Лептин и адипонектин натощак и после глюкозной нагрузки у женщин с гипертиреозом Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© БОЕВА Л. НЕКИМОВА М. ВДОГАДИН С.А.

УДК 616.441-008.61-055: 547.96: 612.122.1

ЛЕПТИН И АДИПОНЕКТИН НАТОЩАК И ПОСЛЕ ГЛЮКОЗНОЙ НАГРУЗКИ У ЖЕНЩИН С ГИПЕРТИРЕОЗОМ

Л.Н. Боева, М.В. Екимова, С.А. Догадин

Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.

Войно-Ясенецкого, ректор - проф. И.П. Артюхов; кафедра внутренних болезней №2, зав. - д.м.н., проф. И.В. Демко, Красноярская краевая клиническая больница, гл. врач - Е.Е. Корчагин.

Резюме. Целью исследования явилось изучение содержания лептина и адипонектина натощак и через 2 часа после глюкозной нагрузки у 20 пациенток с диффузным токсическим зобом до лечения, у 25 женщин с эутиреозом в сочетании с экзогенно-конституциональным ожирением и у 13 практически здоровых женщин. Выявленное снижение базального лептина в крови и снижение уровня адипонектина на фоне глюкозной нагрузки у женщин с гипертиреозом доказывает влияние гормонов щитовидной железы на эндокринную функцию жировой ткани.

Ключевые слова: адипокины, лептин, адипонектин, гипертиреоз,

эутиреоз.

Боева Лариса Николаевна - аспирант каф. внутренних болезней №2 КрасГМУ; e-mail: boeval@mail.ru.

Екимова Марина Викторовна - Д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО КрасГМУ; 8(391)2280745.

1

Догадин Сергей Анатольевич - д.м.н., проф. каф. внутренних болезней №2 с курсом эндокринологии КрасГМУ; e-mail: do gadin@online.ru.

Лептин и адипонектин - биологически активные пептиды, секретируемые адипоцитами, отнесены к ключевым регуляторам энергетического баланса, играют важную роль в регуляции углеводного и жирового обмена [11,12]. Секреция лептина и адипонектина определяется состоянием тканевого метаболизма, массой жировой ткани, количеством потребляемой пищи. Глюкоза и инсулин оказывают регулирующее влияние на содержание адипокинов. Большинство исследователей отводят лептину важную роль при формировании метаболических осложнений, связанных с ожирением: инсулинорезистентности, дислипидемии, эндотелиальной дисфункции [5,6]. Адипонектин, напротив, повышает чувствительность тканей к инсулину, обладает противовоспалительным и антиатерогенным действием [13].

Результаты исследований последних лет позволяют предположить участие лептина и адипонектина в метаболических и нейроэндокринных процессах, характерных не только для ожирения, но и для состояний дефицита массы тела: кахексии, нервной анорексии и неспецифических расстройств аппетита [7,12,14]. Снижение массы тела преимущественно за счет жировой ткани является, в свою очередь, одним из наиболее частых клинических симптомов тиреотоксикоза [2,3]. Гипертиреоз ведет к декомпенсации углеводного обмена, что должно отражаться на функциональной активности адипоцитов [1].

Данные литературы о содержании лептина и адипонектина и их взаимосвязи с антропометрическими и гормонально-метаболическими параметрами у пациентов с нарушенной функцией щитовидной железы противоречивы [10,15].

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение уровня лептина

2

и адипонектина до и после глюкозной нагрузки у женщин с эутиреозом и гипертиреозом.

Материалы и методы

В открытое одномоментное нерандомизированное исследование включены 58 женщин, в том числе 20 больных диффузным токсическим зобом (ДТЗ) до лечения, в возрасте от 21 до 56 лет (средний возраст 39,1 ± 9,9 лет). Диагноз верифицировали на основании жалоб, данных анамнеза, объективного осмотра, результатов гормонального и сонографического обследований. В работе использовалась классификация заболеваний щитовидной железы (И.И. Дедов 2000), в том числе классификация тиреотоксикоза по степени тяжести [3].

Критериями включения в целевую группу являлись: тиреотоксикоз средней степени тяжести, отсутствие приема тиреостатических препаратов и препаратов, содержащих йод.

Критериями исключения были: мужской пол, наличие токсической

аденомы, тиреотоксикоз тяжелой степени, наличие сопутствующих заболеваний, требующих лечения, беременность, лактация.

Группа сравнения включала женщин, не имеющих заболеваний щитовидной железы (по данным клинического, гормонального и ультрасонографического исследований) и состояла из двух подгрупп: 1-я группа - 13 практически здоровых женщин с нормальной массой тела (индекс массы тела от 19 до 24,8 кг/м ), 2-я - 25 женщин с экзогенноконституциональным ожирением (индекс массы тела от 30,5 до 57,2 кг/м2).

В работе с пациентами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Проведение исследовательской работы одобрено на заседании этического комитета Красноярской краевой клинической больницы 13.09. 2007 г. № 20.

Всем женщинам выполнено одинаковое обследование, включающее

3

врачебный осмотр, антропометрические измерения с расчетом индекса массы тела (ИМТ), стандартный пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ), ультрасонографию щитовидной железы, исследование гормонов щитовидной железы, инсулина, адипокинов (лептина и адипонектина).

Антропометрические измерения проводили в утренние часы по общепринятой методике. ИМТ рассчитывался по формуле: масса тела (кг) / рост в м 2.

Забор крови осуществлялся из пальца и из кубитальной вены натощак (после 12 - часового голодания) и через 2 часа после ПГТТ с 75,0 гр. безводной глюкозы, растворенной в 300 мл воды выпитой в течение 3-5 минут (ВОЗ, 1999).

Исследование концентраций тиреотропного гормона (ТТГ), свободного Т4 (св.Т4), инсулина в сыворотке крови проводилось радиоиммунологическим методом с помощью стандартных коммерческих тест-наборов TSH IRMA Kit, FT4 RIA Kit, Insulin IRMA Kit (Immunotech, Чехия), согласно приложенным к ним инструкциям, на автоматической системе для радиоиммунологического анализа «Stratec SR-300» (Германия). Нормативные показатели ТТГ - 0,174,05 мЕд/мл, св.Т4 - 11,5 - 23,0 пмоль/мл, инсулина - 15,1 - 157,9 пмоль/л.

Определение глюкозы капиллярной крови изучалось унифицированным глюкозооксидантным методом на глюкозоанализаторе «Экзан-9» (Литва).

Содержание лептина и адипонектина в крови определялось методом ИФА с помощью тест-наборов «Leptin ELISA» (DBC, Канада) и «Human Adiponectin ELISA» (BioVendor, Чехия) соответственно, согласно инструкциям к наборам.

Лабораторные исследования проводились на базе Регионального лабораторно-диагностического центра ИХМИ, Красноярск (директор - к.б.н. А. В. Светлаков).

Сонографическое обследование щитовидной железы выполнялось на аппарате «Aloka SSD-1700» (Япония) с линейным датчиком 7,5 МГц, увеличенным считался объём щитовидной железы свыше 18 мл у женщин

4

при расчете по формуле I. Бгипп.

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием пакета прикладных программ 81айвйеа 6.0 (81а18ой, США, 2001). Проверка нормальности распределения количественных признаков определялась по критерию Шапиро-Уилка. Для оценки различий количественных данных в независимых выборках использовался критерий Манна-Уитни (показатель и), для оценки различий в зависимых выборках - критерии Вилкоксона (показатель ^). Данные представлены в виде Ме (25; 75) (медиана - 25-й и 75-й процентили) или М ± ББ (выборочное среднее ± стандартное отклонение). Для оценки взаимосвязи признаков проводили корреляционный анализ с расчетом коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

У пациенток с ДТЗ, в дальнейшем именуемых как группа женщин с гипертиреозом, были выявлены классические изменения в тироидном статусе, (табл.1) снижение массы тела от 3 до 9 кг отметили 15 (75%) женщин. Длительность заболевания составила от 1 месяца до 2-х лет, у 7 (35%) женщин выявлен рецидив тиреотоксикоза, после длительной ремиссии (более одного года).

При сравнительном анализе ИМТ и объема талии (ОТ) (Табл.1) в группе женщин с гипертиреозом в сравнении с контрольной группой эутиреоза с нормальной массой тела различий не оказалось.

