CC BY
138
УДК 576.311.344
ЛизосомныЕ болезни накопления в ЕвропЕ: проблема нейродегенерации и новые возможности терапевтических воздействий
Александр Борисович ПУПЫШЕВ
Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
НИИ физиологии и фундаментальной медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Рассмотрены тенденции изучения лизосомных болезней в Европе, связанные с особым интересом к аутофа-гии, нейропатологии и новым терапевтическим технологиям. Показано, что торможение аутофагии способствует накоплению аномально свернутых белков, индукции стресса эндоплазматического ретикулума, агрегации белков и формированию признаков нейропатологии. Примером является влияние болезни Гоше (дефект Р-глюкоцереброзидазы) на формирование болезни Паркинсона. Синдром лизосомного накопления и старение тормозят активность эндоцитоза и аутофагии. Поэтому в работе представлены пути терапевтических и/или ней-ропротективных воздействий на усиление собственных защитных механизмов клеток, таких как аутофагия, белки TFEB, №р70. Показана возможность частичного предупреждения дефектов скелета активацией аутофагии. Существенный прогресс достигнут в генной терапии лизосомных болезней аденовирус- и лентивирус-ассоци-рованными генами недостающих ферментов и в их интракраниальном применении для устранения нейропато-логии. Рассмотрены и другие пути терапевтических вмешательств.
Ключевые слова: лизосомы, лизосомные болезни накопления, нейродегенерация, аутофагия, фермент-заместительная терапия, генная терапия.
Лизосомные болезни накопления (ЛБН) представляют собой редкие наследственные заболевания, связанные с потерей активности отдельных лизосомных ферментов или их кофакторов. К ним относятся болезнь Гоше (дефект Р-глюкоцереброзидазы), болезнь Нимана - Пика (недостаточность сфингомиелиназы), болезнь Помпе (дефект а-1,4-глюкозидазы), болезнь Тея - Сакса (дефект р-гексозаминидазы А), ме-тахроматическая лейкодистрофия (дефект арил-сульфатазы А), мукополисахаридозы 7 типов, муколипидозы 4 типов и др. Всего насчитывается около 50 таких заболеваний, нередко приводящих к гибели в раннем возрасте. Наиболее выраженные изменения распространяются на поражение скелета, нейропатологию, висцеральную органо-мегалию.
Поскольку ЛБН являются моногенными заболеваниями, возможны достаточно универсальные подходы к их коррекции. Активно применяется заместительная энзимотерапия (ЗЭТ), изучаются возможности трансплантации гематопоэтиче-ских и нейрональных стволовых клеток, генной терапии, субстратной депривации и других подходов.
Исследовательские ресурсы Европы объединены в рамках Европейской исследовательской
группы по лизосомным болезням (ESGLD), существующей с 1978 г. и включающей в свой состав ученых 22 стран. Очередное рабочее совещание ESGLD в Неаполе (1-4 октября 2015 г.) было в значительной мере посвящено механизмам формирования нейропатологии при ЛБН и конструктивным средствам патогенетической терапии этих заболеваний.
Совещание сопровождалось предшествующим курсом лекций по лизосомам и лизосомным болезням, включавшим презентации E. Lloyd-Evans «Molecular pathogenesis of LSD», К. Set-tembre «Autophagy», Т. Cox «Lipid degradation and lipid storage diseases», G. Parenti «Glycosamino-glycan degradation and mucopolysaccharidoses», H. Aerts «Gauche disease», B. Bigger «Therapy of lysosomal storage diseases».
Почетную лекцию, посвященную важнейшим историческим событиям в изучении ЛБН, представил бывший президент ESGLD профессор Kurt von Figura (Германия) [34], отметивший достижения E. Neufeld, W. Sly, S. Kornfeld, R. O'Brady и многих других признанных ученых, а также представивший обзор новых терапевтических подходов, в частности возможности исправления генетического дефекта фермента его посттрансляционной модификацией. Так, дефект
Пупышев А.Б. - к.б.н., старший научный сотрудникЦНИЛ, e-mail: [email protected] СИБИРСКИЙ НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 36, № 2, 2016
множественной сульфатазной недостаточности может исправляться заменой в арилсульфатазе А сульфгидрильной группы модифицированного глицина на Са-формильную группировку, и эта замена осуществляется коротким мотивом, ген которого в дальнейшем клонировали и использовали для получения рекомбинантных сульфатаз с терапевтической активностью.
Программа совещания включала сессии, посвященные биологии лизосом, механизмам ЛБН, анимальным моделям, терапии ЛБН. Особое внимание было уделено фундаментальным аспектам ЛБН и биологии лизосом, что во многом связано с глубокими исследованиями лизосомной биологии и патологии, проводимыми организаторами совещания под руководством проф. Andrea Ballabio [2]. Ранее значительное место уделялось клиническим исследованиям ЛБН, для которых существуют и другие медицинские форумы, такие как Lysosomal Disease Network's Annual World Symposium, WORLD Symposium, Symposium on MPS and related diseases и т.д.
Среди приглашенных докладчиков были Anthony Galione (Oxford) «Two-pored channels and endolysosomal calcium signalling», Timothy Cox (Cambridge) «Gaucher disease: an exceptional source of treasure», David Rubinsztein (Cambridge) «Autophagy and neurodegeneration», Marja Jaattela (Copenhagen) «Control of lysosomal stability and autophagosome maturation by sphyngomyelin metabolism: opportunities for therapeutic interventions».
