CC BY
97
УДК: 616.155.32:616.36-002
В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, Н.В. Токарева,
Э.И. Белобородова, Л.Е. Дунаева, Е.В. Белобородова, М.А. Антошина,
В.В. Белоконь, О.Б. Жукова
ЛИМФОЦИТЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С: ПОВЕРХНОСТНАЯ АРХИТЕКТОНИКА, МИКРОВЯЗКОСТЬ МЕМБРАНЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет, Томск
Исследование пролиферативного потенциала, поверхностной архитектоники и структуры плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С умеренной и минимальной степеней активности выявило изменение Т-клеточного лимфопролиферативного ответа и процентного содержания лимфоцитарных клеток с различным типом поверхностного микрорельефа, а также повышение микровязкости липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов.
Ключевые слова: вирус гепатита С, лимфоциты, реакция бласттрансформации лимфоцитов, сканирующая электронная микроскопия, мембрана
Несмотря на постоянно расширяющийся объем знаний о причинах развития хронических вирусных инфекций, многие вопросы, касающиеся механизмов возникновения и прогрессирования этой патологии, остаются открытыми. Недостаточно изучены факторы, позволяющие вирусу гепатита С длительно сохраняться в макроорганизме, и условия, влияющие на развитие хронических форм болезни. Неразрешенным остается вопрос о причинах, приводящих к разным исходам болезни: в одних случаях развивается циклическое течение с элиминацией инфектогена, в других
— длительно сохраняется высокая репликативная активность вируса с формированием хронического воспалительного процесса [5, 10, 11, 18].
Такие особенности хронической вирусной инфекции обусловлены состоянием иммунной системы организма, от адекватности которой зависят течение и исход заболевания. При этом особый интерес к изучению особенностей структурно-функционального статуса лимфоцитарных клеток обусловлен не только тем фактом, что иммунная система, как очевидно, принимает непосредственное участие в реализации инфекционного процесса, но и тем, что иммунокомпетентные клетки сами являются мишенью для действия вируса гепатита С [5, 12].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение структурных и функциональных особенностей лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.
Методика
Обследовали 37 пациентов (22 мужчины и 15 женщин в возрасте от 18 до 45 лет) с хроническим течением вирусного гепатита С умеренной (20 больных) и минимальной (17 больных) степеней активности. У 21 пациента был выявлен 1Ь-генотип, у 12 обследованных — За-генотип и у 4 больных — 2а-генотип вируса гепатита С. Критерием исключения из исследования являлась алкогольная и наркотическая зависимость пациентов. Все пациенты были обследованы до начала проведения лечения. Исследования проводили в соответствии с этическими нормами. Верификация диагноза была проведена на основании данных клинико-эпидемиологического, инструментального (сцинтиграфическое, ультразвуковое и морфологическое исследование печени), серологического (иммуноферментный анализ) и молекулярно-генетического (полимеразная цепная реакция) методов исследования. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров со схожими характеристиками по полу и возрасту. Исследовали стабилизированную гепарином (25 ЕД/мл) венозную кровь, взятую утром до приема пищи.
Культуральную суспензию для теста бласт-трансформации лимфоцитов готовили по методике Е.Д. Гольдберга и соавт. [4]. В суспензию вносили фитогемагглютинин («Difш», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры. Результаты теста выражали количеством неизмененных, переходных и бластных форм лимфоцитов (%) [7].
Поверхностную архитектонику лимфоцитов периферической крови оценивали методом сканирующей электронной микроскопии. Лимфоциты периферической крови выделяли на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Производили их подсчет общепринятыми гематологическими методами (2*105 клеток/мл) [9]. Лимфоциты фиксировали в 2,5% растворе глю-тарового альдегида, постфиксацию материала проводили в 1% растворе четырехокиси осмия и обезвоживали в серии водных растворов этилового спирта возрастающей концентрации. Дегидратированные лимфоциты наносили тонким слоем на алюминиевые подложки, препараты напыляли серебром в вакуумной установке «JEE-4B» («JEOL», Япония). Исследование препаратов проводили с использованием электронного микроскопа «JEM-100 СХ II» с растровой приставкой «ASID-4D» («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ [6]. В соответствии с классификацией, предложенной Г.И. Козинцом [6], в зависимости от особенностей поверхностного микрорельефа лимфоцитов выделяли относительно гладкие клетки, лимфоциты с микроворсинками, клетки с ламеллярными образованиями (со складками и раффлами), лимфоциты со сфероидными образованиями (с пузырями), а также клетки с углублениями и выростами на поверхности.
