанного хроматина. В клетках НЕК293 р53 экспрессируется на высоком уровне и локализуется главным образом в ядре, но не вызывает гибель клеток, так как эта культура трансформирована ДНК аденовируса Ad5. На рис. 1а показано содержание белка р53 в цитозольном и ядерном экстрактах клеток НЕК293 и клеток HeLa. Из рисунка видно, что в клетках HeLa белок р53 локализован преимущественно в цитозоле. В клетках НЕК293 белок р53 практически полностью присутствует в ядре.
Из рис. 1б видно, что при получении ЯМ с использованием 2 М №С1 после гидролиза ДНК (метод получения ЯМ «Э№>) белок р53 регистрируется в ядрах и в препарате ЯМ и практически отсутствует в растворимых фракциях Н, ТМ, ВС и О. Применение в качестве экстрагирующего агента сульфата аммония (метод получения ЯМ «ЭА») приводит к получению другой картины распределения р53 по фракциям хроматина. Из рис. 1в видно, что при этом р53 регистрируется в ядрах и в ЯМ, однако в значительной мере он присутствует также и во фракциях матрикснесвязанного хроматина - нукле-азно-высокосолевой фракции НВС и во фракции отмывки О. При использовании хлорида натрия до гидролиза ДНК (метод получения ЯМ
ДДТМ ВС Д Я1\Л
а р53— •г ~ в
Я НВС 0 ям
б р53—
Я ВС ТМ Н 0 ям 1 1 1 II II II III
в р53— • Г» ’ ' ' - ^ W ш «- - --
Рис. 2 Содержание белка p53 в очищенных клеточ- Рис. 3 Содержание белка p53 в очищенных клеточных ядрах (Я), растворимых фракциях хроматина и ных ядрах (Я), растворимых фракциях хроматина и
препаратах ядерного матрикса (ЯМ), полученных препаратах ядерного матрикса (ЯМ), полученных
методом «DN» (а), «DA» (б) и «ND» (в) из клеток методом «DN» (а) и «DA» (б) из клеток COS-? in
MCF-? in vitro vitro
«N0») р53 присутствует в ядрах, ЯМ, а также определенная доля белка выходит в высокосолевую фракцию ВС (рис. 1г).
Видно, как метод получения фракций хроматина и ЯМ влияет на картину фракционирования внутриядерного пула белка р53. Согласно данным, полученным нами ранее, в тех же фракциях хроматина клеток НЕК293 при использовании тех же методов фракционирования ядра обнаруживается и один из характерных белков ЯМ, ламин В [12]. Таким образом, наблюдается солокализация белка р53 и компонентов ЯМ и, несмотря на присутствие в растворимых фракциях хроматина, можно сделать вывод о том, что ядерный пул белка р53 в клетках НЕК293 ассоциирован с ЯМ.
Известно, что в клетках НЕК293, трансформированных ДНК аденовируса, р53 взаимодействует с аденовирусными белками [13], что, в свою очередь, может приводить к нарушению его субъядерной локализации. Для характеристики взаимодействия р53 с ЯМ в клетках, не содержащих вирусных белков, было проведено исследование его субъядерной локализации в клетках MCF-7. В этих клетках белок р53 экспрессируется на низком уровне, и для исследования его ассоциации с ЯМ необходимо его накопление в количествах, достаточных для иммунодетекции. Для индукции накопления р53 проводили обработку клеток MCF-7 актиноми-цином Э, который, как известно, активирует р53 и приводит к повышению его экспрессии [12, 14]. После активации р53 в клетках MCF-7 проводились очистка и фракционирование ядер с использованием тех же методов.
Из рис. 2а видно, что р53 обнаруживается в ядрах и ЯМ при фракционировании хроматина по методу «N0». При фракционировании ядер по методу «ЭА» (рис. 2б) р53 обнаруживается в ЯМ и фракции НВС. В отличие от препаратов,
полученных из клеток НЕК293 (рис. 1в), p53 не обнаруживается в отмывочной фракции хроматина. Некоторые отличия наблюдаются также при сравнении распределения p53 в ядерных фракциях при получении ЯМ методом «ND» из клеток НЕК293 (рис. 1г) и MCF-7 (рис. 2в): видно, что эти белки содержатся во фракции «ТМ», полученной из клеток MCF-7, но не содержатся в этой же фракции из клеток НЕК293.