В своей лекции Т. Кокс показал комплексное поражение систем организма при болезни Гоше. В ее лечении используется весь терапевтический арсенал: обновление популяции макрофагов трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток, субстратная депривация (подавление синтеза сфинголипидов), генная терапия и т. д. [8]. На фоне широкого применения ЗЭТ цередазой (ß-глюкоцереброзидазой) показателен пример эффективности лечения: за 20 лет энзимотерапии практически вылечен пациент, живущий в настоящее время полноценной жизнью и ставший отцом троих детей.
Значительное внимание было уделено механизмам формирования нейродегенерации при ЛБН и роли аутофагии в выживании клеток при синдроме лизосомного накопления. В лекции Д. Рубинштейна были показаны некоторые пути влияния аутофагии на процессы нейроде-генерации. Так, она снижает накопление агрегатов белков (таких как а-синуклеин, хантингтин, тау-белок) и их токсичность, в конечном счете препятствуя развитию соответственно болезни Паркинсона (БП), болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера. Аутофагия способна повышать
устойчивость клеток к апоптозу, конкурируя за мессенджеры клеточного выживания и подавляя про-апоптозную сигнализацию. Отмечено, что разрабатывается новая стратегия стимуляции неканонических путей аутофагии, в частности, посредством фосфатидилинозитол-5-фосфата, в дополнение к классической регуляции аутофагии, используемой для повышения выживаемости клеток [30].
М. Яаатела представила свою концепцию влияния стабильности лизосом на клеточное выживание и зависимые от лизосом возможности новых терапевтических воздействий [15]. Она показала, что мутации различных лизосомных белков вызывают в целом снижение стабильности лизосомных мембран. Освобождение ли-зосомных катепсинов В и D может приводить к атаке митохондрий пептидами Bax и Bak, вызывающими пермеабилизацию мембран митохондрий и освобождение цитохрома с, запускающего апоптозный каскад активации каспаз. Важно следить за проницаемостью мембран лизосом путем использования новых прижизненных маркеров, таких как лектин галактин, связывающийся с ли-зосомной Р-галактозидазой и видимый благодаря внедрению в клетки генетической конструкции mCherry-Gal3 (экспрессия конъюгата окрашенного белка mCherry с галактином) [1]. Получены данные в пользу того, что метастазирование связано с дисфункцией лизосом, опосредуется освобождением цистеиновых катепсинов. Такие белки, как Hsp70, серпины, цистатины, препятствуют освобождению катепсинов. Hsp70 оказывает эффект посредством связывания с бис-(моноацилглицеро)фосфатом (BMP) мембраны лизосом и активацией кислой сфингомиелина-зы, которая, судя по приведенным данным, обладает мембраностабилизирующим действием. В результате Hsp70 препятствует лизосомной патологии при лизосомных болезнях накопления. Например, при болезни Нимана - Пика С он улучшает моторную функцию мозга, а катионные ам-фифильные препараты (лоратидин, тетрафенадин и др.) ингибируют этот фермент и способствуют гибели клеток, что важно для онкотерапии. Кроме того, кислая сфингомиелиназа способствует формированию аутофагосом, и ее ингибирование тормозит репаративную аутофагию и помогает гибели онкотрансформированных клеток.
В последнее время лизосомные ферменты рассматриваются как потенциальные маркеры в диагностике такой нейропатологии, как болезнь Альцгеймера, БП и деменция с тельцами Леви. Повышенный уровень лизосомных протеаз ка-тепсинов B и D выявлен в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и в мозге пациентов с болезнью
Альцгеймера, при БП в СМЖ увеличена активность лизосомных Р-галактозидазы и катепсина Е (постер A. Tasegian, Италия) [32]. Однако в других исследованиях найдено снижение активности Р-глюкоцереброзидазы в СМЖ пациентов с БП и деменцией и рост активности Р-гексозаминидазы при БП. Такие модуляции активности ферментов при рассматриваемой нейропатологии могут быть результатом регуляторных изменений лизо-сом мозга. Однако взаимосвязь этих показателей СМЖ и мозга пока не ясна, неизвестно происхождение лизосомных ферментов СМЖ. Полагают, они могут попадать в СМЖ из нейронов головного мозга в ходе секреторно-опосредованного переноса ферментов из аппарата Гольджи в лизосо-мы, возможно проникновение и из других тканей вследствие поражения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Лизосомная кислая а-маннозидаза распространена повсеместно в организме человека в двух формах - А и В. В крови преобладает ее «промежуточная» форма с оптимумом рН 5,5. Профиль изоформ фермента в СМЖ был сходен с таковым фронтальной коры головного мозга (наличие изоформ А и В), но отличался от профиля плазмы крови. И наоборот, в СМЖ не найдено «промежуточной» формы фермента. Таким образом, а-маннозидаза поступает в СМЖ из мозга и может отражать его нейропатологию, связанную, например, с БП.
В докладе R. Bartolomeo (Италия) сообщалось, что синдром лизосомного накопления подавляет такие важнейшие клеточные функции, как эндоцитоз и аутофагия. А аутофагия в свою очередь является механизмом поддержания клеточного гомеостаза, регулируемым посредством сенсоров комплекса mTORCl. При использовании анимальной модели заболевания найдено, что этот комплекс вовлечен в формирование му-кополисахаридоза MPS VII [3]. Выделенные из таких мышей хондроциты обнаружили низкую чувствительность mTORCl к недостаточности питательного обеспечения, зависимую от белка Raptor этого комплекса. Выявленный эффект влиял на рост скелета. Генетическая или фармакологическая коррекция сигнализации mTORCl восстанавливала активность аутофагии в хон-дроцитах и позитивно влияла на формирование скелета.