Уровень лептина у женщин с гипертирезом был в 1,5 раз ниже в сравнении с контрольной группой (эутиреоз с нормальной массой тела) и в 4 раза ниже в сравнении с группой - эутиреоза с ожирением (табл.1).

Уровень адипонектина у женщин в группе - эутиреоз с ожирением был в 1,3 раза ниже в сравнении с контрольной группой (эутиреоз с нормальной массой тела) ив 1,2 раза ниже в сравнении с группой больных

5

гипертиреозом. Статистически значимых изменений в уровне базального адипонектина между группами больных с гипертиреозом и эутиреозом, имеющих нормальную массу тела не выявлено (табл.1).

По данным М. БикисЫ и СБ. Бткпа&Б й а1., в экспериментальных условиях гипертиреоз ассоциирован с повышением уровня глюкозы натощак и при пищевой нагрузке, что объясняется снижением секреции инсулина и усиленным глюконеогенезом под действием тироидных гормонов [8,9]. В нашей работе глюкозная нагрузка также использовалась для оценки состояния углеводного обмена в условиях гипертиреоза.

У обследованных нами женщин с гипертиреозом нарушений углеводного обмена не выявлено (табл.2). В группе женщин с эутиреозом и ожирением отмечалось повышенное содержание инсулина натощак (1,7 раза) и через 120 минут после глюкозной нагрузки в сравнении с группами женщин с гипертиреозом и эутиреозом имеющих нормальную массу тела.

В ответ на глюкозную нагрузку, содержание лептина через 120 минут было достоверно снижено во всех трех исследуемых нами группах (Рис. 1).

В то же время в ходе ПГТТ через 120 минут только в группе женщин с гипертиреозом нами выявлено статисически значимое снижение содержания адипонектина (рис.2).

В группе женщин с эутиреозом и ожирением достоверных изменений в содержании адипонектина после глюкозной нагрузки не наблюдалось (рис.2).

Хорошо известно, что высокий уровень тироидных гормонов приводит к преобладанию катаболических процессов, повышению потребления кислорода и выделению тепла, уменьшению содержания гликогена в печени [1,3]. Поэтому в качестве рабочей гипотезы мы рассматривали повышенный уровень лептина при гипертиреозе как один из компенсаторных механизмов восстановления энергетического баланса. Однако наши предположения не подтвердились, поскольку уровень лептина был низким в сравнении с контрольными группами, что, вероятно, можно объяснить ответной реакцией

6

на потерю массы жировой ткани или одним из звеньев регуляторных механизмов, направленных на сохранение энергетических ресурсов. Прямого влияния гормонов щитовидной железы на уровень лептина нам выявить не удалось.

Секреция лептина тесно связана с метаболизмом глюкозы и инсулина [12]. В группе женщин с эутиреозом, имеющих нормальную массу тела была выявлена прямая корреляция сильной степени между лептином и инсулином (г=0,78, р=0,0016), что можно объяснить как прямым влиянием лептина на транскрипцию генов инсулина, так и косвенным воздействием инсулина на секрецию лептина посредством участия в утилизации глюкозы [14].

При увеличении массы тела у женщин с эутиреозом взаимосвязь лептина с инсулином ослабевает, но проявляется взаимосвязь лептина с массой жировой ткани (ИМТ, ОТ) (г=0,6, р=0,000). В группе гипертиреоза выявлена отрицательная связь лептина с глюкозой (г=-0,66, р=0,001), что, вероятно, обусловлено измененным метаболизмом глюкозы, усиленным глюконеогенезом.

Характер секреции лептина, в ответ на пищевую углеводную нагрузку, в нашем исследовании не зависел от уровня тироидных гормонов и был одинаков во всех группах, что указывает на наличие более сложных регуляторных взаимоотношений, направленных на поддержание гомеостаза.

Уровень адипонектина чаще связывают с изменениями антропометрических данных и композиционного состава тела [1,4], что было показано и в нашем исследовании. Достоверно низкий уровень адипонектина наблюдался в группе женщин с эутиреозом и ожирением, в тоже время изменения уровня адипонектина в ответ на снижение массы тела в группе женщин с гипертиреозом не установлено.

Результаты проведенных нами исследований не выявили прямой взаимосвязи адипонектина с тироидными гормонами, что согласуется с данными других авторов [15].

7

Тем не менее, мы можем предположить, что метаболическая активность адипонектина в условиях гипертиреоза изменяется. В ответ на пищевую углеводную нагрузку, снижение уровня адипонектина и наличие взаимосвязи адипонектина с уровнем глюкозы наблюдались только в группе женщин с гипертиреозом, что может быть ранним признаком снижения чувствительности тканей к инсулину [14]. В отличие от данных некоторых исследователей [2,4], мы не выявили наличия взаимосвязи адипонектина с инсулином при гипертиреозе.

Полученные данные позволяют оценить изменение метаболической активности адипонектина как адаптационный ответ на нарушенный метаболизм глюкозы в условиях длительной гиперпродукции тироидных гормонов.

Таким образом, изменение базального уровня лептина и метаболической активности адипонектина можно рассматривать как результат измененного метаболизма у женщин в состоянии гипертиреоза и доказательство влияния гормонов щитовидной железы на эндокринную функцию жировой ткани.

Fasting and after glucose load leptin and adiponektin in women with

HYPERTHYREOSIS

L.N. Boeva, M.V. Ekimova, S.A. Dogadin.

Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Abstract. We studied concentration of leptin and adiponectin in fasting condition and into two hour after glucose load in 20 women with defuse toxic goiter, in 25 women with euthyreosis combined with exogenous obesity and 13 healthy women. Decreased basal concentration of blood leptin and adiponectin in women with hyperthyreosis proves the influence of thyroid hormones on endocrine function of the adipose tissue.

8

Key words: adipokines, leptin, adiponectine, hyperthyreosis, euthyreosis.

Литература

1. Балаболкин М.И., Клебанова Е. М., Креминская В.М. Фундаментальная и клиническая тиреоидология / Руководство. - М.: Медицина, 2007. - 814 с.

2. Бутрова С.А., Ершова Е.В., Ильин А.В. и др. Адипонектин у мужчин с абдоминальным ожирением // Ожирение и метаболизм. -2006. - №2. - С.32-36.

3. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Марова Е.И. и др. Болезни органов эндокринной системы. - М.: Медицина, 2000. - 568 с.

4. Танянский Д.А., Фирова Э.М., Шатилина Л.В. и др. Связь уровня адипонектина с обменом липидов и углеводов у женщин: роль массы тела // Вестн. СПб. ун-та. - 2008. - №4. - С.56-60.

5. Catalano P.M., Hoegh M., Minium J. et al. Adiponectin in human pregnancy: implications for regulation of glucose and lipid metabolism // Diabetologia. - 2006. - Vol.49. - P. 1677-1685.

6. Chandran M., Phillips S.A., Ciaraldi T. et al. Adiponectin: more than just another fat cell hormone? // Diabetes Care. -2003. - Vol.26. - P. 2442 -2450.

7. Dimitriadis GD, Raptis SA. Thyroid hormone excess and glucose intolerance // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. - 2001. - Vol.109. - P.225-239.

8. Tagami T., Satoh N., Usul T. et al. Adiponectin in Anorexia Nervosa and Bulimia Nervosa // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2004. -Vol.89. -P.1833-1837.

9. Feldt-Rasmussen U. Thyroid and leptin // Thyroid. - 2007. - Vol. 7. -Р 413-418.

10. Fukuchi M, Shimabukuro M, Shimajiri Y. et al. Evidence for a deficient pancreatic beta-cell response in a rat model of hyperthyroidism. //

9

Life Sci. - 2002. - Vol.7, №9. - P.1059-1070.

11. Fruhbeck G Gomez-Ambrosi J., Muruzabal F. J. et al. The adipocyte: a mobel for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation // AJP Endocrinology and Metabolism. - 2001. - Vol. 280. - P. 827-847.

12. Gaillard S., Gaillard R-C. Adipose tissue as an endocrine organ // Obesity Metab. - 2007. - Vol.3. - Р.191-205.

13. Gale S.M., Castracane V.D., Mantzoros C.S. Energy homeostasis, obesity and eating disorders: recent advances in endocrinology // The Journal of Nutrition. - 2004. - Vol. 134. - P. 295-298.

14. Havel PG. Update on adipocyte hormones: Regulation of energy balance and carbohydrate/lipid metabolism // Diabetes. - 2004. - Vol.53. -P143-151.

