CC BY
48
• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
© Горбач В.И., Ермак И.М., 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817779
Удк 547.458+615/03+577.352.2
В.И. Горбач, И.М. Ермак
липосомы как носители сульфатированных полисахаридов из морских водорослей для их доставки в организм
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток
Целью исследования является разработка условий включения в липосомы анионного полисахарида - каппа-каррагинана из водоросли Chondrus armatus. Для этого получены липосомы разного заряда, содержащие полисахарид во внутреннем объеме и предложен метод анализа эффективности включения каррагинана с использованием реактива Тейлора. Найдено, что в предлагаемом методе в нейтральные липосомы при различных рН раствора (5,0 и 7,0) включается около 12% полисахарида. Для изучения взаимодействия полученных липосом с клетками организма изучена посадка на их поверхность флуоресцентно меченого хитозана - природного катионного полисахарида, которая составляет от 0,5 до 6% в зависимости от заряда на поверхности липосом (0) =.(+) < (-). Таким образом, полученные липосомы могут быть предложены для биохимических исследований.
Ключевые слова: липосомы, каппа-каррагинан, флуоресцентномеченый хитозан, степень включения в липосомы.
V.I. Gorbach, I.M. Ermak
liposomes as carriers of sulfated polysaccharides from seaweed for their delivery into the body
Pacific Institute of Bioorganic Chemistry. G.B. Elyakova FEB RAS, Vladivostok, Russia
The aim of our investigation is to develop the terms of inclusion in liposomes of an anionic polysaccharide -kappa-carrageenan from marine alga Chondrus armatus. For that purpose liposomes with various charges containing the polysaccharide in internal liposome space were prepared, and the method to analyze efficacy of inclusion by means of Taylor's reagent was suggested. The application of the proposed method revealed that approximately 12% of polysaccharide was included in neutral liposomes under various solution pH (5.0 and 7.0). In order to obtain labelled liposomes, a fluorescent chitosan derivative was synthesized, and the sorbtion of this derivative on their surface was studied. For liposomes (0) and (+) at pH 5.0 and 7.0 the sorbtion degree was up to 0.5-0.6%, while for (-) - up to 6%. Hence, the developed liposomes could be suggested for biochemical investigation.
Keywords: liposomes, kappa-carrageenan, fluorescently labeled chitosan, degree of inclusion in liposomes.
Введение
Адресная доставка биологически активных веществ в организм млекопитающих является одним из актуальных направлений медицины и биологической химии [3, 5, 9]. Из различных методов (использование наночастиц, иммуноконъюгатов, сорбентов) одним из наиболее распространенных подходов является использование липосом - липидных везикул, содержащих в своем внутреннем объеме водный раствор необходимого препарата, или же сорбирующих его в своей оболочке, представляющей собой бислойную мембрану, содержащую внутри гидрофобные ацильные остатки, а снаружи различные гидрофильные группы [2, 4, 6]. Часто на поверхность липосом наносят различные биополимеры - лекти-ны, иммуноглобулины, адгезивные соединения, которые позволяют им более направлено взаимодействовать с определенными типами клеток [1, 7, 8].
В последние годы внимание биооргаников привлекают полисахариды морских водорослей, обладающие широким набором биологических активностей - анти-
бактериальной, противовирусной, иммуномодули-рующей, противоопухолевой [9, 11]. Однако методы их введения в организм через кишечный тракт отличаются низкой эффективностью, а метод инъекции в кровь рядом побочных эффектов - агрегацией клеток, тромбоцитопенией, токсическими эффектами [5, 10]. Поэтому применение липосом как контейнера для введения полисахаридов и включение в их состав векторных молекул может значительно увеличить эффективность биологического действия полисахаридов.
Целью исследования является разработка условий включения в липосомы анионного полисахарида кап-па-каррагинана из водоросли Chondrus armatus. В качестве вектора можно предложить покрытие поверхности липосом природным поликатионитом - хитозаном, имеющим сродство к гликопротеину - муцину, покрывающему поверхность эпителиальных клеток желудка и некоторых других органов организма.
Материалы и методы
В качестве сульфатированного полисахарида нами использован каппа-каррагинан (К) из морской водо-
Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •
росли Chondrus armatus. Липосомы были получены из смеси яичного лецитина и холестерина в отношении 2,3/1 в/в (16 и 7 мг на 1 эксперимент). Раствор липидов в смеси хлороформ-метанол 9:1 об/об упаривали на роторном испарителе и полученную пленку сушили в вакууме 2 часа. В некоторых экспериментах дополнительно добавляли 0,7 мг дицетилфосфата (ДЦФ) или 0,64 мг цетиламина (ЦА) для придания поверхности липосом отрицательного или положительного заряда.