Связь нейродегенерации с аутофагией прослежена в экспериментах по осмотическому тестированию аутофагии, являющемуся функциональным тестом на активность аутофагии (содержание аутофаголизосом) (постер А.Б. Пу-пышева, Россия) [25]. Тест показал достаточную чувствительность при индукции аутофагии в печени голоданием (1 и 2 суток), при оценке ли-
пидоза печени, вызванного полоксамером Р-407 (постер Т.А. Короленко) [19], и наконец при лечении преждевременного старения крыс линии OXYS цефтриаксоном. Препарат вызывал рост осмотической чувствительности лизосом в передней коре мозга крыс OXYS, что соответствует индукции протективной аутофагии.
Моделирование цероидного липофусцино-за нейронов (NCL) нокаутированием гена Cln7/ Mfsd8, кодирующего белок лизосомной мембраны Cln7, дало жизнеспособных фертильных мышей с признаками нейродегенерации и преждевременной гибелью (доклад L. Brandenstain, Германия). Важно, что в различных отделах головного мозга обнаружено торможение аутофаго-вого потока, по-видимому, вносящее свой вклад в формирование нейропатологии [5].
В других экспериментах NCL моделировали получением мышей с генотипом Pptl-- (дефект гена Clnl) и нашли, что патология спинного мозга развивается раньше поражения головного мозга (доклад J. Cooper, Англия) [23]. Повреждение мозга не устранялось генной терапией переднего мозга, в связи с чем выбрали терапевтической мишенью спинной мозг, ставший объектом ЗЭТ ферментом пальмитоил-белок-тиоэстера-за-1 (PPT1). Лечение ферментом путем введения его в СМЖ дало ослабление патологии спинного мозга, снижение синаптической недостаточности и перспективу использования подхода при выраженной патологии спинного мозга, вызываемой NCL.
На модели NCL (CLN5 и CLN6) овец воспроизведены нейродегенерация и лизосомное накопление, свойственные этим лизосомным болезням (доклад N.L. Mitchell, Новая Зеландия) [22]. Изучали возможности лечения с помощью адресуемой в ЦНС вектор-аденоассоциированной (AAV) генотерапии. Овцам с генотипом CLN5/-вводили генетическую конструкцию AAV9-CLN5 внутрь коры и желудочка мозга, и через 18 месяцев нашли коррекцию их фенотипа, нормализацию внутричерепного объема, улучшение когнитивных функций мозга и нейрофизиологии в целом. Введение конструкций в желудочки мозга давало распространение агента по всей ЦНС, оказывало лучший эффект, чем инъекции в кору мозга. Аналогично, терапевтический эффект получен для овец с генотипом CLN6-- (модель болезни Баттена) и конструкции AAV9-CLN6.
Активно изучается связь ЛБН с другими заболеваниями на примере болезни Гоше (дефект ß-глюкоцереброзидазы, кодируемой геном GBA) и БП (доклад M. Horowitz, Израиль), которые повышают риск возникновения друг друга. При болезни Гоше экспрессия мутантной глюкоцеребро-
зидазы сопровождается стрессом ЭПР, ведущим к клеточному ответу на нарушение сворачивания белков (unfolded protein response, UPR). А эти изменения, в свою очередь, характерны для формирования БП. На модели болезни Гоше (Drosophila melanogaster с генотипом GBA-/-) нашли сокращение срока жизни, поражение дофаминовых нейронов и поведенческих реакций, накопление а-синуклеина, свойственные БП, хотя на гетеро-зиготы эти изменения не распространялись [21, 28]. Коррекция патологии с помощью фармакологического шаперона амброксола, снижающего накопление мутантной ß-глюкоцереброзидазы в ЭПР, исправляла дефект роста мутанта 83GG. Таким образом, при болезни Гоше накопление мутантного фермента с дефектом конформации ведет к индукции стресса ЭПР, гибели дофаминовых нейронов, формированию признаков БП.
Пациенты с болезнью Гоше имеют 5-кратный риск развития БП в сравнении с нормальными людьми. Найдено, что глюкозилцерамид, накапливающийся при болезни Гоше, обладает стабилизирующим действием на растворимые формы а-синуклеина (постер M.R. Ceccarini, Италия). Как следствие, недостаточность ß-глюкозилцереброзидазы может способствовать накоплению и агрегации а-синуклеина. При БП нашли снижение активности фермента в СМЖ (особенно на ранней стадии) и увеличение содержания олигомерного а-синуклеина по сравнению с величинами показателей у пациентов с когнитивными нарушенями или деменцией. Эти два параметра вкупе с повышенным уровнем ß-гексозаминидазы позволяют отличить БП от другой нейропатологии. В сравнении со здоровыми людьми активность ß-глюкозилцереброзидазы в СМЖ была немного меньше, а активность ка-тепсина Е существенно больше. Для изолированных фибробластов при БП (независимо от болезни Гоше) обнаружена высокая активность ß-гексозаминидазы и низкая активность ß-глюкозилцереброзидазы, которая распространялась и на мозг. В целом, показано, что анализ активности лизосомных ферментов в СМЖ дает надежные и воспроизводимые диагностические результаты [7].