15. Pontikides N., Krassas GE. Basic Endocrine products of adipose tissue in states of thyroid dysfunction // Thyroid. - 2007. - Vol. 17. - P421-431.

10

© ДУДИНА М.А., ДОГАДИН С.А., ЛОБЫНЦЕВА Л.А., ГАЙДУК К.К., БОРОВИК О.В.

УДК 616.432 - 008.61- 021.1 - 036

СОДЕРЖАНИЕ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА И ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА-I В КРОВИ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОБЪЕМОМ СОМАТОТРОПИНОМЫ ГИПОФИЗА У

БОЛЬНЫХ АКРОМЕГАЛИЕЙ М.А.Дудина, С. А. Догадин, Л. А. Лобынцева, К.К. Гайдук, О.В.Боровик Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.

Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; Эндокринологический центр КГБУЗ «Краевая клиническая больница», Красноярск, зав. - д.м.н., проф. С.А. Догадин.

Резюме. В статье представлены выявленные взаимосвязи между основными гормональными показателями активности соматотропиномы гипофиза (ИФР-I, СТГ) и объемом опухолевой ткани у 95 пациентов с впервые выявленной акромегалией. При акромегалии существует взаимосвязь между уровнем повышения ИФР-I и объемом опухолевой ткани (р=+0.40; p=0.01), базальным СТГ и объемом соматотропиномы гипофиза (р=+0.33 (p=0.02), а также между базальной концентрацией СТГ и ИФР-I (р=+0.54; p<0.001).

Ключевые слова: соматотропинома, инсулиноподобный фактор роста-I (ИФР-I), соматотропный гормон (СТГ), оральный глюкозотолерантный тест (ОГТТ).

Дудина Маргарита Андреевна - клинический ординатор каф. внутренних болезней №2 с курсом ПО КрасГМУ, специальность - эндокринология; e-mail: margo85_@bk.ru.

Догадин Сергей Анатольевич - д.м.н., проф., зав. курсом эндокринологии PDF created with pdfFactory Pro trial version www. pdffactory. com

каф. внутренних болезней №2 с курсом ПО КрасГМУ, главный внештатный эндокринолог Красноярского края, зав. краевым эндокринологическим центром КГБУЗ «Краевая клиническая больница»; тел.: 8(391) 2201508.

Гайдук Конкордия Константиновна - к.м.н., ассист. каф. внутренних болезней №2 с курсом ПО КрасГМУ; тел. 8(391)2201513.

Соматотропинома - моноклональная опухоль гипофиза, происходящая из соматотрофов и экспрессирующая избыточное количество соматотропного гормона (СТГ, соматотропин). Гормон роста оказывает на организм прямое и опосредованное воздействие, регулируя секрецию инсулиноподобных факторов роста, особенно инсулиноподобного фактора роста I типа (ИФР-I) -соматомедина С. Длительное воздействие на организм избытка СТГ и ИФР-I приводит к развитию акромегалии, повышая риск смерти и уменьшая продолжительность жизни таких больных [6,7,9]. Согласно многоцентровым эпидемиологическим исследованиям, уровень смертности снижается до уровня смертности в обычной популяции при достижении уровня СТГ менее 2,5 нг/мл [4]. Существуют различные методы оценки уровня СТГ у пациентов с акромегалией. Многие используют однократное определение базального СТГ или в сочетании с измерением уровня его подавления в ходе орального глюкозoтолерантного теста (ОГТТ), другие, основываясь на физиологических колебаниях гормона роста в течение суток, проводят пятикратное мониторирование СТГ в течение дня [10]. Однако нет единого мнения о существующих взаимосвязях между отдельными гормональными

показателями активности и объемом аденомы гипофиза при акромегалии.

Цель: выявить наличие взаимосвязей между основными гормональными показателями активности соматотропиномы (ИФР-I, базальным СТГ) и объемом опухолевой ткани, а также сравнить значения концентрации базального СТГ, СТГ на 60 и 120 минуте ОГТТ, у пациентов с впервые

выявленной акромегалией.

Материалы и методы

В исследование включено 95 пациентов Красноярского краевого регистра больных акромегалией имеющих активную стадию заболевания. Диагноз акромегалии был выставлен на основании анамнеза, объективного осмотра, определения уровней СТГ и ИФР-I в крови натощак, а также в процессе ОГТТ. Маркерами активной стадии акромегалии являлись принятые международным консенсусом (Севилья, 2003) критерии: содержание ИФР-I выше

соответствующей возрастной нормы (по таблицам центральной лаборатории Esoterix, США), уровень СТГ в сыворотке крови натощак более 2,5 нг/мл, отсутствие подавления СТГ до уровня менее 1 нг/мл при проведении ОГТТ с 75 граммами глюкозы [3,8]. Определение содержания базального СТГ и СТГ в ходе орального глюкозотолерантного теста осуществлялось в гормональной лаборатории КГБУЗ “Красноярская краевая клиническая больница” методом иммунорадиометрического анализа c помощью наборов “ИРМА-СТГ” (МПФ ”ДИАС”, Красноярск). Проба на толерантность к глюкозе проводилась по стандартному протоколу (ВОЗД985) [1]. Забор крови проводился натощак, а также на 60 и 120 минуте после приема 75 гр. глюкозы. Тест считался положительным при отсутствии снижения СТГ менее 1 нг/мл. Концентрация ИФР-I определялась иммуноферментным методом с использованием наборов “IDS” (США) с последующим сопоставлением с возрастными и половыми нормами по таблицам лаборатории Esoterix (США). Повышенный уровень ИФР-I представлен как процент от верхней границы возрастной и половой нормы. Всем пациентам проводилась магнитно-резонансная томография области гипофиза с контрастированием омнипаком.

Объем аденомы гипофиза рассчитан по сагиттальным сечениям МРТ гипофиза с помощью формулы Di Chiro и Nelson [8]. Анализ данных проведен с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США). Проверка количественных данных на нормальность проводилась с помощью теста Шапиро-Уилкса (Shapiro-Wilks W-test). Результаты представлены в виде

медианы и интерквартильного интервала между 25-м и 75-м процентилями (Me [25%;75%]). Анализ связи признаков проводился с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (р). Сопоставление значения признака на разных этапах динамического наблюдения проводилось с использованием непараметрического дисперсионного анализа по Фридмену (Friedman ANOVA). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы был принят равным 0,05.

Результаты и обсуждение

У всех пациентов с впервые выявленной акромегалией концентрация ИФР-I превышала допустимые референсные значения, соответствующие возрасту и полу (табл. 1,2). Уровень ИФР-I, рассчитанный в процентах от верхней границы возрастной и половой нормы, оказался повышен от 10-81%, что свидетельствовало о гормональной активности аденомы, приводящей к продолжительной, избыточной продукции соматотропина и патологически высокому уровню клеточной пролиферации [2].

Таблица 1

Содержание ИФР-I в крови у мужчин с активной акромегалией, (n=37)

*

Примечание: - нормальные значения, соответствующие возрасту и полу.

Таблица 2

Содержание ИФР-I в крови у женщин с активной акромегалией, (n=58)

Примечание: - то же, что для табл. 1.

Рис.1. Содержание соматотропного гормона (СТГ) в ходе ОГТТ у 95 больных с активной акромегалией.

Примечание: ОГТТ-оральный глюкозотолерантный тест.

Традиционно “золотым стандартом” изучения гормональной активности соматотропиномы гипофиза при акромегалии является глюкозотолерантный тест, который основан на подавлении секреции СТГ после нагрузки 75 гр. глюкозы, вплоть до минимально определяемых цифр [8]. У обследуемых больных медиана базального СТГ составила 15,56 [4,95;44,2], а медиана

концентрации СТГ на 60 и 120 минуте теста толерантности к глюкозе 10,6 [4,3;39.4] и 11,6 [4,7;33] соответственно (рис. 1). При множественном

динамическом сравнении уровня СТГ не выявлено статистически значимых различий между базальной концентрацией соматотропина и его уровнем в процессе ОГТТ. В тоже время, при корреляционном анализе обнаружена прямая, умеренная положительная связь (р=+0,54; р<0,001) между базальным уровнем СТГ и концентрацией ИФР-І у пациентов с клинико-лабораторной активностью заболевания. Наше исследование подтверждает результаты ранее опубликованных зарубежных работ, в которых авторы установили статистически значимую взаимосвязь между вышеуказанными показателями не только определяя их однократно натощак, но и при мониторировании концентраций СТГ и ИФР-І, у больных с активной акромегалией, каждые 20 минут в течение суток [5].