Полученную липидную пленку гидратировали озвучиванием на ультразвуковой бане (Elma S 15 Elmasonic-germany.com) в течение 30 мин с 0,1 мл раствора Na+ соли каррагинана (которая в отличии от К+ соли не дает гелеобразного продукта) в буферных растворах А) 0,02М Na-ацетат в физиологическом растворе рН 5,0 и Б) 0,02М триоксиметиламиноме-тан в физ. растворе рН 7,0. Полученную суспензию липосом разбавляли 0,5 мл соответствующего буфера и центрифугировали 15 мин при 15000g. Осадок липосом еще 3 раза промывали 0,5 мл буфера, суспендируя и центрифугируя их. Получили Лип (-), Лип (0) и Лип (+) соответственно заряду.
Для лизиса липосом к осадку добавляли 0,3 мл воды и 0,4 мл н-бутанола, смесь озвучивали 30 минут, центрифугировали 1 раз при 15000g. К 40 мкл водного экстракта, содержащего включенный полисахарид добавляли 200 мкл реактива Тейлора (1,9-Dimethyl-methylene Blue, Sigma-Aldrich Co., методика приготовления в каталоге фирмы), смешивая их в ячейках 96 луночного планшета, инкубировали 10 минут и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре (Bio-Tec instruments, Inc, USA) при 535 нм. Количество включенного в липосомы каррагинана определяли по калибровке исходного полисахарида, построенной в тех же условиях. Степень включения считали как соотношение количества включенного К к количеству внесенного К х 100%.
На втором этапе работы мы синтезировали флуо-ресцентномеченный хитозан (Ф-Х) и изучили его взаимодействие с липосомами. Реакцию проводили смешиванием раствора 20 мг хитозана (Х) в 2 мл воды и раствора 2 мг флуоресцеинизотиоцианата (Ф) в 2 мл диметилсульфоксида. Смесь перемешивали 2 ч, добавляли 20 мкл триэтиламина и перемешивали еще 1 ч. Полученный раствор диализовали 3 раза против воды, упаривали до 1 мл и хроматографировали на колонке с биогелем Г-25 при элюции водой.
Фракции анализировали на содержание аминогрупп реакцией с тринитробензолсульфокислотой (хитозан) и по интенсивности флуоресценции, собирая совпадающие пики. Выход Ф-Х 12 мг (60%). Для посадки на липосомы к уже полученным липо-сомам со свободным внутренним объемом (-, 0, +) добавляли 0,2 мл раствора Ф-Х (0,1 мг/мл в физ. растворе), смесь инкубировали 2 часа, далее липосомы отмывали центрифугированием 4 раза с 0,5 мл физ.
раствора и лизировали как описано выше. Флуоресценцию водного экстракта измеряли в объеме 200 мкл в планшетах на приборе (BIO-TEK Microplate Fluorescence Reader, USA) при X 470 нм и X 530
' ' г ex em
нм. Расчеты проводили по калибровке, полученной в тех же условиях, степень посадки Ф-Х определяли, как описано выше.
Полученные результаты
Как уже говорилось вначале, были получены липосомы с разными зарядами - кислые (с ДЦФ), основные (с ЦА) и нейтральные. Кислые липосомы оказались малоэффективны для включения каррагинана (0,51,0% от введенного количества), основные и особенно нейтральные липосомы оказались более эффективны для включения. Однако применение гидрофобных аминов (ЦА) не рекомендуется МЗ РФ, поэтому далее изучались в основном нейтральные липосомы.
Основной задачей при работе с липосомами, кроме их получения, оказалась проблема их лизиса и измерения количества включенного каррагинана. Обычные методы лизиса с использованием детергентов оказались неудачными. Так, использование додецилсульфата натрия невозможно из-за присутствия в его составе сульфатной группы, которая сама реагирует с используемым реактивом Тейлора, а применение неионных детергентов типа тритонов и твинов дает мутные водные суспензии, которые не осветляются при центрифугировании и не позволяют делать количественные колориметрические измерения. Поэтому для лизиса мы применили систему из двух растворителей вода-н-бутанол, которая хорошо разрушает липосомы и легко расслаивается. При этом полисахарид остается в воде, а все липид-ные компоненты уходят в бутанол и не мешают измерениям. Мы исследовали включение каррагинана в липосомы при двух рН среды. Так, для буфера с рН 5,0 липосомы содержали 12.4% от внесенного каррагинана, а при рН 7,0 эта цифра составляет 11,5% (это среднеарифметическое из 5 измерений). Таким образом, рН раствора при получении липосом не влияет на включение полисахарида.