При болезни Альцгеймера отмечаются ранние изменения лизосом, иногда предшествующие накоплению токсичного предшественника ß-амилоида (APP) (доклад M. Damme, Германия). Среди генов предрасположенности к болезни выявлен ген Pld3, кодирующий фермент лизосом фосфолипазу D, с высокой активностью в ткани мозга. Для генома PldS-^ найдена мягкая форма нейропатологии, включая нарушение поведенческих реакций, но без влияния на уровень APP
in vivo, а повышенная экспрессия фермента в культуре клеток ведет к существенному снижению содержания патогенного APP и экспрессии лизосомных ферментов [14].
В лечении ЛБН важнейшее значение имеет устранение нейропатологии, и поэтому активно изучаются возможности универсального торможения нейродегенерации. К числу таких подходов относится использование рекомбинантного белка теплового шока Hsp70, являющегося одновременно шапероном (постеры T. Kirkegaard, C. Fog-Tonnesen, Дания). Авторы нашли, что он способствует связыванию ферментов деградации сфинголипидов с их кофактором BMP in vitro и ослабляет патологию лизосом первичных культур дефектных фибробластов от 14 пациентов с 9 ЛБН. Hsp70 эффективно проникал в различные органы мыши, включая ЦНС, ингибируя накопление гликосфинголипидов на мышиных моделях болезней Фабри, Зандхофа, Нимана - Пика С, и эффективно ослабляя неврологические симптомы в двух последних моделях. Дополнительное применение аримокломола, являющегося фармакологическим низкомолекулярным ко-индуктором Hsp70, усиливает действие Hsp70 в устранении нейропатологии и симптомов ЛБН. Таким образом, полученные результаты по применению Hsp70 обнадеживают в поиске новых путей терапии ЛБН [16, 17].
В докладе J. Klumperman (Голландия) представлена роль белка лизосом Vps41, участвующего в слиянии кислых везикул, в транспорте белка лизосом LIMP2, являющегося рецептором фермента Р-глюкозилцереброзидазы, дефицит которой приводит к болезни Гоше. Оказалось, что этот белок регулирует транспорт белков LAMP-1, LAMP-2, NPC-1, LIMP-2/GBA из аппарата Голь-джи в лизосомы, но в то же время способствует слиянию эндосом с лизосомами. Полагают, Vps41 нужен для поддержания стабильности лизосом и липидного гомеостаза. В конечном счете он может быть протективным фактором в противодействии нейродегенерации [18].
На модели индукции липидоза, вызываемого ингибированием липаз полоксамером Р-407, показано резкое увеличение уровня атерогенных липидов крови, превышающее таковое при семейной гиперхолестеринемии (постер Т.А. Короленко, Россия). Липидоз выражен в макрофагах печени, сопровождается ростом активности хито-триозидазы и имеет признаки лизосомной перегрузки, способной вызвать вторичные клеточные изменения [19].
В формировании ЛБН заметная роль отводится активности транскрипционного фактора EB (TFEB), регулирующего экспрессию лизо-
сомных гидролаз, везикулярный транспорт и аутофагию (доклад S. Raimo, Италия). Его гиперэкспрессия у мышей приводит к подавлению симптомов ЛБН. Однако при исследовании ряда ЛБН (MPS IIIA, MSD, болезни Зандхофа) нашли увеличение транскрипции фактора в нейронах и микроглии и его ядерную транслокацию, соответствующую активному состоянию фактора. В дальнейшем на модели болезни Гоше, вызываемой кондуритол-В-эпоксидом (ингибитором Р-глюкоцереброзидазы), обнаружили ядерную транслокацию TFEB в клетках HeLa. Как и для других ЛБН, повышенная экспрессия TFEB вела к снижению лизосомного накопления (судя по уровню глюкоцереброзидов). А для мышей с дефицитом фактора наблюдали накопление липи-дов в клетках печени и рост накопительного (ли-зосомного) компартмента [26]. Таким образом, в ходе формирования ЛБН TFEB играет протектив-ную роль, связанную с клеточным очищением от накапливающегося материала.
При изучении мукополисахаридоза MSP IIIA на анимальных моделях и культурах нейронов в пресинаптических областях нейронов нашли прогрессивную потерю растворимого а-синуклеина и белка CSPa (cysteine string protein а), что в свою очередь негативно влияет на уровень белка слияния везикул SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptor) в нервных окончаниях (доклад I. Sambri, Италия). Отмечено накопление нерастворимого а-синуклеина, а растворимый а-синуклеин, наоборот, помогал рециклированию синаптических везикул. Гиперэкспрессия CSPa в мозге дефектных мышей восстанавливала уровень SNARE и способствовала работе синапсов и подавлению нейродегенерации [31]. Таким образом, при ЛБН может нарушаться функционирование преси-наптических везикул, зависимое от гомеостаза SNARE в нервных окончаниях.