Несмотря на указанные отличия, внутриядерная локализация белка p53 в клетках MCF-7 принципиально схожа с распределением p53 в ядрах клеток НЕК293: белок ЯМ ламин B был обнаружен в тех же фракциях хроматина клеток MCF-7, что и белок p53 [12]. Полученные данные показывают, что в клетках MCF-7, как и в клетках HEK293, весь ядерный пул белка p53 после его активации актиномицином D ассоциирует с компонентами ЯМ.
Впервые p53 был обнаружен в составе ЯМ в работе Штауфинбиля и Депперта [9] на клетках, трансформированных большим Т-антигеном вируса SV40. В нашей работе проведено исследование взаимодействия белка p53 с ЯМ в сходно трансформированных клетках COS-7. На рис. 3а показано, что p53 регистрируется в ядрах и в препарате ЯМ, полученном методом «DN». В отличие от результатов, полученных на клетках HEK293 и MCF-7, значительная доля p53 экстрагируется в высокосолевую фракцию (ВС), а небольшая часть белка экстрагируется в отмывочную фракцию (О). Сходные результаты получены с применением метода фракционирования «DA». Из рис. 3б видно, что p53 регистрируется в ЯМ и значительная доля его регистрируется во фракции НВС. Данные по локализации ламина B в полученных фракциях ядер COS-7 существенно отличаются от картины локализации белка p53: ламин B обнаруживался исключительно в составе фракции ЯМ [12]. Та-
ким образом, сопоставление данных по локализации белков p53 и ламина B отчетливо доказывает существование в клетках COS-? части ядерного пула белка рЗЗ в матрикснесвязанной форме, т.е. во фракции, в которой отсутствует ламин B.
Раннее нами было показано, что в процессе очистки ЯМ его структурная целостность может нарушаться и компоненты ЯМ могут присутствовать во фракциях, описанных в литературе как фракции матрикснесвязанного хроматина [12]. Полученные ранее и представленные в настоящей работе данные показывают, что для контроля не только целостности ЯМ (т.е. эффективности разделения матрикссвязанных и матрикснесвязанных макромолекул), но и степени ассоциации ядерных белков с ЯМ необходимо изучать содержание во фракциях хроматина как исследуемых белков, так и характерных маркеров ЯМ.
Белковый состав и структурные особенности ЯМ различны в клетках разного происхождения, а его структурная целостность чувствительна к методу фракционирования ядер. Наиболее значительные отличия показаны в чувствительности ЯМ к экстракции сульфатом аммония: в клетках COS-? ламин B обнаружен только в ЯМ, в клетках HEK293 и MCF-? - в ЯМ и растворимой фракции НВС [12]. По-видимому, специфичный для каждого типа клеток белковый состав ЯМ отражается в различной прочности белок-белковых взаимодействий и ЯМ клеток COS-? более устойчив к действию сульфата аммония, чем ЯМ других клеток.
Литературные данные по ассоциации рЗЗ с ЯМ противоречивы. Белок p53 может обнаруживаться как в растворимых матрикснесвязан-ных фракциях, так и в ЯМ. В работе Джианга с соавторами использовался метод, схожий с примененным нами методом «ND», но вместо NaCl авторы экстрагировали матрикснесвязан-ный хроматин 02 М сульфатом аммония до нуклеазной обработки ядер. При этом, помимо ЯМ, часть ядерного пула p53 обнаружена в высокосолевых экстрактах клеток карциномы прямой кишки человека (НСТ110) и эмбриональных фибробластов мыши (MEF), но не обнаруживается в той же фракции нормальных диплоидных фибробластов человека. После обработки MEF цисплатином p53 накапливается, в основном, в высокосолевой фракции матрикс-несвязанного хроматина, а не во фракции ЯМ [4]. Следует отметить, что авторы не представили исчерпывающей картины внутриядерного распределения ламина В при использовании данного метода, в связи с чем однозначно интерпретировать эти результаты затруднительно.
Возможно, регистрация p53 в высокосолевой фракции в данной работе связана с частичным нарушением целостности ЯМ, как это было обнаружено при использовании метода «ND» на клетках НЕК293 и MCF-? [12].