Наиболее ценным представлялось выявить с помощью корреляционного анализа связь между основными гормональными показателями активности аденомы гипофиза и объемом опухоли при акромегалии. Оказалось, что более сильная взаимосвязь существует между уровнем повышения ИФР-І (%) и объемом опухолевой ткани (р=+0,40; р=0,01), то есть чем больше масса соматотропиномы, тем выше концентрация ИФР-І в крови. В то время как

коэффициент корреляции в паре СТГ/ объем опухолевой ткани оказался меньше (р=+0,33; р=0,02) (рис. 2).

3

Рис.2. Корреляция между ИФР-I, базальным СТГ и объемом (мм) опухолевой ткани у больных с активной акромегалией.

Выявленные взаимосвязи указывают на менее выраженную связь между СТГ и объемом опухоли гипофиза при акромегалии. Данный феномен объясняется пульсирующим характером секреции гормона роста, в отличие от ИФР-I, который имеет более продолжительный период полужизни и не подвержен кратковременным колебаниям. Именно поэтому ИФР-I является более интегрированным показателем, отражающим среднее значение гормона роста за прошедшие сутки, и даже незначительное повышение СТГ сопровождается повышением ИФР-I в крови.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют наличие взаимосвязей между базальным СТГ и ИФР-I, а также между вышеуказанными гормональными показателями активности соматотропиномы и объемом опухолевой ткани. При этом, учитывая особенности секреции гормона роста, стабильное повышение ИФР-I, а также наличие более сильной взаимосвязи между инсулиноподобным фактором роста I типа и объемом опухоли при акромегалии, наиболее целесообразно лабораторно оценивать регрессию соматотропиномы гипофиза по уровню ИФР-I.

Concentration of somatotropin and insulin- like growth factor-1 in

BLOOD, RELATION WITH PITUITARY SOMATOTROPINOMA SIZE IN PATIENTS WITH

ACROMEGALY

М.A.Dudina, S.A. Dogadin, L.А. Lobinceva, O.V. Borovik

Abstract. We revealed relations among main hormone indexes of pituitary somatotropinoma activity (IGF-1, STH) and tumor size on 95 patients with primary diagnosed acromegaly. There are relations among increased IGF-1 rate and tumor size (р=+0.40; p=0.01), basal STH and size of pituitary somatotropinoma (р=+0.33 (p=0.02) and among basal concentration of STH and IGF-1 (р=+0.54; p<0.001) in acromegaly.

Key words: somatotropinoma, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), somatotropin (STH), oral glucose tolerance test (OGTT).

Литература

1. Дедов И.И., Мельниченко Г.А. Эндокринология. - М.: Медицина, 2000. - 632 с.

2. Пронин В.С., Агаджанян С.Э., Гитель Е.П. и др. Особенности клинического течения акромегалии и лечебной тактики в зависимости от возраста пациента при начале заболевания // Пробл. эдокринологии. -2006. - Т.52, №3. - С. 33-39.

3. Arafat A., Mohlig M., Weickert M. et al. Growth Hormone Response during OGTT: The Impact of Assay Method on the Estimation of Reference Values in Patients with Acromegaly and in Healthy Controls and the Role of Gender, Age, and BMI // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2008. - Vol. 93, № 4. -P. 1254-1262.

4. Ayuk J., Clayton R., Holder G et al. Growth hormone and pituitary radiotherapy, but not serum insulin-like growth factor-1 concentrations, predicts excess mortality in patients with acromegaly // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2004. - Vol. 89. - P. 1613-1617.

5. Bajuk S., Barkan A. Assessment of the magnitude of growth hormone

hypersecretion in active acromegaly: reliability of different sampling models // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2008. - Vol. 93. - P. 491-496.

6. Beauregard C., Truong U., Hardy J. et al. Long- term outcome and mortality after transsphenoidal adenomectomy for acromegaly // J. Clin. Endocrinol.-2003. - Vol.58. - P86-91.

7. Gibney J., Healy M., Sonksen P. The growth hormone/insulin-like growth factor-1 axis in exercise and sport // J. Endocr. Rev. - 2007. - Vol. - 28. - P. 603-624.

8. Melmed S., Casanueva F., Cavagnini F. et al. Consensus statement: medical management of acromegaly // Eur. J. Endocrinol. - 2005. - Vol.153. -P. 737-740.

9. Mestron A., Webb S., Astorga R. et al. Epidemiology, clinical characteristics outcome morbidity and mortality in acromegaly base on the Spanish Acromegaly Registery // Eur. J. Endocrinol. - 2004. - Vol. 151. - P1-

9.

10. Sherlock M., Aragon A., Reulent R. et al. Monitoring disease activity using GH and IGF in the follow- up of 501 patients with acromegaly // J. Clin. Endocrinol. - 2009. - Vol.71, №1. - P. 74-81.

© ТАВЛУЕВА Е. В.

УДК 616.132.2-008.64-08

ГЕНДЕРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ В СОДЕРЖАНИИ НЕОПТЕРИНА У ПАЦИЕНТОВ С ИНФАРКТОМ МИОКАРДА И ПОДЪЕМОМ СЕГМЕНТА

ST

Е.В. Тавлуева

НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово, директор - акад. РАМН Л.С. Барбараш.

Резюме. Достоверных различий уровня неоптерина, оцененного на 10-14-е сутки ИМ, у женщин и мужчин выявлено не было. Как у женщин, так и у мужчин с инфарктом миокарда в возрасте старше 66 лет концентрация неоптерина выше, чем у пациентов до 66 лет. У мужчин с неблагоприятным прогнозом уровень неоптерина, оцененный в конце госпитального периода, был достоверно выше, по сравнению с пациентами с благоприятным прогнозом (р=0,0001). Наиболее высокая концентрация изучаемого биомаркера была характерна для мужчин старшей возрастной группы с неблагоприятным годовым прогнозом, по сравнению с мужчинами до 66 лет с неблагоприятным прогнозом (р=0,0286). Подобных различий в группе обследованных женщин выявлено не было.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, гендерные различия, неоптерин.

Тавлуева Евгения Валерьевна - к.м.н. ведущий научный сотрудник лаборатории патофизиологии мультифокального атеросклероза, НИИ

комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово; e-mail: tavlev@cardio.kem.ru.

В последние годы получены доказательства важной роли воспаления в

возникновении атеросклероза и его клинических проявлений. Развитие инфаркта миокарда (ИМ) влечет за собой возникновение системной и локальной воспалительной реакции, активации острофазовых белков, в частности, компонентов системы комплемента, С - реактивного белка (СРБ), орозомукоида, калликреина, кининов. В плазме крови пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) выявляются также неспецифические маркеры воспаления - интерлейкины (IL) - 1,4,6,10, фактор некроза опухоли-а (TNF-а), фибриноген [11]. Существуют данные, что воспалительная реакция у женщин более выражена. Изменения липидного спектра и активация воспалительного процесса развиваются у них в среднем за 2-3 года до наступления менопаузы и, возможно сохраняют свою роль в прогрессировании ИБС [2].

Активно ведется поиск новых информативных биологических маркеров, оценка которых позволит, с одной стороны, уточнить механизмы прогрессирования атеросклероза, с другой, повысить эффективность прогнозирования течения заболевания. Появились первые исследования роли неоптерина в развитии и прогрессировании атеросклероза [10].

Неоптерин является промежуточным продуктом в синтезе биоптерина, участвующего в активации лимфоцитов. Концентрация неоптерина в плазме крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных гамма-интерфероном. Неоптерин как интегральный маркер активации клеточного иммунитета имеет особое значение при хронических воспалительных заболеваниях. В недавно завершенном исследовании LURIC (Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health) было доказано, что неоптерин является независимым предиктором сердечнососудистых событий и сердечно-сосудистой смертности у пациентов как с ИБС, так и без нее [8].

Целью настоящего исследования явилась оценка активности неоптерина у больных ИМ с подъемом сегмента ST в позднем госпитальном периоде в зависимости от гендерных особенностей.