В связи с тем, что аутофагия универсально вовлечена в формирование ЛБН и нейродегенера-цию, предложено контролировать мутации ауто-фаголизосомного пути с помощью лизоплекса (Lysoplex) - системы адресного секвенирова-ния нового поколения (Targeted Next Generation Sequencing, TNGS) (постер G. DiFruscio, Италия). Этот подход позволяет различать цепочки 891 гена, вовлеченного в функционирование лизосом, эндоцитоз и аутофагию. Лизоплекс опробован на 14 ЛБН и затем на пациентах с клиническим фенотипом NCL с неизвестными мутациями. Были идентифицированы патогенные мутации у 67 % пациентов, большинство которых не поддавались выявлению обычными технологиями секвениро-вания. Кроме того, результаты сравнили с работой
общепринятого полного экзомного секвениро-вания (WES). В среднем было идентифицировано на 50 % больше подтвержденных изменений аминокислотного состава и укорочения пептидов в расчете на 1 ген. В целом обнаружили 61 укорочение последовательностей и 488 миссенс-мута-ций с высокой вероятностью потери функции 316 генов [9]. Таким образом, лизоплекс дает современный каталог кодовых вариаций генов кислого везикулярного аппарата и позволяет соотнести их с клеточными изменениями, связанными с ЛБН.
В другом исследовании (постер M. Blomqvist, Швеция) с помощью такого подхода обследовали 20 пациентов с лизосомными или пероксисомны-ми болезнями. Ранее с помощью секвенирования Сэнджера нашли патогенные мутации у всех этих пациентов. Обычный набор мишеней включал 60 экзонов и фланк-области 90 генов. Создание библиотеки было выполнено с помощью платформы Sure Select QXT (Agilent). В результате ожидаемые патогенные мутации были найдены у всех 20 пациентов. В коммерческой базе, охватывающей 281 вариант, примененная панель показала чувствительность 100 % и специфичность 97 % [4]. Таким образом, получен полезный инструмент для выявления патогенных мутаций ЛБН облегченным методом.
В лаборатории Брайана Биггера (Манчестер, Англия) осуществлена преклиническая подготовка генной терапии мукополисахаридоза MPS IIIA (постер S. Ellison). Это заболевание связано с дефектом N-сульфоглюкозамин-сульфогидролазы, лизосомным накоплением гепарансульфата, и поражает прежде всего головной мозг. ЗЭТ нормальным ферментом неэффективна в силу наличия ГЭБ. Проблему может решить трансплантация гемопоэтических стволовых клеток благодаря поселению моноцитов в мозге и наработке ими недостающего фермента. Этот подход оказался полезным в лечении мукополисахари-доза MPS I (синдром Пфаундлера - Гурлер). Но для лечения MPS IIIA наработка недостающего фермента адресованными моноцитами оказалась недостаточной. Поэтому специально повысили продукцию фермента стволовыми клетками с помощью внедрения генной конструкции лентиви-русного вектора с геном нормального фермента. В конечном счете удалось увеличить содержание фермента в мозге до 11 % от нормы, что исправляло поведенческие реакции, устраняло нейро-воспаление, существенно повышало выживание мышей, нормализовало уровень гликозаминогли-канов и размеры лизосом. Преклиническое испытание токсичности примененной конструкции на CD34+-клетках человека показало, что при 10-, 20-кратном увеличении уровня фермента относи-
тельно нормы токсичность воздействия не росла, равно как частота трансформации и другие параметры лентивирусной доставки генов, применяемой в клинике. В 2016 г. планируется проведение I/II фаз клинических испытаний конструкции в лечении MPS IIIA человека [10].
Лентивирусные конструкции оказались полезными в разработке лечения и мукополисаха-ридоза MPS II (дефект идуронат-2-сульфатазы, ген IDS) (постер H. Gleitz, Англия). Использовали лентивирусные векторы третьего поколения с миелоид-специфичным промотором hCD11b, нацеленные на мозг и ассоциированные с генами IDS, SUMF1 и TFEB [13]. Показано, что они повышают уровень соответствующих белков in vivo, а также улучшают поведенческие реакции мышей с MPS II. Более того, получили мышей, нокаутированных по гену Ids, их состояние соответствует высокой остроте заболевания. На них также получен позитивный нейрологический эффект, отслеживаемый в динамике возраста мышей до 8 месяцев.
Для коррекции мышиной модели болезни Зандхофа использовали аденоассоциированную (AAV) доставку корригирующих генов (постер L. Rouviere, Франция). Вектор AAV9 с геном гек-созаминидазы В и промотором PGK вводили внутривенно. Такое лечение повышало срок жизни животных со 120 дней до нормы (не менее 700 дней) и предотвращало основные симптомы заболевания, включая нейропатологию. Найдено, что активность гексозаминидаз А и В возрастала до терапевтически необходимого уровня (для гек-созаминидазы А - до 15 % от нормы для мозга и до 40 % для печени), и этот уровень сохранялся повышенным в течение 2-24 мес. Лечение способствовало устранению накопления ганглиози-дов в мозге (2-4 мес.), в том числе в значительной мере - в мозжечке. Подавлялась гибель нейронов, астроцитов, микроглии. Таким образом, лечение неонатальных мышей с помощью внутривенного введения вектора AAV9-HexB дает хорошие результаты [29].
Подобный подход применен и в отношении мукополисахаридоза MPS IIIC, сопровождающегося поражением ЦНС. Ставили задачу доставки недостающего фермента (HSGNAT) в мозг, прохождение ГЭБ (постер C. O'Leary, Англия). Для этого использовали систему ААV и интракрани-альное введение препарата, потенциально способные восстановить активность фермента в мозге и корректировать нейрологические нарушения. В эксперимент взяли мышиную модель заболевания. Введение конструкции AAV- HSGNAT в стриатум мозга повышало уровень фермента выше нормы дикого типа, особенно выраженно в
точке инъекции и в ближних сечениях R2 и R3 (свыше 300 %) [24]. Таким образом, в определенной мере подготовлено обоснование терапевтических интервенций в мозг пациентов с MPS IIIC.