Для оценки микровязкостных свойств плазматической мембраны лимфоцитов проводили флуоресцентное зондирование клеток флуоро-фором пирен («Sigma», США). Взаимодействие мембраны с флуоресцентным зондом пирен регистрировали на спектрофлуориметре «MPF-4» («Hitachi», Япония). Микровязкость липидной фазы мембраны лимфоцитов оценивали по степени эксимеризации пирена, мигрирующего в ее гидрофобном компартменте (использовали среду 145мМ NaCl, 10мМ трис-Hcl, pH=7,4) при длине возбуждающего света (Хв) 285 нм. Раствор пире-на (растворитель — этанол) добавляли в кювету со взвесью лимфоцитарных клеток до конечной концентрации 10 мкМ, инкубировали в течение 10 мин. Определяли коэффициенты эксимериза-ции пирена, равные отношению максимумов ин-
тенсивностей флуоресценции эксимерной формы зонда при длине волны 470 нм (1470) к мономерным его формам при длинах волн 370 и 390 нм (1370, 1390) соответственно. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановых остатков белка на пирен [2].
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили путем вычисления г-коэффициента Спирмена.
Результаты
Наше исследование было акцентировано на изучении структурно-функционального статуса лимфоцитов периферической крови в условиях развития хронического вирусного гепатита С. Как известно, в ответ на попадание вируса в макроорганизм срабатывают врожденные и адаптивные механизмы иммунного ответа, направленные на ограничение и элиминацию инфекции. Показано, что основная роль в формировании противовирусного иммунитета принадлежит клеточным механизмам, состояние которых определяет как исход первичного инфицирования, так и развитие хронических форм болезни [10, 14, 16]. В то же время имеются убедительные данные в пользу способности вируса гепатита С инфицировать лимфоцитарные клетки и, вероятно, оказывать непосредственное влияние на их структуру и функцию [5, 12, 15]. Важным условием эффективности иммунопатологических механизмов защиты макроорганизма при вирусных инфекциях является интенсивность иммунного ответа, определяемая функциональной активностью Т-лимфоцитов. Проведенное нами исследование реакции бласттрансформации лимфоцитов периферической крови под влиянием специфического стимулятора Т-клеточного звена иммунитета фитогемагглютинина у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С умеренной и минимальной степеней активности позволило зарегистрировать изменение функциональной активности Т-систе-мы иммунитета (Таблица 1). Предыдущими исследованиями показано, что пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, оцененный в реакции бластной
Таблица 1
Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови (%) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (Х ±ш)
Формы лимфоцитов Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом С
Умеренной степени активности Минимальной степени активности
Бласттрансформированные 74,26±1,78 89,12±2,33*** 92,64±2,56**
Переходные 18,99±0,95 8,55±0,78** 6,02±0,56*
Неизмененные 6,75±0,38 2,33±0,12*** 1,34±0,09**
Примечание. *р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
трансформации, изменялся при развитии многих вирусных инфекций (Эпштейн-Барр-вирусная, цитомегаловирусная, герпесвирусная) [13]. Вероятно, обнаруженное нами изменение Т-клеточно-го лимфопролиферативного потенциала правильно расценивать с позиции существования типовой универсальной реакции иммунокомпетентных клеток на длительную персистенцию вирусов.
Функциональная активность лимфоцитов, как очевидно, определяется особенностями их ультраструктуры [6]. Оценка поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови позволила выявить отчетливые изменения микрорельефа клеток. Так, у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С умеренной и минимальной степеней активности было отмечено достоверное снижение количества относительно гладких и ворсинчатых лимфоцитов на фоне увеличения количества клеток со сфероидными и ламеллярными образованиями на поверхности
б
Рис. Поверхностная архитектоника лимфоцитов периферической крови при хроническом вирусном гепатите С минимальной (а) и умеренной (б) степени активности
Сканирующая электронная микроскопия. а — лимфоциты со складчатой поверхностью, х 10000. б — лимфоцит со сфероидными образованиями на поверхности, х 10000.
