CC BY
40
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА... 1 37
УДК 577.352.2:615.012.1:616-091.818 H.B. Грищенко, М.А. Барышникова, А.П. Полозкова, H.A. Оборотова, А.Ю. Барышников ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ НЕ ИСПОЛЬЗУЮТ CD95-3ABHCHMblfl СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ АПОПТОЗА
ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Грищенко Наталия Викторовна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: [email protected]
Статья поступила 13.01.2014, принята к печати 20.01.2014
Резюме
В представленной работе сравнивалось цитотоксическое действие двух лекарственных форм Аранозы на клеточных линиях диссеминированной меланомы человека, экспрессирующих и не экспрессирующих CD95/Fas рецептор. Была высказана и подтверждена результатами проведенного эксперимента гипотеза о том, что липо-сомальные препараты не индуцируют программированную клеточную гибель посредством активации CD95-сигнального пути.
Ключевые слова: CD95-pe4enrop, липосомы, апоптоз.
N.V. Grischenko, M.A. Baryshnikova, A.P. Polozkova, N.A. Oborotova, A.Yu. Baryshnikov
LIPOSOMAL ANTICANCER DRUGS ARE NOT THE INDUCERS OF CD95-DEPENDENT APOPTOSIS
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
We have compared the cytotixic effect of two liposomal drug formulation of Aranoza on disseminated melanoma cell lines expressing or not the CD95/Fas receptor. The data obtained confirmed our previous hypothesis that liposomal anticancer drugs do not participate in programmed cell death induced by CD95 signaling pathway.
Key words: CD95-receptor, liposomes, apoptosis.
Введение
Долгое время некротическая клеточная смерть рассматривалась как единственный механизм действия токсических противоопухолевых препаратов. С появлением более точных аналитических и молекулярно-биологических методов исследования появилась возможность изучения химико-биологического взаимодействия с клеткой очень низких концентраций противоопухолевых препаратов [31]. Было идентифицировано несколько новых механизмов программированной клеточной смерти, таких как апоптоз, аутофагия, пироптоз и др. [28].
Появление новой концепции программированной клеточной смерти привело к изменению мнения о механизмах действия противоопухолевых препаратов [31]. Один из механизмов программированной клеточной смерти - CD95/Fas рецептор-но-лигандный сигнальный путь апоптоза [2; 27; 29]. Противоопухолевый препарат взаимодействует с CD95-peцeптopoм и на поверхностной цитоплазма-тической мембране клетки появляется аутокринный CD95-лигaнд, который активирует этот сигнальный путь клеточной гибели. При отсутствии CD95/Fas рецептора на клеточной поверхности апоптоз не индуцируется. Это было продемонстрировано с помощью клеток линии 1игка^А4, утративших экспрессию CD95-peцeптopa [33]. Следовательно, нарушение CD95-peцeптopнo-лигaнднoгo сигнального пути индукции апоптоза может быть одной из причин лекарственной резистентности.
Ранее было показано, что липосомальные противоопухолевые препараты преодолевают мно-
№ 1/том 13/2014
жественную лекарственную устойчивость, опосредованную гликопротеидом pgp170, продуктом гена МЛУ (MDR1) [26]. Липосомальная лекарственная форма изменяет биодоступность препарата, его фармакокинетику и взаимодействие с клеткой [1; 4-6; 9; 10; 13; 14; 16; 17; 20-25].
Нами была высказана гипотеза о том, что липосомальные препараты не индуцируют программированную клеточную гибель посредством активации CD95 сигнального пути, т.к. липосомы защищают препарат от контакта с поверхностной клеточной мембраны. Для проверки этой гипотезы мы сравнили цитотоксическое действие двух лекарственных форм аранозы - лиофилизата для приготовления р-ра для инъекций (араноза-лио) и липосомальной - на клетки меланомы линии Mel Mtp, не имеющей CD95 рецептор, и Mel Kor, Mel Ibr и Mel Z, экспрессирующие рецептор. Эти линии клеток диссеминированной меланомы кожи человека были получены в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН [15; 30]. Лекарственные формы аранозы произведены в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН [11; 12]. Араноза - отечественный препарат из класса нитрозометилмичевины, разрешенный для клинического применения при мела-номе кожи человека [3; 18; 19].
Целью данной работы было сравнение в МТТ-тесте цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы - лиофилизата для приготовления раствора для инъекций (аранозы-лио) и липосомальной формы на клеточных линиях меланомы человека, экспрессирующих и не экспрессирующих CD95/Fas-pe4enTop.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА...