В последнее время специалисты считают, что ЗЭТ является слишком дорогим лечением, она эффективна при ограниченном круге ЛБН, и поэтому активно исследуются другие подходы. Найдено, что однократное введение низких количеств аденоассоциированного вектора с серотипом 8 (AAV2/8) мышам с MPS VI так же эффективно, как ЗЭТ ферментом в течение недели (постер R. Ferla, Италия). При этом введение больших доз конструкции, являющееся дорогостоящим лечением, может приводить к нежелательным иммунным реакциям, поэтому применили комбинацию низких доз генотерапии и редких инъекций ЗЭТ (ежемесячно). Совместная терапия приводила к снижению содержания гликозаминогликанов в моче, подавлению лизосомного накопления в миокарде и была так же эффективна, как высокие дозы генной терапии или обычная еженедельная ЗЭТ [11]. Таким образом, уменьшение доз данных терапевтических воздействий повышает безопасность и снижает риски и стоимость лечения.
Предлагается проверять эффективность лечения ЛБН предварительно на изолированных клетках пациента. Так, для болезни Фабри (дефект а-галактозидазы А) получили генотрансформи-рованные клетки, содержащие разные мутации гена фермента от 6 разных пациентов, и испытали действие химического шаперона DGJ (постер L. Ferri, Италия). У всех линий клеток была снижена активность а-галактозидазы, а позитивный эффект терапии обнаружен только для двух вариантов клеток из шести [12]. Таким образом, функциональное тестирование лечения на клеточных культурах является полезным подходом для прогноза эффективности лечения.
Интересные данные получены при изучении муколипидоза II (ML II, I-cell disease), характеризующегося «утечкой» из клеток многих лизосомных ферментов в результате дефекта рецептора маннозо-6-фосфата (М-6-Р) и накоплением недеградируемого материала (постер S. Krambeck, Германия). Ключевым ферментом синтеза рецептора является фермент глюкозо-N-ацетил-фосфотрансфераза. Несмотря на этот дефект, в гепатоцитах и клетках Купфера печени, в лейкоцитах крови активность лизосомных ферментов практически не менялась. В связи с этим исследовали замещающие пути внутриклеточного транспорта лизосомных ферментов. В гомогенате печени нашли высокую активность идуронат-2-сульфатазы, а-фукозидазы при отсутствии изменений активности a-L-идуронидазы и
Р-глюкуронидазы. А с помощью вестерн-блоттин-га и иммунофлуоресценции нашли дополнительно эффективный М-6-Р-независимый транспорт в лизосомы катепсинов B, D, Z. На изолированных гепатоцитах показали, что достаточно хорошо достигают лизосом катепсины B, D, Z, нейрами-нидаза I. Страдал транспорт холестерин-связы-вающего белка Npc2, однако это не приводило к накоплению неэтерифицированного холестерина в лизосомах. Эндоцитоз М-6-Р-содержащей арилсульфатазы В слабо повышался. В целом, в отличие от фибробластов пациентов с MLII, в гепатоцитах существенно не изменялись ни экспрессия, ни распределение рецепторов М-6-Р, ни активность лизосомных ферментов. И даже активность аутофагии, оцениваемой по маркеру LC3-II, не была снижена. Таким образом, гепа-тоциты снабжены активным М-6-Р-независимым механизмом транспорта лизосомных ферментов для обеспечения лизосомного и клеточного гомеостаза в печени [20].
Предпринимаются попытки получения удобных маркеров для слежения за прогрессирова-нием и эффективностью терапии лизосомных болезней, в частности болезни Помпе (постер G. Parenti, Италия). Используя технологию NGS, исследовали тканеспецифичные микроРНК, локализующиеся в сердце и мышцах или циркулирующие в крови животных с анимальной моделью заболевания. Нашли большой спектр тканеспецифичных микроРНК, экспрессирую-щихся на разные сроки заболевания (3 и 9 месяцев), и 42 их вида были общими на оба срока. В плазме крови больных обнаружили отличия у 7 пациентов с инфантильной формой болезни Фабри и у 10 пациентов с поздней формой [33]. В целом, предлагается клиническое использование этого диагностического подхода, отражающего тяжесть течения болезни Фабри.
На мышиной модели MPS II разрабатывается доставка в мозг недостающего фермента идуронат-2-сульфатазы посредством новых носителей - полимерных наночастиц с прикрепленным адресованным в мозг пептидом g7 (постер L. Rigon, Италия). Показано прохождение частицами ГЭБ и повышение эффективности доставки фермента, правда, нуждающейся в ускорении его освобождения из частиц [27].
Терапия ЛБН субстратной депривацией может осуществляться с помощью мелких интерферирующих РНК (siRNA), способных подавлять экспрессию целевых генов. На примере мукопо-лисахаридоза MPS IIIC (дефект ацетил-СоА-а-глюкозаминид-К-ацетил-трансферазы) применили siRNA генов EXTL2 и EXTL3, кодирующих синтез гепарансульфата, накапливающегося при
данном заболевании (постер L. Vilageliu, Испания). На фибробластах двух пациентов нашли, что 4 вида таких РНК на 90 % подавляли синтез мРНК соответствующих генов и наработку гли-козаминогликанов (на 30-60 %, через 3 дня) и их накопление (до 24 % , через 14 дней) [6]. А с помощью иммуноцитохимии показали признаки терапевтической нормализации фенотипа. Таким образом, данный подход перспективен в лечении синдрома Санфилиппо С.