При использовании метода, сходного с методом «DA», Бен-Йехойда с соавторами [1З] обнаружили p53 в ядрах клеток COS-1 (фиб-робласты зеленой мартышки, трансформированные вирусом SV-40) в матрикссвязанной форме в норме, но после обработки клеток цис-платином или после облучения p53 обнаружили также и в матрикснесвязанных фракциях хроматина. Удивительно, но в тех же условиях в ЯМ клеток НСТ116 белок p53 не обнаруживается вовсе.
Из литературы известно, что с ЯМ взаимодействуют факторы транскрипции разных суперсемейств. В ассоциации с ЯМ были обнаружены многие факторы транскрипции: глюко-кортикоидный рецептор [16], факторы ткане-специфичности - Runx2 [1?] и Pit-1 [18], гемо-поэтический фактор транскрипции AML 1 [19], многофункциональный фактор YY1 [20], рецептор витамина D [21] и другие. Факторы транскрипции связываются с ЯМ посредством специфичной последовательности - NMTS (nuclear matrix targeting signal). У некоторых факторов транскрипции последовательность NMTS обнаружена в ДНК связывающем домене. Другие факторы транскрипции имеют отдельный домен с функцией NMTS.
Следует признать, что литературные данные, в которых обсуждаются механизмы взаимодействия p53 с ЯМ, противоречивы и неоднозначны. В работе Джианга [4] сделано предположение о том, что p53 взаимодействует с ЯМ посредством пролинбогатого домена в N-концевой области белка. Также показано, что p53 может взаимодействовать с ядерным актином [22]. В отличие от других факторов транскрипции, которые теряют свою активность в отсутствие NMTS, p53 с делецией пролинбога-того домена может выполнять трансактиви-рующую функцию [23]. Кроме того, ядерный актин, для которого характерно довольно равномерное распределение внутри клеточного ядра [22], может выступать в качестве «якорного» белка ЯМ для p53, скорее, на общем уровне, но не определять специфичную локализацию p53 в определенных локусах клеточного ядра, которая была показана в нескольких работах [24]. Таким образом, в настоящее время остаются открытыми вопросы о домене NMTS и о «якорном» белке ЯМ для p53, и задача исследования деталей и механизмов взаимодействия белка p53 с ЯМ по-прежнему актуальна.
Нами показано, что в клетках НЕК293 и клетках MCF-7 белок p53 постоянно солокали-зуется с ламином B и по наличию p53 в растворимых фракциях нельзя заключить, что он может присутствовать в матрикснесвязанной форме, так как в этих же фракциях присутствует и компонент ЯМ (рис. 1 и 2). В то же время в клетках COS-7 наблюдается неполное связывание ядерного пула белка p53 с ЯМ: белок p53 обнаружен в растворимой фракции, в которой отсутствует ламин B (рис. 3, [12]). Следовательно, в ядрах клеток COS-7 белок p53 существует в двух формах - матрикссвязанной и матрикснесвязанной.
Таким образом, характер распределения белка p53 по фракциям хроматина зависит от способа фракционирования ядер, а степень его ассоциации с ЯМ - от типа клеток.
Список литературы
1. Gajkowska B., Wojewodzka U. A new look at the cellular scaffold by embedment-free electron microscopy method // J. Cell. Mol. Med. 2003. V. 7. № 3. P. 258-264.
2. Съяксте Н.И., Съяксте Т.Г. Факторы транскрипции и ядерный матрикс // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 5. С. 739-749.
3. Deppert W., Haug M. Evidence for free and me-tabolically stable p53 protein in nuclear subfractions of simian virus 40-transformed cells // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. № 6. P. 2233-2240.
4. Jiang M., Axe T., Holgate R., Rubbi C.P., et al. P53 binds the nuclear matrix in normal cells: binding involves the proline-rich domain of p53 and increases following genotoxic stress // Oncogene. 2001. V. 20. P.
5449-5458.
5. Stewart Z.A., Pietenpol J.A. p53 signaling and cell cycle checkpoints // Chem. Res. Toxicology. 2001. V. 14. № 3. P. 243-263.
6. Чумаков П.М. Функция гена p53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. Т. 65. № 1. С. 34-47.
7. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mamalian nuclei // Nucleic Acids Research. 1983. V. 11. P. 1475-1489.
8. Rubin R.W., Hill M.C., Hepworth P., Boehmer J. Isolation and electrophoretic analysis of nucleoli, phenol-soluble nuclear proteins, and outer cyst walls from Acanthamoeba Castellanii during encystation initiation // J. Cell Biol. 1976. V. 68. P. 740-751.