Материалы и методы

В рамках регистра острого коронарного синдрома (ОКС) с подъемом сегмента ST, проведенного на базе Кемеровского кардиологического диспансера в период с 1 января 2008 года по 31 декабря 2008 года, поступавших в стационар с диагнозом ИМ с подъемом сегмента ST. Дизайн регистра ОКС был подробно описан ранее [1]. Критериями включения пациентов в регистр служили наличие на первичной записи электрокардиограммы (ЭКГ) элевации сегмента ST более 1,0 мм в двух смежных отведениях либо «новой» полной блокады левой ножки пучка Гиса (ЛНПГ); давность от момента заболевания не более 48 часов. Пациенты, подходящие для внесения в регистр, идентифицировались проспективно, что позволяло включать всех последовательно поступивших в клинику пациентов. Критериями

исключения явились ОКС, возникшие как осложнение чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ) или операции коронарного шунтирования. Также исключались пациенты с клинически значимой сопутствующей патологией: хронической или острой почечной, печеночной недостаточностью, хронической обструктивной болезнью легких, бактериальной или вирусной инфекцией, аутоиммунными заболеваниями, заболевания щитовидной железы, надпочечников. Все пациенты, включенные в исследование, подписывали одобренную локальным этическим комитетом учреждения форму информированного согласия. В настоящее исследование включено 153 пациента; из них 118 (70,4%) - мужчины и 35 (29,6%) - женщины. Концентрацию сывороточного неоптерина оценивали на 10-14-е дни ИМ (твердофазным методом иммунно-ферментного анализа), с использованием реактивов фирмы IBL (Gamburg, Германия). Выбор сроков оценки биомаркеров определили исходя из того, что первые пять суток от развития ИМ являются периодом массивного острого воспалительного ответа с избыточной выработкой всех острофазовых факторов. К десятым суткам от развития ИМ остаются лишь «следовые потенциалы» воспаления. Таким образом, параметры, определяемые в эти сроки, могут косвенно отражать уровень

хронического воспалительного процесса, ответственного, возможно, за последующие неблагоприятные сердечно-сосудистые события.

При оценке признаков недостаточности кровообращения в острой стадии ИМ применяли классификацию Killip. При оценке уровня воспалительного ответа у мужчин и женщин каждая группа была рассмотрена в целом и в последующем разделена в зависимости от возраста (до 66 лет и 66 лет и старше). Также в исследовании оценивался комбинированный неблагоприятный прогноз (ККТ), к которому были отнесены возникшие в течение 12 месяцев от индексного события случаи повторного ИМ, острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК), повторные госпитализации в связи с нестабильной стенокардией (НС) или прогрессированием хронической сердечной недостаточности (ХСН), смерть.

Статистическую обработку полученных данных выполняли в системе статистического анализа Statistica (пакет прикладных программ Statistica фирмы StatSoft Inc.,США, v. 6,0). Две независимые группы сравнивались с помощью U-критерия Манна-Уитни. Анализ различия частот в двух независимых группах проводился при помощи точного критерия Фишера, критерия Хи-квадрат с поправкой Йетса. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена. Для всех проведенных анализов различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05. Количественные признаки представлены в виде медианы с межквартильным интервалом.

Результаты и обсуждение

Средний возраст женщин в настоящем исследовании составил 61,3±7,5 года; мужчин - 57,3±8,8 года (р=0,0017). Все женщины находились в

постменопаузальном периоде. У женщин в анамнезе достоверно чаще (96,1%) встречалась артериальная гипертензия (АГ). Среди мужчин пациентов с АГ было 82,5% (р=0,0148). У женщин также чаще диагностировали сахарный диабет (СД): он был выявлен у 42,3% - женщин и только у 15,3% - мужчин, р=0,0001. В настоящем исследовании не было выявлено различий в тяжести течения ИМ у женщин и мужчин. В обеих группах с одинаковой частотой

регистрировался передний ИМ (в 34,6% случаев у женщин и у 40,5% - мужчин, р=0,4517); выполнялась реперфузионная терапия (в 82,6% случаев у женщин и в 74,8% - у мужчин, р=0,2489). Обе группы не различались по степени выраженности острой сердечной недостаточности. Так, средний балл по Killip у женщин составил 1,26, у мужчин - 1,19, р=0,6075. Средний балл по шкале TIMI составил у женщин 2,92, у мужчин - 2,79, р=0,7730. Однако женщины и мужчины достоверно различались по уровню фракции выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ), данный показатель составил 52,8% у женщин и 48,6% - у мужчин (р=0,007).

Установлено, что достоверно чаще неблагоприятные сосудистые события возникали у женщин, чем у мужчин. Так, ККТ у женщин составила 45%, в то время как у мужчин - 28,1% (р=0,0014). Однако достоверных различий по частоте развития каждой отдельной «конечной точки» у женщин и мужчин не было.

Достоверных различий уровня неоптерина, оцененного на 10-14-е сутки ИМ, у женщин и мужчин выявлено не было. Так, концентрация неоптерина у женщин составила 13,4 (7,0; 13,9) nmol/l, у мужчин - 11,9 (6,8; 12,0) nmol/1, р=0,8813. Однако, и у женщин, и у мужчин в старшей возрастной группе (66 и более лет) концентрация данного биологического маркера оказалась выше, чем у более молодых пациентов (рис. 1). Так, у пожилых женщин концентрация неоптерина оказалась более, чем в 2 раза выше, чем у молодых (р=0,0127). У мужчин эти различия были также достоверны, однако менее выражены (концентрация у мужчин в возрасте 66 лет и старше была на 26% выше, чем у мужчин до 66 лет, р=0,0070). Подобные результаты получили в своей работе и другие исследователи. Так, К. К. Ray c соавт. [14] у пациентов с ОКС выявили связь концентрации неоптерина с возрастом, наличием сахарного диабета и артериальной гипертензией, однако гендерных различий выявлено не было.

Разделив пациентов в зависимости от ККТ, выяснили, что у мужчин с неблагоприятным прогнозом уровень неоптерина, оцененный в конце госпитального периода, был достоверно выше - 17,4 (9,5; 20,9) nmol/l, по

сравнению с пациентами с благоприятным прогнозом - 10,8 (6,5; 10,9) пшо1/1 (р=0,0001). Подобных различий в группе обследованных женщин выявлено не было.

При распределении пациентов по возрастным группам установлено, что концентрация неоптерина у мужчин была достоверно выше при неблагоприятном прогнозе по сравнению с благоприятным прогнозом как в возрасте до 66 лет, так и в возрасте 66 лет и старше. Наиболее высокая концентрация изучаемого биомаркера была характерна для мужчин старшей возрастной группы с неблагоприятным годовым прогнозом (р=0,0286) (табл. 1). У женщин достоверных различий концентрации неоптерина, в зависимости от прогноза, выявлено не было как в возрасте до 66 лет, так и в возрасте 66 лет и старше. Однако в группе женщин с неблагоприятным прогнозом уровень неоптерина был достоверно выше в старшей возрастной группе по сравнению с более молодыми женщинами, р=0,0191 (табл. 2).

Проведя сравнительный анализ взаимосвязи между концентрацией неоптерина и баллом по шкале ТІМІ, которая считается общепринятой для определения тяжести клинического течения ИМ, выявили положительную корреляционную связь между параметрами у мужчин (г=0,29; р=0,0006). Подобная взаимосвязь была выявлена у мужчин между уровнем неоптерина и степенью выраженности острой сердечной недостаточности при ИМ по шкале Кі11ір (г=0,22; р=0,0112). Кроме того, была выявлена обратная корреляционная связь уровня неоптерина с показателем ФВ (г=-0,25; р=0,0030). У женщин подобных взаимосвязей выявлено не было. Р. Ауа^аБ с соавт. в своем исследовании также выявили отрицательную корреляционную связь между ФВ левого желудочка и концентрацией неоптерина, однако анализ гендерных различий в указанном исследовании не проводился [5]. Таким образом, имеется тенденция к повышению концентрации неоптерина в плазме крови у мужчин с ИМ и дисфункцией ЛЖ.