заключение
Среди представленных направлений исследований наиболее актуальными являются активация неспецифической клеточной защиты от стресса и дегенерации, и в первую очередь в процессах нейродегенерации, обусловленной ЛБН. Поскольку активность аутофагии снижается с возрастом и при клеточной интоксикации, вызываемой ЛБН, становится важным стимулировать аутофагию для очищения клетки от патогенных продуктов и восстановления функциональной активности [5]. В отношении нейродегенерации аутофагия выполняет функции удаления патогенных белков а-синуклеина, тау-белков, хантингти-на, накапливающихся при ЛБН и одновременно способствующих формированию болезней Пар-кинсона, Альцгеймера, Хантингтона соответственно. Установлены некоторые общие механизмы дегенерации нейронов при болезнях Гоше и БП, состоящие в стрессе ЭПР, индуцируемом дефектом Р-глюкоцереброзидазы при болезни Гоше, приводящем к накоплению а-синуклеина и гибели дофаминовых нейронов, угнетению функций мозга и симптомам БП.
Существенная роль в обеспечении клеточного гомеостаза отводится контролю и поддержанию стабильности лизосом, предотвращению их пермеабилизации как проапоптогенного фактора и освобождения катепсинов В и D. Другими факторами усиления клеточной защиты при ЛБН и нейродегенерации могут быть шаперон Hsp70, регулятор биогенеза лизосом и аутофагии TFEB, активация процессов слияния везикул с помощью белка SNARE и др.
Получены первые данные о том, что активация аутофагии может влиять не только на торможение нейродегенерации, но и на исправление дефектов скелета, вызываемых ЛБН. Новым подходом является оценка экспрессии широкого спектра белков, связанных с аутофагией, посредством мощной аналитической системы Лизоплекс.
Существенный прогресс достигнут в области генной терапии ЛБН с использованием ленти-вирус- и аденовирусассоциированных векторов
для доставки генов промоторов и недостающих ферментов в дефектные клетки. Нередко для исправления симптомов нейропатологии достаточно внутривенного введения таких генетических конструкций, однако в других случаях повышение эффективности достигается интракраниаль-ным введением препаратов, как правило, в желудочки мозга или стриатум. Такие исследования обеспечивают базу для клинического испытания технологий интракраниальной генной терапии ЛБН.
Приведенные результаты свидетельствуют об усилении диагностической ценности исследования материала СМЖ, отражающего патологию головного мозга. Разрабатывается терапевтический подход, связанный с тестированием эффективности лечения на клеточных культурах, полученных от пациентов с ЛБН.
Представленные тенденции исследования и лечения ЛБН выделяют пути повышения эффективности научного поиска в этой области. Вместе с тем изучаются и возможности оптимизации и удешевления лечения лизосомных болезней, поскольку часто высокая стоимость лекарств является тормозом для проведения терапии.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 16-04-01423.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Aits S., Jaattela M., Nylandsted J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permea-bilization: a hallmark of lysosomal cell death // Methods Cell Biol. 2015. 126. 261-285.
2. Ballabio A., Naldini L. Fighting rare diseases: the model of the telethon research institutes in Italy // Hum. Gene Ther. 2015. 26. (4). 183-185.
3. Bartolomeo R., Salzano A.C., Settembre C. Identification of molecular targets for the treatment of the skeletal phenotype in Lysosomal Storage Disorders // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 26.
4. Blomqvist M., Lindgren J., Olsson L. et al. Validation of an NGS-panel for routine diagnosis of lysosomal and peroxisomal disorders // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 61.
5. Brandenstain L., Schweizer M., Sedlacik J. et al. Lysosomal dysfunction and impaired autophagy in a novel mouse model deficient for the lysosomal membrane protein Cln7 2015 // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 27.
6. Canals I., Beneto N., Cozar M. et al. EXTL2 and EXTL3 inhibition with siRNA as a promising substrate
reduction therapy for Sanfilippo C syndrome // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 127.
7. Ceccarini M.R., Paciotti S., Tasegian A. et al. Cerebrospinal fluid lysosomal enzymes in Parkinson disease // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 65.
8. Cox T.M. Innovative treatments for lysosomal diseases // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2015. 29. (2). 275-311.
9. DiFruscio G., Schulz A., De Cegli R. et al. Lysoplex: An efficient toolkit to detect DNA sequence variations in the autophagy-lysosomal pathway// Auto-phagy. 2015. 11. (6). 928-938.
10. Ellison S., Sergijenko A., Langford-Smith A. et al. Pre-clinical workup of lentiviral mediated stem cell gene therapy for Mucopolysaccharidosis type IIIA // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 77.
11. Ferla R., Alliegro M.L., Nusco E. et al. Combination of low-dose gene therapy and monthly enzyme replacement therapy improves the phenotype of a mouse model of lysosomal storage disease // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 79.
12. Ferri L., Malesci D., Filippini A. et al. The challenge of significance of new GLA gene variations: the importance of functional studies Course. Naples, 2015 // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 80.
13. Gleitz H., O'Leavy C., Holley R., Bigger B. Development of a lentiviral-based gene therapy for Mucopolysaccharidosis II // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 83.
14. Gonzales A., Jagdmann S., Saftig P., Damme M. Pld3 - A new lysosomal protein implicated in Alzheimer's disease // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 30.