9. Staufenbiel M., Deppert W. Preparation of nuclear matrices from cultured cells: subfractionation of nuclei in situ // J. Cell Biol. 1984. V. 98. P. 1886-1894.
10. He D., Nickerson J.A., Penman S. Core filaments of the nuclear matrix // J. Cell Biol. 1990. V. 110. P. 569-580.
11. Berezney R., Coffey D.S. Nuclear matrix. Isolation and characterization of a framework structure from rat liver nuclei // J. Cell Biol. 19??. V. ?3. P. 616-63?.
12. Лапшина М.А., Пархоменко И.И., Папина Р.И., Терентьев А.А. Содержание ламина В во фракциях хроматина при очистке ядерного матрикса из клеток разных типов // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2008. Т. 146. № 11. С. 313-319.
13. Moran E. Interaction of adenoviral proteins with pRB and p33 // The FASEB J. 1993. V. ?. P. 880-883.
14. Lapshina M.A., Parkhomenko I.I., Terentiev A.A. Two forms of the nuclear matrix-bound p33 protein in HEK293 cells // An. N.Y. Acad. Sci. 2006. V. 1090. P. 1??—181.
13. Ben-Yehoyada M., Ben-Dor I., Shaul Y. c-Abl tyrosine kinase selectively regulates p?3 nuclear matrix association // J. Biol. Chem. 2003. V. 2?8. № 36. P. 344?3-34482.
16. Kaufmann S.H., Okret S., Wikstrom A.C., Gus-tafsson J.A., Shaper J.H. Binding of the glucocorticoid receptor to the rat liver nuclear matrix. The role of disulfide bond formation // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. № 26. P. 11962-1196?.
1?. Zaidi S.K., Javed A., Choi J., Wijnen A., et al. A specific targeting signal directs Runx2/Cbfa1 to subnuc-lear domains and contributes to transactivation of the osteocalcin gene // J. Cell Science. 2001. V. 114. P. 3093-3102.
18. Mancini M.G., Liu B., Sharp Z.D., Mancini M.A. Subnuclear partitioning and functional regulation of the Pit-1 transcription factor // J. Cell Biochem. 1999. V. ?2. P. 322-338.
19. Barseguian K., Lutterbach B., Hiebert S.W., Nickerson J., et al. Multiple subnuclear targeting signals of the leukemia-related AML1/ETO and ETO repressor proteins // PNAS. 2002. V. 99. №. 24. P. 13434-13439.
20. McNeil S.E., Hobson S.A., Nipper V., Rodland K.D. Functional calcium-sensing receptors in rat fibroblasts are required for activation of SRC kinase and mitogen-activated protein kinase in response to extracellular calcium // J. Biol. Chem. 1998. V. 2?3. №. 2. P. 11141120.
21. Nangia A.K., Butcher J.L., Konety B.R., Viet-meier B.N., Getzenberg R.H. Association of vitamin D receptors with the nuclear matrix of human and rat genitourinary tissues // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998. V. 66. № 4. P. 241-246.
22. Okorokov A.L., Rubbi C.P., Metcalfe S., Milner J. The interaction of p33 with the nuclear matrix is mediated by F-actin and modulated by DNA damage // Oncogene. 2002. V. 21. P. 336-36?.
23. Edwards S.J., Hananeia L., Eccles M.R., Zhang Y.F., Braithwaite A.W. The proline-rich region of mouse p33 influences transactivation and apoptosis but is largely dispensable for these functions // Oncogene. 2003. V. 22. P. 431?-4323.
24. Hancock R. Internal organisation of the nucleus: assembly of compartments by macromolecular crowding and the nuclear matrix model // Biol. Cell. 2004. V. 96. № 8. P. 393-601.
LOCALIZATION OF P53 PROTEIN IN CHROMATIN FRACTIONS AND NUCLEAR MATRICIES IN CELLS OF DIFFERENT TYPES
M.A Lapshina, 1.1. Parkhomenko, A.A. Terentiev
The tumor suppressor p53 can associate with the nuclear matrix. The fractionation of nuclei and purification of nuclear matrix from cells of different types have been carried out and p53 protein content in fractions of the cell nucleus has been studied. It is shown that localization of p53 in chromatin fractions and the degree of its association with the nuclear matrix depend on the type of cells.
Keywords: nuclear matrix, chromatin fractionation, p53.