Учитывая неоднородность исследуемых групп по значению ФВ (52,8% у женщин и 48,6% у мужчин, р=0,0070) и выявленную значимую обратную

корреляционную связь между ФВ и концентрацией неоптерина, в дальнейшем были исключены из анализа пациенты с ФВ<35%. Характеристика группы женщин не изменилась. Из группы мужчин было исключено 13 пациентов. При этом число мужчин в группе составило 105 человек. При анализе вновь образованных групп достоверных различий средних величин ФВ у женщин и мужчин выявлено не было: данный показатель составил 52,8% у женщин и 50,7% - у мужчин (р=0,0831). При распределении пациентов в зависимости от прогноза у мужчин сохранился достоверно более высокий уровень неоптерина в группе неблагоприятного прогноза, по сравнению с мужчинами с благоприятным прогнозом: 16,5 (9,5; 17,8) nmol/l и 9,5 (6,5; 10,2) nmol/l, соответственно (р=0,0014). Наиболее высокое значение неоптерина также было выявлено у мужчин с неблагоприятным прогнозом в возрасте 66 лет и старше (табл. 1).

Повышенное содержание неоптерина в биологических жидкостях тесно ассоциировано с клеточной иммунной реакцией. При самых разных заболеваниях клеточная иммунная система вовлечена в патологический процесс, и концентрация неоптерина отражает прогрессирование заболевания. Острый коронарный синдром является классическим примером асептической воспалительной реакции, развивающейся вслед за развитием некроза. Согласно воспалительной теории атеросклероза, провоспалительные цитокины (IL-6, TNF-а и IL-18), способны усиливать как процессы локального воспаления в атеросклеротической бляшке, так и индуцировать системные эффекты, проявляющиеся в активации макрофагов в бляшках, расположенных в других участках коронарного русла или в других сосудистых областях [9, 12]. Данный факт может объяснить вероятность развития после перенесенного эпизода атеротромбоза острой сосудистой катастрофы как в коронарных, так и в других сосудистых бассейнах. Участие неоптерина в данном процессе подтверждается и другими исследователями. Так, D. Fuchs с соавторами показали, что повышенный уровень неоптерина является предиктором кардио-васкулярных событий у пациентов с ИБС [7]. F. Tatzber с соавт. доказывают, что

концентрация неоптерина тесно связана с прогрессированием атеросклероза в целом [15]. По данным ряда авторов, повышенный уровень неоптерина является маркером нестабильности атеросклеротической бляшки [4, 6]. Р. Avanzas с соавт. в своем исследовании показали, что высокая концентрация неоптерина является независимым предиктором смертности у пациентов даже с незначительными стенозами коронарных артерий [4,6,13]. Т. Adachi с соавт. предположили, что неоптерин сам является стимулом для развития воспаления и формирования нестабильности атеросклеротической бляшки [3].

Доказано, что при патологических состояниях человека, связанных с активацией клеточного иммунитета, концентрация неоптерина в крови может увеличиваться на 2-3 порядка. Клетками, ответственными за его избыточную продукцию, являются активированные моноциты/макрофаги. Продукция 7,8-дигидронеоптерина и неоптерина сопряжена с «оксидативным взрывом» моноцитов/макрофагов. В связи с этим необходимость в синтезе данных соединений может быть связана, с одной стороны, с самозащитой моноцитов/макрофагов от повреждающего действия активных форм кислорода (ROS). Так, 7,8-дигидронеоптерин, вступая в реакцию с активными радикалами, предотвращает их окислительное действие в отношении липидов, а главное, белков клеточной мембраны моноцитов/макрофагов. При этом 7,8-дигидронеоптерин окисляется до неоптерина. Неоптерин, ингибируя активность макрофагальных ферментов, генерирующих ROS, влияет на степень «оксидативного взрыва». С другой стороны, за счет прооксидантного эффекта, усиливаемого в присутствии ионов переходных металлов, неоптерин и 7,8-дигидронеоптерин способны потенцировать защитные эффекты, связанные с «оксидативным взрывом». В частности, прооксидантное действие данных птеринов играет роль в индукции экспрессии ряда генов, вовлеченных в реакции клеточного иммунитета - цитокинов, молекул адгезии и др. [9].

В настоящем исследовании показано, что концентрация в крови неоптерина достоверно более высока у мужчин с развитием неблагоприятных сосудистых событий. Данный факт, однако, противоречит данным литературы о более

выраженной воспалительной реакции у женщин и нашим собственным данным о менее благоприятном прогнозе у женщин в постинфарктном периоде. Таким образом, можно предположить, что пол является значимым фактором, определяющим воспалительную реакцию и прогноз у пациентов с ИМ.

Следовательно, полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что активность воспалительных процессов может быть одним из механизмов развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у пациентов после перенесенного инфаркта миокарда. Однако, по всей видимости, у женщин и у мужчин данный процесс осуществляется с участием различных механизмов.

GENDER DIFFERENCES IN NEOPTERIN LEVEL IN PATIENTS WITH MYOCARDIAL INFARCTION AND ST- SEGMENT ELEVATION

E.V. Tavlueva

RAMS Institution State Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular

Diseases

Abstract. Differences of neopterin rate on 10-14 days after MI were not revealed among male and female. Neopterin concentration is higher both in men and women in the age older then 66 years, then in patients before 66 years old. Neopterin rate was significantly higher in the end of hospital period in male with unfavorable prognosis (р=0,0001).The highest rate of studied biomarker was in male from the old age group with unfavorable annual prognosis compare to male before 66 years old ^=0,0286).Same differences were not revealed in female sample group.

Key words: myocardial infarction, gender differences, neopterin.

Литература

1. Барбараш Л. С., Кашталап В.В., Зыков М.В. и др. Распространенность и клиническая значимость мультифокального

атеросклероза у пациентов с инфарктом миокарда и подъемом сегмента ST // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2010. - № 5. - Р. 3136.

2. Манак Н.А., Барбук О. А. Взаимосвязь показателей дислипидемии и воспалительных маркеров атеросклероза у женщин со стабильной стенокардией // Клинич. медицина. - 2010. - №2. - С. 14-17.

3. Adachi T., Naruko T., Itoh A. et al. Neopterin is associated with plaque inflammation and destabilisation in human coronary atherosclerotic lesions // Heart. - 2007. - Vol. 93. - P. 1537-1541.

4. Avanzas P, Arroyo-Espliguero R., Cosin-Sales J. et al. Prognostic value of neopterin levels in treated patients with hypertension and chest pain but without obstructive coronary artery disease // Am. J. Cardiol. - 2004. - Vol. 93.

- P. 627-629.

5. Avanzas P, Arroyo-Espliguero R., Quiles J. et al. Elevated serum neopterin predicts future adverse cardiac events in patients with chronic stable angina pectoris // Eur Heart J. - 2005. - Vol. 26. - P. 457-463.

6. Avanzas P, Arroyo-Espliguero R., Kaski J. C. Neopterin and Cardiovascular Disease: Growing Evidence for a Role in Patient Risk Stratification // Clinical Chemistry. - 2009. - Vol. 55, №6. - P. 1056-1057.

7. Fuchs D., Avanzas P, Arroyo-Espliguero R. et al. The role of neopterin in atherogenesis and cardiovascular risk assessment // Curr. Med. Chem. - 2009.

- Vol.16. - P.4644-53.

8. Grammer T.B., Fuchs D, Boehm B.O. et al. Neopterin as a predictor of total and cardiovascular mortality in individuals undergoing angiography in the Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health Study // Clin. Chem. - 2009. -Vol. 55. - P. 1135-1146.

9. Garcia-Moll X., Coccolo F., Cole D. et al. Serum Neopterin and Complex Stenosis Morphology in Patients With Unstable Angina // J. Am. Coll. Cardiol.- 2000. - Vol. 35, № 4. - Р 1097-1099.

10. Kaski J.C., Avanzas P, Arroyo-Espliguero R. Neopterin: a forgotten

biomarker // J Am Coll Cardiol. - 2003. - Vol.42. - P. 1140-1146.

11. Mazzone A., De Servi S., Vezzoli M. et al. Plasma levels of interleukin -

2, -6, -10 and phenotypic characterization of circulating T-lymphocytes in ischemic heart disease // Atherosclerosis. - 1999. - Vol. 145. - P. 369-374.

12. Moreau M., Brocheriou I., Petit L. Interleukin-8 mediates down-regulation of tissue inhibitor of metalloproteinase -1 expression in cholesterol-loaded human macrophages: relevance to stability of atherosclerosis plaque

// Circulation. - 1999. - Vol. 99. - P. 420-426.

13. Oliveira G.H. Novel serologic markers of cardiovascular risk // Current Atherosclerosis Reports. - 2005. - Vol. 7. - P. 88-95.

14. Ray K.K., Morrow D.A., Sabatine M.S. et al. Long-term prognostic value of neopterin: a novel marker of monocyte activation in patients with acute coronary syndrome // Circulation. - 2007. - Vol. 115. - P. 3071-3078.