Материалы и методы
Исследование проводили с помощью МТТ-теста на 4 клеточных линиях диссеминированной меланомы человека: Mel Mtp, Mel Kor, Mel Ibr и Mel Z, полученных из банка клеточных культур ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.
Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % ТЭС, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), аминокислоты и витамины (ПанЭко, Россия) при 37 °С в атмосфере 5 %-ного СО2.
Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали р-р Версена. Клетки отмывались чистой бессывороточной средой RPMI-1640 и пересаживались в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, USA) по 4*103 клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640 на лунку.
Для оценки цитотоксического действия ара-нозы в каждую лунку добавляли по 20 мкл исследуемой лекарственной формы, и инкубировали с клетками в течение 24; 48 и 72 ч в 5 %-ном С02-инкубаторе при 37 °C.
Обе лекарственные формы аранозы (лиофи-лизат для приготовления раствора для инъекций и липосомальную) исследовали в концентрациях 0,056 мг/мл; 0,112 мг/мл; 0,225 мг/мл; 0,45 мг/мл; 0,9 мг/мл; 1,8 мг/мл, каждую концентрацию ставили в триплете.
В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл полной среды или же по 20 мкл пустых липосом, разведенных полной средой, в тех же количествах, которые использовались для получения исследуемых концентраций липосомальной формы аранозы.
Через 24; 48 и 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ [3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид] (маточный раствор 5мг/мл, конечная концентрация 1мг/мл), и инкубировали 4 ч при 37 °С в 5 %-ном С02-инкубаторе.
После образования формазана надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл ДМСО.
Планшеты помещали на 5-7 мин в термостат при температуре 37°С, после чего встряхивали на шейкере в течение 10 мин. Затем измеряли интенсивность окрашивания среды на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан» (ЗАО «Пикон») при ^=530 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Выживаемость клеток рассчитывалась по формуле:
Выживаемость(%) -
Оптическая ■ плотность ■ клеток ■ в ■ опыте Оптическая ■ плотность ■ контрольных ■ клеток
■х100%
Каждый эксперимент повторяли не менее, чем 3 раза.
Результаты
При сравнении цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы лиофилизиро-ванной и липосомальной на клетки меланомы линии Mel Mtp было обнаружено, что через 8 ч инкубации цитотоксическое действие аранозы существенным образом не проявлялось, и НК50 не была достигнута. Небольшое уменьшение процента живых клеток не
отличалось от контроля (рис. 1А). После инкубации в течение 24 ч липосомальная араноза вызывала гибель клеток Mel Mtp дозозависимым образом (рис. 1Б). ИК50 липосомальной аранозы составила 0,45 мг/мл, аранозы-лио - более 0,9 мг/мл. Эти различия статистически значимы (p<0,05). Различия в цито-токсическом действии препаратов стираются при инкубации клеток Mel Mtp с препаратами в течение 48 и 72 ч (p<0,05) (рис. 1В-Г).
120
100
n*
К 80
?
V 60
m
s 40
п
m 20
0
•Пустые л ипосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
rS'
у
Г~У
t>
6>
О" О' О'
Концентрация, мг/мл
120 100 80 60 40 20 0
■Пустые л ипосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
О' О' о"
Концентрация, мг/мл
Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
120 100 80 60 40 20 0
' Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
& & 4> ¿
О' О' О' °
Концентрация, мг/мл
Рис. 1. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии Mel Mtp:
A: 8 ч инкубации; Б: 24 ч инкубации; В: 48 ч инкубации; Г: 72 ч инкубации.
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА...
120
100
ri"
п 80
о
Р
0) 60
5 S 40
п
m 20
0
Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
гУ
ь
о" о- о- ^
Концентрация, мг/мл
120 100 if 80
40 20 0
'Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
120 100 80 60 40 20 0
-Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
О- О' О'
Концентрация, мг/мл
120 100
£
| 80
ш 60 S
s
ä 40 с8
20 0
■Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
Рис. 2. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии Mel Ibr:
A: 8 ч инкубации;
Б: 24 ч инкубации;
В: 48 ч инкубации;
Г: 72 ч инкубации.
Иные результаты получили при исследовании ци-тотоксического действия препаратов на меланом-ных клетках Mel Ibr, Mel Kor и Mel Z, экспресси-рующих CD95-pe4enTop (рис. 2-4).