Для изучения возможностей посадки полисахаридов на мембрану липосом нами было синтезировано флуоресцентное производное хитозана (Ф-Х). Инкубация готовых липосом с этим соединением показало, что только Лип (-) сорбируют много хитозана - 5,84% при рН 5,0 и 6,5% при рН 7,0. Липосомы (0) сорбировали 0,48% Ф-Х при рН 5,0 и 0,53% при рН 7,0, Лип (+) 0,4% при рН 5,0 и 0,6% при рН 7,0. Такие различия видимо можно объяснить электростатическими взаимодействиями положительно заряженного хитозана и различными зарядами поверхности липосом (-, 0, +). Но во всех случаях хитозан на поверхности присутствует, поэтому можно надеяться, что это позволит адресно переносить включенные в липосомы анионные полисахариды к поверхности клеток организма.
HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 83
Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
Выводы
1. Получены липосомы различного заряда, содержащие во внутреннем объеме анионный полисахарид - каппа-каррагинан. Показано, что при получении нейтральных липосом, состоящих только из лецитина и холестерина, эффективность включения каррагина-на при различных рН раствора составляет около 12%.
2. Синтезировано флуоресцентномеченное производное хитозана. Посадка этого соединения на поверхность липосом зависит от их заряда. Она наибольшая для отрицательно заряженых липосом - 6% и меньше - приблизительно 0,5-0,6% для нейтральных и положительно заряженных липосом.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского Научного Фонда (проект № 16-14-00051).
ЛИТЕРАТУРА
1. Fitton J.H., Stringer D.N., Karpiniec S.S. Therapies from fucoidan: an update.Mar. Drugs. 2015; 13(9): 5920-5946.
2. Pomin V.H. Marine non-glycosaminoglycan sulfated glycans as potential pharmaceuticals. Pharmaceuticals. 2015; 8(4): 848-864.
3. Raposo M.F.J., Morais A.M.B.M., Morais R.M.S.C. Marine polysaccharides from algae with potential biomedical applications. Marine Drugs. 2015; 13(5): 2967-3028.
4. Fischer U., Janicke R.U., Schulse-Osthoff K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ. 2003; 10(1): 76-100.
5. Maniati E., Potter P., Rogers N.J., Morley B.J. Control of apoptosis in autoimmunity. J Pathol. 2008; 214:190-198.
6. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural similarities of fucoi-dans from brown algae Silvetia babingtonii and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry. Carbohydrate Research. 2012; 358: 78-81.
7. Imbs T.I., Skriptsova A.V., Zvyagintseva T.N. Antioxidant activity of fucoise-containing sulfated polysaccharides obtained from Fucus evanescens by different extraction methods. Journal of Applied Phy-cology. 2015; 27(1): 545-553. doi: 10.1007/s10811-014-0293-7.
8. Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-ли-азы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.: Автореф. дис. ... канд. хим. наук: - Владивосток. 2014; 24 c.
9. Zvyagintseva T. N., Shevchenko N. M., Chizhov A. O., Krupnova T. N., Sundukova E. V., Isakov V. V. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003; 294(1): 1-13.
10. Skriptsova A. V., Shevchenko N. M., Zvyagintse-va T. N., Imbs T. I. Monthly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan from Undaria pinnatifida (Laminariales, Phaeophyta). Journal of Applied Phycology. 2010; 22(1): 79-86.
11. Гажа А.К., Звягинцева Т.Н. Влияние сульфа-тированных полисахаридов бурых водорослей на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 19-20.
Сведения об авторах
Горбач Владимир Иванович, к.х.н., с. н. с., Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН; 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159; тел.: Тел. 8-902-526-47-51; e-mail: vigorbach@bk.ru;
Ермак Ирина Михайловна, д.х.н., с. н. с., Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН; 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159; тел.: Тел. 8-902-526-47-51; e-mail: imyer@mail.ru;
© Коллектив авторов, 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817781
УДК 616.37-002:616.33-002
Е.Ю. Добряков1, Е.В. Персиянова12, Т.С. Запорожец12, Д.В. Витковская1
применение биологически-активных веществ
из морских ежей в качестве средства сопровождения лечения
и профилактики заболеваний пищеварительной системы
1 ФГБУЗ «Медицинское объединение Дальневосточного отделения РАН» (МО ДВО РАН), Владивосток
2 ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», Владивосток
Проведена оценка действия биологически-активного соединения из морских гидробионтов - эхинохрома А («Сироп на фруктозе «Тимарин, экстракт морского ежа») в целях профилактики и лечения болезней пищеварительной системы. Установлена эффективность применения сиропа в качестве дополнительного