15. Jäättelä M., Nylandsted J. Methods for probing lysosomal membrane permeabilization // Cold Spring Harb. Protoc. 2015. (11). 975-978.
16. Kirkegaard T., Gray J., Priestman D.A. et al. Development of Heat Shock Protein based therapies for Lysosomal Storage Diseases // 20th ESGLD Work shop and Graduated Course. Naples, 2015. 89.
17. Kirkegaard T., Gray J., Petersen N.H.T. et al. Hsp70-based therapies as clinical candidates for lysosomal storage disesases // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 81.
18. Klumperman J., Jobling R., ten Brink C. et al. Mutations of Vps41, encoding a regulator of lysosomal fusion events, cause a Parkinson-like phenotype and reduction in cellular LAMP levels // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 36.
19. Korolenko T.A., Johnson T., Goncharova N.V., Pisareva E.E., Filjushina E.E., Chrapova M.V. Intra-cellular lipid storage syndrome (lipidosis) following prolonged treatment of Poloxamer 407 in mice // 20th
ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 90.
20. Krambeck S., Markmann S., Damme M., Braul-ke T. Mannose-6-phosphate-independent transport of lysosomal enzymes in liver cells // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 91.
21.Maor G., Zalesca O., SegalD., HorowitzM. The contribution of mutant Gba alleles to the development of Parkinson's disease in carriers of Gaucher disease mutations // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 33.
22. Mitchell N.L., Wicky H.E., Schoderbock L. et al. Viral-mediated gene therapy prevents disease development in avine models of neuronal ceroid lipofuscinosis // 20th ESGLD Workshop and Grad. Course. Naples, 2015. 42.
23. Nelvagal H.R., Dmytrus J., Dearbon J. et al. Defining spinal cord neuropathology in a mouse of Infantile Neuronal CeroisLipofuscinosis (INCL) and accessing the efficacy of inthrathecal Enzyme Replacement Therapy (ERT) // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 29.
24. O'Leary C., Antunes A.S.L., Parker H. et al. Development of an adeno-associated viral mediated gene therapy approach for Mucopolysaccharidosis IIIC // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 107.
25. Pupyshev A.B., Korolenko T.A., TikhonovaM.A. Osmotic behavior of lysosomes as an index of auto-phagy in cellular lipid overloading and experimental treatment of early senescence // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 112.
26. Raimo S., Tsuji D., Spampanato C. et al. A physiological role of TFEB in LSDs // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 48.
27. Rigon L., Salvalaio M., Pederzoli F. et al. Enzyme-loaded nanoparticles: a potential therapy for the neurological compartment in Mucopolysaccharidosis type II // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 113.
28. Ron I., Rapaport D., Horowitz M. Interaction between parkin and mutant glucocerebrosidase variants: a possible link between Parkinson disease and Gaucher disease // Hum. Mol. Genet. 2010. 19. (19). 3771-3781.
29. Rouviere L., Niemir N., Besse A. et al. Intravenous AAV9-mediated gene transfer prevents pathology in neonatal Sandhoff mice // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 114.
30. Rubinsztein D.C., Bento C.F., Deretic V. Therapeutic targeting of autophagy in neurodegenerative and infectious diseases // J. Exp. Med. 2015. 212. (7). 979-990.
31. Sambri I., D'Alessio R., Ezhova Y. et al. Lysosomal dysfunction disrupts presynaptic maintenance in neurodegenerative diseases through a a-synuclein and CSPa-dependent pathway// 20th ESGLD Workshop and Graduated Co Course. Naples, 2015. 49.
32. Tasegian A., Paciotti S., Ceccarini M.R. et al. Origin of a-mannosidase in cerebrospinal fluid // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 121.
33. Tarallo A., Gatto F., Karali M. et al. Analysis of circulating and tissue-specific microRNAs in Pompe disease // 20th ESGLD Workshop and Graduated Course. Naples, 2015. 110.
34. Von Figura K. Structure-function relationship for lysosomal enzymes // Acta Paediatr. 2007. 96. (455). 5.
lysosomal storage diseases in europe: problem of neurodegeneration and the new trends in therapeutic interventions
Alexandr Borisovich PUPYSHEV
Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
Institute of Physiology and Basic Medicine 630117, Novosibirsk, Timakov str., 4
The new tendencies in study of lysosomal storage diseases in Europe with a special interest in autophagy, neuropathology and the new therapeutic technologies were considered. Decrease of autophagy contributes usually to accumulation of misfolded proteins, stress of ER (UPR), protein aggregation and formation of neuropathological signs. This is shown for influence of Gaucher disease (defect of p-glucocerebrosidase) on formation of Parkinson disease. Storage syndrome as whole and cellular senescence hinder activity of autophagy and endocytosis. Therefore therapeutic/neuroprotective interventions for treatment of lysosomal diseases were connected with stimulation of the own cellular protective mechanisms such as autophagy, activity of proteins TFEB, Hsp70. Additionally to neuroprotection the positive effect of enhanced autophagy on prevention of bone defects was shown also. Considerable progress was achieved in gene therapy of lysosomal diseases by application of adenovirus- and lentivirus-associated constructions of wild type of defective enzymes or their promoters, and the best results were obtained with intracranial mode of injection. The other ways of successful therapeutic interventions were considered also.
Key words: lysosomes, lysosomal storage diseases, neurodegeneration, autophagy, enzyme-replacement therapy, gene therapy.
Pupyshev A.B. - candidate of biological sciences, senior researcher of central research laboratory, e-mail: [email protected]