На клетках Mel Ibr липосомальная араноза при инкубации в течение 8 ч показала те же результаты что и лиофилизированный препарат, а также пустые липосомы (рис. 2А). После 24 ч инкубации липосомальная араноза была более эффективна, чем
лиофилизированная (p<0,05; рис. 2Б). Спустя 48 и 72 ч результаты были идентичны (p<0,05; рис. 2В-Г).
На клетках Mel Z через 8 ч араноза-лио была более эффективна, чем липосомальная (p<0,05; рис. 3А). Однако, через 24 ч, наоборот, липосомальная араноза была более цитотоксична (p<0,05) (рис. 3, Б). Затем эффективность обоих препаратов была сравнима (p<0,05) (рис. 3, В и Г).
На клетках линии Mel Kor после 8 ч инкубации араноза-лио была более эффективна по сравнению с липосомальной (p<0,05). В последующем цитотоксическое действие обоих препаратов было одинаковым (p<0,05) (рис. 4).
120 100 80 60 40 20 0
Концентрация, мг/мл
-Пустые липосомы "Араноза-лио Липосомальная араноза
120
100
Б 80
щ 60
ЗЕ 40
ей
20
0
У У S >?
Концентрация, мг/мл
■ Пустые липосомы ■Араноза-лио Липосомальная араноза
120
100
Ь 80 о
га 60 is
| 40
.с со
20 0
Пустые липосомы Араноза-лио Липосомальные араноза
Концентрация, мг/мл
120
100
*
£ 80
Ü
И 60
г8 40
20
0
-Пустые липосомы -Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
Рис. 3. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии Mel Z:
A: 8 ч инкубации; Б: 24 ч инкубации; В: 48 ч инкубации; Г: 72 ч инкубации.
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ш 60
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИПОСОМАЛЬНАЯЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА...
120 100 80 60 40 20 0
-Пустые л ипосомы -Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
120 100
6 80
0
1 60
S
I 40
л
со
20 0
- Пустые липосомы -Араноза-лио Липосомальная араноза
Концентрация, мг/мл
120 100 80 60 40 20 0
- Пустые липосомы -Араноза-лио Липосомальная араноза
<А Л rh й ®> V V су ° О' О' О' °
Концентрация, мг/мл
Заключение
Таким образом, результаты проведенного эксперимента подтвердили нашу гипотезу о том, что CD95-сигнальный путь апоптоза не вовлечен в механизм действия липосомальных препаратов и показали, что действительно CD95-отрицательные клетки меланомы линии Mel Mtp резистентны к цитотоксическому действию аранозы-лио, но чувствительны к липосомальной аранозе. Это можно объяснить тем, что липосомы попадают в клетку путем эндоцитоза и не взаимодействуют с CD95-рецептором [6].
Феномен устойчивости клеток меланомы линии Mel Mtp к CD95-3aBHCHMOMy апоптозу впервые был обнаружен Бигвава и др. [7]. При этом клетки Mel Mtp были чувствительны к апоптозу, индуцированному через TNF-рецептор. Ранее А. Соколовская и др. показали, что клетки лимфобла-стного лейкоза сублинии Jurkat/A, утратившие CD95-pe4enTop, устойчивы к цитотоксическому действию доксорубицина, тогда как родительские клетки линии Jurkat - чувствительны [8]. Эту сублинию клеток получили длительным культивированием клеток линии Jurkat в присутствии МКА IPO-4 против антигена CD95 [32].
Различия в цитотоксическом действии препаратов стираются при инкубации клеток Mel Mtp с препаратами в течение 48 и 72 ч. В этом нет ничего удивительного, т.к. при длительной инкубации препараты все равно попадают в клетку и оказывают свое токсическое действие. Неизвестно, какой механизм апоптоза индуцируют липосомальные препараты. Это предстоит выяснить, изучив активацию каспаз.
120 100 80 60 40 20 0
- Пустые липосомы
- Араноза-лио Липосомальная араноза
Рис. 4. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии Mel Kor: A: 8 ч инкубации; Б:24 ч инкубации; В: 48 ч инкубации; Г: 72 ч инкубации.
о?3 o>v о>
Концентрация, мг/мл
Литература
1. Алъбассит Б., Барышникова М.А., Игнатьева Е.В. и др. Разработка липосомальной лекарственной формы нового соединения из класса нитрозоалкилмочевины // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 5.
2. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Программированная клеточная смерть (апоптоз)// Российский онкологический журнал. - 1996. - №1. - С. 58.
3. Барышников А.Ю., Оборотова H.A., Герасимова Г.К., Кубасова П.Ю. Противоопухолевые препараты, разработанные в Российском онкологическом научном центре им.H.H. Блохина РАМН // Вестник Московского общества онкологов. - 2004. - № 11. - С. 3-4.
4. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов // Вестник РАМН. - 2012. - № 3. - С. 23-32.
5. Барышников А.Ю., Барышникова М.А. Иммунолипосомы и мишени их действия // Российский химический журнал. Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева. - 2012. - Т. LVI, № 3-4. - C. 60-7.
6. Барышникова М.А., Зангиева М., Барышников А.Ю. Взаимодействие липидных капсул с клеткой // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 1. - С. 11-5
7. Бигвава Х.Ф. Экспрессия маркеров апоптоза - CD95, Bcl-2, Bax на клеточных линиях меланом // Российский аллергологический журнал. - 2012. - № 1, Вып.1 - С. 53-4.
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА... | 41
8. Блохин Д.Ю., Соколовская А.А., Власенкова Н.К. и др. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, резистентных к апоптозу // Вестник РАМН. - 2007. - №10. - С. 41-6.
9. Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович Г.А. и др. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли //Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т.6, №2. - С.45-9.
10. Дмитриева М.В., Оборотова Н.А., Санарова Е.В., Бунатян Н.Д. Наноструктурированные системы доставки противоопухолевых препаратов // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 4. - С. 21-7.
11. Казеев С.Г., Барышникова М.А., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. Разработка наноструктурированной лекарственной формы аранозы // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т.11, №2. - С. 24.
12. Казеев С.Г., Барышникова М.А., Афанасьева Д.А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. -Т.11, №2. - С. 24.
13. Ланцова А.В., Барышникова М.А., Санарова Е.В. и др. Изучение в системе in vitro наноструктурированной лекарственной формы лизомустина // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 31.
14. Меерович И.Г., Оборотова Н.А. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - № 4. - С. 3-8.
15. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
16. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 4. - С. 62-6.
17. Оборотова Н.А. Липосомальные лекарственные формы противоопухолевых препаратов (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - Т. 35, № 5. - С. 30.
18. Оборотова Н.А. Основные проблемы создания лекарственных форм противоопухолевых препаратов для внутривенного введения // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т. 2, № 2. - С. 27-31.
19. Оборотова Н.А., Лопатин П.В. 30 лет лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т. 3, №4. - С. 3-7.
20. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. - 2009. - Т. 121, № 5. - С. 464.
21. Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Макарова О.А. и др. Доклиническое изучение липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т.2, № 4. - С. 40-5.
22. Смирнова З.С., Оборотова Н.А., Макарова О.А. и др. Эффективность и фармакокинетика липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора «Фотосенс» на основе сульфофталоцианина алюминия // Химико-фармацевтический журнал. - 2005. - Т. 39, № 7. - С. 3-7.
23. Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии. //Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т. 7, № 3. - С. -12.
24. Тазина Е.В., Мещерякова В.В., Игнатьева Е.В. и др. Биофармацевтические исследования термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 1. - С. 40-7.
25. Толчева Е.В., Оборотова Н.А. Липосомы как транспортное средство для доставки биологически активных молекул // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 54-61.
26. Шоуа И.Б., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. и др. Действие липосомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующие активный pgp170 // Российский биотерапевтический журнал. - 2004. -Т. 3, № 1. - С. 20-3.
27. Baryshnikov A.Yu., Polosukhina E.R., Tupitsin N.N. et al. CD95 (Fas/APO-1) antigen is a new prognostic marker of blast cells of acute lymphoblastic leukaemia patients / Book Editor(s): Kaspers, GJL; Pieters, R; Veerman, AJP. Drug resistance in leukemia and lymphoma III Book Series: Advances in experimental medicine and biology. - 1999. - 457. - P. 251-8.
28. Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M. et al. Molecular definitions of cell death subroutines:recommendations of the Nomenclature Committeeon Cell Death 2012 // Cell Death and Differentiation. - 2012. - 19. - P. 107-20.
29. Krammer P.H., Dhein J., Walczak H. et al. The role of APO-1-mediated apoptosis in the immune system // Immunol. Rev. - 1994. - 142. - P. 175-91.
30. Michailova I.N., Morozova L.Ph.,Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines // Melanoma Research. - 2008. - №5. - P. 303-13.
31. Orrenius S., Nicotera P., Zhivotovsky B. Cell death mechanisms and their implications in toxicology // Toxi-cological Sciences. - 2011. - 119. - P. 3-19.