по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров (Таблица 2, Рис.). Однако при обследовании больных с хроническим вирусным гепатитом С минимальной степени активности было выявлено статистически значимое снижение (относительно контроля) процентного содержания лимфоцитов с углублениями и выростами на поверхности (Таблица 2). Следует также подчеркнуть, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С минимальной степени активности количество лимфоцитарных клеток со сфероидными образованиями на поверхности было практически в 3 раза выше, чем у больных с хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности (Таблица 2, Рис.).
На наш взгляд, изменения поверхностной архитектоники лимфоцитарных клеток у обследованных пациентов могли быть обусловлены, с одной стороны, непосредственным воздействием вируса гепатита С на плазматическую мембрану клеток [5, 12, 18], с другой, что наиболее вероятно, — изменением функциональной активности лимфоцитов [18]. В пользу последнего предположения свидетельствовали повышение количества лимфоцитов с разнообразными образованиями на поверхности (пузыри, складки) [6], а также результаты проведенного корреляционного анализа. Было показано, что усиление Т-клеточного пролиферативного ответа сопряжено с возрастанием количества лимфоцитов со сфероидными образованиями на поверхности клетки (при хроническом гепатите С умеренной степени активности — г=0,91, р<0,01;минимальной степени активности — г=0,87, р<0,05). Исходя из полученных результатов логично предположить, что структурная дезорганизация поверхностного рельефа лимфоцитов представляет собой один из вариантов ответной реакции клеток на антигенное воздействие [6].
Основу структурной организации плазматической мембраны лимфоцита составляет липидный бислой с асимметрично встроенными белками. Липидные молекулы, являясь важными структурными и функциональными компонентами мембраны клетки, поддерживают конфор-мационное состояние мембранных ферментов, регулируют подвижность и активность внутри-мембранных белков, обеспечивают в клетке селективную проницаемость и работу рецепторного аппарата. Нормальное функционирование плазматической мембраны зависит от ее мик-ровязкостных свойств, определяемых, главным образом, состоянием липидной фазы [3, 8, 17]. В предпринятом нами исследовании было выявлено отчетливое изменение текучести липидного бислоя мембраны лимфоцитов у пациентов с
хроническим вирусным гепатитом С умеренной и минимальной степеней активности (Таблица 3). Об этом свидетельствовало достоверное снижение коэффициентов эксимеризации (1470/1370 и 1470/1390) неполярного зонда пирен, диффундирующего в гидрофобном компартменте клеточной мембраны, при длине волн возбуждающего света 285 нм. Поскольку величина эксимеризации пире-на обратно пропорциональна вязкости липидной фазы мембраны, зарегистрированное снижение средних величин этих показателей у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С указывает на повышение упорядоченности липидных молекул в лимфоцитарной мембране в области белок-липидных контактов. Также в пользу нарушений белок-липидных взаимодействий свидетельствовало достоверное снижение средних значений величины индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофановых остатков мембранных белков на пирен (Таблица 3).
Известно, что изменение поверхностной архитектоники клеток крови является результа-
том дезорганизации структуры плазматической мембраны [1]. Проведенный корреляционный анализ позволил подтвердить данное положение. Так, у обследованных пациентов с хроническим вирусным гепатитом С снижение коэффициента эксимеризации пирена 1470/1390 при 285 нм было связано со снижением количества относительно гладких (при хроническом гепатите С умеренной степени активности — г=0,95, р<0,01; минимальной степени активности — г=0,67, р<0,05) форм лимфоцитов.
Заключение
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при хроническом вирусном гепатите С имеют место отчетливые структурнофункциональные изменения лимфоцитов периферической крови. Выявленные нами изменения поверхностной архитектоники, микровязкости мембраны и функциональной активности лимфоцитов при хроническом вирусном гепатите С, вероятно, способствуют поддержанию длительной вирусной персистенции.