15. Tatzber F., Rabl H., Koriska K. et al. Elevated serum neopterin levels in atherosclerosis // Atherosclerosis. - 1991. - Vol.89. - P203-208.

© КУНЦ Т. А., ЕФРЕМОВ А. В., ВАКУЛИН Г. М., ОВСЯНКО Е. В.,

ПУСТОВЕТОВА М. Г.

УДК 616.36-006.68-091.8-092.9

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС НА ПОЗДНИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256

Т. А. Кунц, А. В. Ефремов, Г. М. Вакулин, Е. В. Овсянко, М. Г. Пустоветова Новосибирский государственный медицинский университет, ректор -И.О. Маринкин; Центральная научно-исследовательская лаборатория, рук.

- д.м.н., проф. М. Г. Пустоветова.

Резюме. Проведено изучение клеток печени крыс Wistar на 7-е и 14-е сутки после имплантации клеток карциносаркомы Walker 256 в мышцу бедра. Выявлена корреляция субклеточных проявлений неспецифической эндогенной паранеопластической интоксикации с изменениями морфометрических данных паренхимы и стромы печени. Показано, что тромботическая микроангиопатия, гемолиз деформированных и секвестрированных эритроцитов и адгезия к ним и эндотелию сосудов тромбоцитов являются причинами тканевой гипоксии. Дистрофия, некроз и апоптоз клеток паренхимы и стромы на 7-е сутки опыта сопровождались субклеточными признаками функционального напряжения в части гепатоцитов, повышением детоксикационных и приспособительных клеточных реакций, снижающихся к 14-м суткам.

Ключевые слова: печень, морфометрия, ультраструктура, карциносаркома Walker 256.

Кунц Татьяна Анатольевна — научный сотрудник, Центральная научно-

Ефремов Анатолий Васильевич — д.м.н., проф., зав. каф. патологической физиологии и клинической патофизиологии НГМУ; тел. 8(383) 2253978.

Вакулин Геннадий Михайлович — к.м.н., старший научный сотрудник, Центральная научно-исследовательская лаборатория, НГМУ; тел. 8(383)

2263560.

Печень является центральным органом метаболизма и детоксикации, во многом определяющим гомеостаз организма, который при прогрессии злокачественных опухолей утрачивает гомеостатические функции в связи с наработкой клетками опухолей и, в частности, карциносаркомой Walker 256 (W256) неопластических медиаторов и протеолитических агентов [10, 14]. Повышение при этом генной экспрессии медиаторов цитокинов -трансформирующего фактора роста в, интерлейкина-12, гамма-интерферона различается в выявленных двух типах клеток карциносаркомы: прогрессивного и регрессивного роста [13], которые, как показано ультраструктурно и стереологически, имеют различный дифференцировочный потенциал и разные темпы деградации [5], то есть склонность к некрозам и опухолевому распаду. Последний лежит в основе синдрома неспецифической эндогенной интоксикации (НЭИ) продуктами тканевого распада, повреждающими мембраны нормальных клеток при активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и повышении уровня свободных радикалов, приводящего также к гемолизу эритроцитов и анемии [1]. Системное, специфическое, дистантное действие опухоли на организм проявляется паранеопластическими синдромами, обусловленными дисбалансом обменных процессов, иммунным конфликтом «опухоль-организм», эктопическим образованием опухолью псевдогормонов,

влиянием на регуляторные системы организма, обеспечивающие гомеостаз [1, 4]. Целью настоящего исследования было изучение морфометрических и субклеточных параметров изменений клеток паренхимы и стромы печени при избранных сроках развития карциносаркомы W256.

Материалы и методы В эксперименте использовали крыс-самцов Wistar массой 180-200 г. Работу проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы W256 вводили крысам в мышцу бедра в дозе 106 клеток [7]. Животные разделены на 2 группы: интактные (n=7) и со спонтанным развитием опухоли (n=14), которых выводили их эксперимента на 7-е и 14-е сутки с момента трансплантации клеток. Для гистологического исследования образцы печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин. На санном микротоме готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Морфометрический анализ проводили с помощью окулярной сетки, состоящей из 25 тестовых точек и 5 линий. На препаратах, полученных от каждой группы, исследовали по 100 полей зрения. Методом точечного счета при увеличении *1000 определяли долю площади, занимаемой цитоплазмой и ядрами гепатоцитов, синусоидами и клетками синусоидов (общий пул клеток, включающий эндотелиоциты, клетки Купфера, Ито). Подсчитывали численные плотности клеток паренхимы и стромы, ядерноцитоплазматическое отношение гепатоцитов, долю среди них диплокариоцитов, отношение общего числа клеток синусоидов к общему числу гепатоцитов, а также индекс васкуляризации, представляющий собой отношение площади синусоидов к площади паренхимы [12]. Статистическая обработка результатов заключалась в подсчете средних величин (M) и их стандартных ошибок (m).

Оценка характера распределения, проведенная по тесту на нормальность Колмогорова-Смирнова с поправкой Лильефорса, показала, что полученные выборки (100 измерений каждого параметра от группы) подчинялись нормальному распределению. Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента при 95 % уровне значимости [2].

Для электронно-микроскопических исследований образцы печени фиксировали в 4% параформальдегиде (Serv.) на 0,1 М фосфатном буфере Миллонига ^H 7,4) при комнатной температуре в течение 2 ч с дополнительной дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере на льду в течение 1 ч. После дегидратации образцы заключали в эпоновую смесь и полимеризовали. Полученные на ультратоме LKB-8800 срезы (35-45 нм) контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца, напыляли слоем углерода и изучали в электронных микроскопах JEM-7А и JEM-100S.

Результаты и обсуждение

На 7-е сутки развития карциносаркомы W256 в печени выявлены признаки нарушения кровотока с проявлением сладж-синдрома и тромбоза междольковых артерий и центральных вен. Агрегация эритроцитов и гранулоцитов в просветах синусоидов способствует закупорке части капилляров, застойному расширению синусоидов (рис. 1, б), гипоксии. В перипортальных зонах наблюдаются лимфоидные инфильтраты, в паренхиме -лимфоидные узелки, эозинофилы и тучные клетки, что косвенно может указывать на активацию иммунологических реакций [6]. В печени обнаружены метастазы в виде одиночных опухолевых клеток и их скоплений. Часть гепатоцитов дистрофически изменена, в другой части, в зонах фокальных некрозов, ядра клеток паренхимы пикнотичны, с проявлениями кариолизиса и кариорексиса.

Рис. 1. Морфометрические показатели печени крыс с карциносаркомой Ж256 (М±т);

а — паренхиматозный компартмент; б — синусоидный компартмент.

* #

Примечание: достоверные различия: с контролем, с предыдущим сроком,

р<0,05.

Рис. 1. Морфометрические показатели печени крыс с карциносаркомой W256 (М±т); а — паренхиматозный компартмент, б — синусоидный компартмент Достоверные различия: *с контролем, # с предыдущим сроком, р<0,05

Повышение индекса васкуляризации (0,33±0,02 при 0,17±0,01 в контроле, p<0,05) на фоне расширения центральных и поддольковых вен указывает на нарушение оттока крови. Расширение лимфатических пространств Малла отражает затруднение оттока внеклеточной жидкости. Увеличение ядерноцитоплазматического отношения (0,33±0,02 при 0,22±0,01 в контроле, p<0,05) при снижении относительной площади цитоплазмы гепатоцитов (рис. 1, а), то есть уменьшение среднего размера гепатоцита - свидетельства ослабления в целом функций клеток паренхимы, нередко связанной с развитием апоптоза [3]. Действительно, в части гепатоцитов, наряду с типичной для апоптоза конденсацией хроматина ядер и уплотнения цитоплазмы (рис. 2, б), выявляются черты «ультраконденсации» митохондрий: уплотнение матрикса, маскирующее кристы (рис. 2, а, б). Показано, что апоптозный цикл начинается с устранения межклеточных контактов с расширениями пространств между клетками (рис. 2, а), вычленения и отторжения клеток из клеточных пластов, последующей их компактизацией без деструкции ультраструктур с завершающей клеточной фрагментацией и распадом во внеклеточных пространствах [3]. Достоверное возрастание численной плотности двуядерных гепатоцитов (табл. 1),

прирастающих, как известно, за счет ацитокинетических митозов и являющихся родоначальниками полиплоидных клеток, может быть компенсацией недостаточности функций клеток паренхимы. Поэтому, видимо, достоверно повышается численная плотность гепатоцитов (табл. 1), процент площади которых уменьшается в соответствии со снижением их функций (рис.1, а).