32. Polosukhina E.R., Zabotina T.N., Shishkin Yu.V. et al. Studing of Fas(APO-1/CD95) antigen expression by flow cytometry with monoclonal antibodies IPO-4 // Experimental Experimental Oncology. - 1997. - 19(3). - P. 206-11.
33. Sokolovskaya A.A., Zabotina T.N., Blokhin D.Yu. et al. CD95-dificient cells of Jurkat/A4 subline are resistant to drug-induced apoptosis // Experimental Oncology. - 2001. - 23. - P. 175-81.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ИК50 - ингибирующая концентрация, вызывающая гибель 50% клеток
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
Не следует параллельно использовать термин и его сокращение. Если сокращений больше 10, следует вводить список сокращений. В статьях должна использоваться система СИ. В тексте должны быть указаны ссылки на таблицы и рисунки, например, (табл. 1); (рис. 1) или на рис. 1 представлены... Они должны быть размещены в соответствующих по смыслу абзацах и последовательно пронумерованы. Рисунки и таблицы нумеруются отдельно.
Таблицы должны быть компактными, иметь название, не повторять графики, не должны содержать пустых ячеек (отсутствие данных должно отмечаться тире, «нет данных» или специальным примечанием). Все уточнения и локальные сокращения выносятся в примечания. Таблицы набираются тем же шрифтом, что и основной текст статьи с выравниванием по левому краю, без переносов и красных строк. Точку после последнего слова в ячейке ставить не нужно. Примечания к таблицам выносятся в последней строке таблицы тем же шрифтом. Каждое примечание должно располагаться с новой строки, помечено надстрочной цифрой, которая отделяется от текста примечания пробелом. В конце каждого примечания ставится точка. Примечания нумеруются в соответствии с их появлением в таблице: сверху вниз и слева направо. Размер каждого рисунка (даже если они смакетированы вместе) должен быть не менее 10 х 15 см. Рентгенограммы должны быть представлены в негативном изображении. Иллюстрации сканируют в масштабе 100 % с разрешением 300 dpi. Рентгенограммы, сонограммы, фотографии сканируют в режиме «Gray».
Если иод одной подписью планируется несколько рисунков, каждый должен быть прислан отдельно и соответствовать указанным выше требованиям по качеству.
Графики и схемы нельзя перегружать надписями. Подпись к рисунку должна быть лаконичной, точно соответствовать его содержанию. Если несколько рисунков идут под общей надписью, то сначала приводят ее, а затем названия отдельных рисунков под русскими буквами.
В подписях под рисунками должны быть объяснены все кривые, буквенные, цифровые и другие условные обозначения. В подписях под микрофотографиями следует указать методику микроскопии, увеличение, метод окраски материала. Если иллюстрация заимствуется из другого источника, в конце подписи следует дать на него ссылку. На печатном экземпляре рисунки нумеруют, помечают верх и низ.
Все формулы должны быть тщательно выверены автором, набраны пли встроены в формат текстового редактора. В формулах необходимо различать строчные и прописные, латинские и греческие, подстрочные и надстрочные буквы. Использованные автором сокращения должны быть разъяснены иод формулой.
Список литературы должен быть кратким и содержать не более 20 ссылок для статей, посвященных экспериментальным и клиническим исследованиям, и не более 100 ссылок для обзорных статей. Номера ссылок указывается в квадратных скобках через точку с запятой.
В списке литературы в алфавитном порядке перечисляются курсивом фамилии и инициалы авторов на русском языке, затем на иностранных языках.
Все библиографические ссылки в тексте должны быть пронумерованы в соответствии с их положением в списке литературы. Фамилии иностранных авторов приводятся в оригинальной транскрипции. В список литературы не включаются ссылки на неопубликованные работы и учебники. Ссылки должны быть тщательно выверены авторами, которые несут ответственность за правильность приведенных данных.
Если авторов не более четырех, они упоминаются все, при большем числе авторов перечисляются первые три, далее пишется и др. или et. al.
При ссылке на книгу следует указывать авторов, затем название книги, номер издания, издательство (может отсутствовать), год и страницы (если автор ссылается на всю книгу, то пишется 150 е., если на ее часть, то указывается С. 143-8.), например:
Руководство по гематологии под ред. А.И. Воробьева. - Т. 2. - М.: Ньюдиамед, 2004. - 277 с. Bihrle R., Libertino J.A. Renal cell cáncer with extensión into the vena cava. In: Dekernion B.J., Pavone-Macaluso M. eds., Tumors of kidney. - Baltimore: Williams&Wilkins, 1986. - P. 111-123.