Таблица 2
Содержание лимфоцитов периферической крови с различным типом поверхностного микрорельефа (%) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (Х± ш)
Типы лимфоцитов Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом С
Умеренной степени активности Минимальной степени активности
Относительно гладкие 57,52±3,24 37,20±2,15** 32,35±3,24**
Ламеллярные 21,69±1,62 46,33±3,12** 44,51±2,08**
Ворсинчатые 7,95±0,83 1,44±0,32** 3,62±1,41***
С углублениями 1,49±0,24 1,34±0,08 4,91±1,38**
С выростами 9,16±1,13 8,43±1,10 4,60±1,02** # # #
С пузырями 2,19±0,35 5,26±1,07*** 10,01±1,42** # #
Примечание. # # #р<0,05, # # р<0,01 по сравнению с аналогичными показателями у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности. *р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
Таблица 3
Характеристика взаимодействия флуоресцентного зонда пирен с плазматической мембраной лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (Х ± т)
Параметры флуоресценции Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом С
Умеренной степени активности Минимальной степени активности
лМ5 нм, усл. ед. 1,373±0,019 1,195±0,013 ** 1,099±0,024 *
І470/139скпри лВ=285 нм, усл. ед. 1,400±0,012 1,207±0,016 ** 1,232±0,016 **
Величина миграции энергии с триптофана на пирен, % 59,48±3,05 47,30±2,58 ** 49,23±2,17 ***
Примечание: *р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-1051.2003.4.
Lymphocytes at chronic hepatitis С: surface architectonic, microviscousity of membrane and functional activity
V.V. Novitsky, I.O. Naslednikova,
N.V. Ryazantseva, N.V. Tokareva,
E.I. Beloborodova, L.E. Dunaeva,
E.V. Beloborodova, M.A. Antoshina, V.V. Belokon’, O.B. Zhukova
The study of proliferative potential, surface architectonics and structure of plasma membranes of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis C of moderate and minimal activity revealed some changes in T-cell proliferative response, changes in the percentage of lymphocytes with different types of surface microrelief as well as increase of microviscousity of the lipid phase of lymphocyte’s plasma membrane.
Литература
1. Атлас. Клинический натоморфоз эритроцита /
В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Е.А. Стеновая и др.
— Томск; М., 2003.
2. Владимиров Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров. — М., 1983.
3. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функция / Р. Геннис. — М., 1997.
4. Гольдберг Е.Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.П. Шахов.
— Томск, 1992.
Б. Ивашкин В.Т., Маммаев С.Н., Буеверов А.О. и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатоло-гии, конрологии. 2000. №Б. С. 7-12.
6. Клетки крови — современные технологии их анализа / Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, Д.А. Шмаров и др. — М., 2002.
7. Козинец Г.И. // Проблемы гематологии и переливания крови. — 1978. — № 7. — С. 41-46.
8. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. — Минск, 1987.
9. Лабораторные методы исследования в клинике / Под. ред. В.В. Меньшикова. — М., 1987.
10. Маммаев С.Н., Лукина Е.А., Шульпекова О.Ю. и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепато-логии, конрологии. — 2002. — № 2. — С. ББ-60.
11. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова
С.В. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2003. — Т. 13Б. — № 3. — С. 343-348.
12. Серов В.В., Апросина З.Г., Игнатова Т.М. и др. // Вестник РАМН. — 2003. — № 4. — С. 34-37.
13. Уразова О.И., Новицкий В.В., Помогаева А.П. и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2002.
— № 12. — С. 34-36.
14. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. // Иммунология. — 2000. — № 1. — С. 61-64.
1Б. Guarini P., Stanzial A.M., Olivieri O. et al. // Clin. Chim. Acta. — 1998. — Vol. 270. — Р. 139-1Б0.
16. Kozeil M.J. // J. of Viral Hepatitis. — 1997. — Vol.
4. — № 2. — P. 31-41.
17. Mavoungou E., Georges-Courbot M.C., Poatu-Ma-voungou et al. // J. Acguir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. — 1997. — Vol. 16. — № 1. — P. 1-9
18. Zignego A.L., De Carli M., Monti M. et al. // J. Med. Virol. — 199Б. — Vol. 26. — P. 190-19Б.