Таблица 1

Численные плотности (N) клеток паренхимы и стромы печени крыс с

карциносаркомой W256.

Численная плотность, N Контроль 7 суток 14 суток

Г епатоциты, N 21,64±0,28 24,87±0,28 21,56±0,23#

Диплокариоциты, N 1,24±0,10 2,01±0,11 1,74±0,13

Синусоидные клетки, N 8,46±0,31 9,40±0,24* 9,77±0,26*

Диплокариоциты/Г епатоциты 0,06±0,00 Ч* 0,08±0,00 Ч* 0,08±0,01

Синусоидные клетки/Г епатоциты 0,40±0,02 0,38±0,01 0,46±0,01* #

Примечание: достоверные различия при p<0,05: - с контролем, - с

предыдущим сроком.

В гепатоцитах, подверженных апоптозу, выявляется увеличенное количество неизмененной гранулярной цитоплазматической сети, нередко скомпанованной в крупные пакеты, прилежащие к ядрам, что указывает на их предшествующую функциональную активацию (рис. 2, б). Предшественниками таких клеток, очевидно, были изредка видимые гепатоциты с яркими признаками активации функций - крупными полями компонентов белок-синтезирующей системы у ядер с деспирализованным то есть активным краевым хроматином (рис. 2, в). Не вызывает сомнений, что такая популяция гепатоцитов компенсаторно восполняет функции паренхимы в условиях, когда другая часть ее подвергается некрозу, дистрофии изменениям и апоптозу в условиях действия НЭИ на 7-е сутки опыта. Кроме явных субклеточных нарушений в гепатоцитах пренекротических и некротических зон нередко обнаруживаются мало измененные гепатоциты с проявлением жировой дистрофии - мелкокапельной липидной инфильтрации цитоплазмы, видимой иногда и в апоптозных клетках (рис. 2, а, б), причиной которой, как известно, является нарушение функции экзоцитоза в-липопротеидов.

На 7-е сутки развития опухоли в печени отмечаются признаки активации фагоцитоза в увеличенных в размерах клетках Купфера с большим числом лизосом и гетерофагосом (рис. 2, г), содержащих клеточный детрит, что находится в соответствии с некротическим и апоптозным устранением части клеток паренхимы под воздействием НЭИ. Определяется по субклеточным признакам и убыль клеток синусоидов. Так, в синусоидах печени обнаружены апоптозные клетки эндотелия, вычленяющиеся из состава стенок синусоидов (рис. 2, д) с типичными чертами изменений хроматина ядер, митохондрий и уплотненной цитоплазмы. Наблюдаются и деструктивно измененные эндотелиоциты с разрывами плазмалемм, что связано с воздействием опухолевых цитокинов, особенно фактора некроза опухоли, который вызывает деструкцию цитоскелета эндотелия и плазмалемм, подавляя пролиферацию

клеток [1]. Возможно, из-за восполнения утраты клеток эндотелия повышается число митозов в неповрежденной их части, что увеличивает число клеток синусоидов (табл. 1).

Рис. 2. Ультраструктура клеток печени крыс через 7 суток развития карциносаркомы W256; а-фрагмент апоптозных гепатоцитов с плотным матриксом митохондрий, пакетами гранулярной сети, утратой межклеточных контактов на мембранах расширенных межклеточных пространств; б — часть апоптозного гепатоцита с уплотнением цитоплазмы, конденсацией хроматина ядра и крупным скоплением гранулярной сети у ядра; в — фрагмент функционально активного гепатоцита с гиперплазией белок-синтезирующей системы и деспирализацией хроматина ядра; г — фрагмент активированной клетки Купфера с большим количеством гетерофагосом и лизосом; д — фрагмент апоптозного эндотелиоцита, десвамированного из стенки синусоида; е — трансдифференцированная клетка Ито в состоянии активного синтеза внеклеточного матрикса. УвеличениеХ10000 (а, б, д), Х10500 (в), Х14000 (г), Х8750 (е).

а

б

в

г

д

е

Последние могут прирастать и за счет печеночных макрофагов, устраняющих клеточный детрит, а также клеток Ито, которые, сравнительно с контролем, чаще видны на 7-е сутки опыта, демонстрируя признаки трансдифференциации в миофибробласты (рис. 2, е): утрату липидных капель с витамином А, увеличение поверхности ядер и числа каналов белок-синтезирующей системы со значительным накоплением в них тропоколлагена, появление вплотную к клеткам скоплений коллагеновых фибрилл. Трансдифференциация клеток Ито является ключевым событием фиброгенеза в печени [9], отражающим их активацию в условиях повреждения клеток печени и крови, высвобождающего из них трансформирующий в-фактор роста и фактор роста из тромбоцитов, стимулирующие митозы клеток Ито и последующую продукцию ими внеклеточного матрикса [11]. Так как клетки, продуцирующие коллаген, чаще всего встречаются вокруг зон некротизации гепатоцитов, мы полагаем, что здесь имеет место принцип соединительнотканного замещения утраченного объема паренхимы.

На 14-е сутки развития опухоли в печени еще больше нарушается

архитектоника долек печени из-за увеличения зон некроза и дистрофии.

Отмечено выраженное расширение сосудов триад, застой в междольковых

артериях и лимфатических пространствах Малла. Выявленный тромбоз

центральных вен сочетается с десквамацией эндотелия, что тормозит кровоток.

Застой в синусоидах (индекс васкуляризации: 0,28±0,02 при 0,17±0,01 в

контроле, p<0,05) отражает повышение относительной площади капиллярной

сети (рис. 1, б) и субклеточные данные о том, что более часто, чем через 7 суток

опыта, видны в расширенных синусоидах скопления гемолизированных и

секвестрированных эритроцитов с тромбоцитами (рис. 3, а), подверженные

адгезии к эндотелию, что увеличивает площадь синусоидов из-за застойного

полнокровия. Рис. 3 Ультраструктура клеток печени крыс через 14 суток развития карциносаркомы W256 а-застойный синусоид с гемолизированными, секвестрированными эритроцитами и адгезией тромбоцитов к эндотелию; б-фрагмент гепатоцита с гиперплазией гладкой сети и митохондрий при активации функции детоксикации; в-часть гипертрофированного гепатоцита с развитой гранулярной сетью, энергезированными митохондриями и укрупненным ядрышком в состоянии повышенной функции; г-фрагмент апоптозного гепатоцита с уплотненной цитоплазмой, конденсацией хроматина, микросегрегацией ядрышка; пространство Диссе заполнено коллагеном; д-фрагмент гепатоцита с центриолями (стрелки) и с признаками дисфункции гранулярной сети, митохондрий, хроматина ядра и ядрышка - показателями несостоявшейся адаптивной клеточной реакции; е-апоптозно измененный эндотелиоцит синусоида с обилием клеточного детрита. х10000 (а, г, е), х12600 (б, в, д).

На 14-е сутки развития опухоли в печени снижается число двуядерных клеток как следствие их деления для возмещения некротизации части гепатоцитов, а также увеличивается связанное с этим число клеток стромы (табл. 1). Процент площади стромы и паренхимы несколько возрастает

сравнительно с 7 сутками опыта (рис. 1). Интересно, что спустя 14 суток значительно реже наблюдаются гепатоциты с признаками апоптоза, на что указывает увеличение процента площади их цитоплазмы и снижение процента площади ядер (рис. 1, а) и снижение ядерно-цитоплазматического отношения (0,28±0,02) по сравнению с 7 сутками (р<0,05).

Помимо описанных выше гепатоцитов, спустя 14 суток опыта в печени нередко выявляются клетки с гиперплазией гладкой цитоплазматической сети (рис. 3, б), которых на 7-е сутки опыта мало. Обилие гладких мембран и свободных рибосом наблюдается, начиная от ядер до плазмалемм клеток. Нуклеолонемность ядрышек богатых гранулами, деспирализация гетерохроматина ядер отражает интенсивный ДНК-зависимый синтез РНК. Известно, что такая структура гепатоцитов типична для печени в состоянии активации функции дезинтоксикации и, видимо, связана с повышением паранеопластической токсической нагрузки на орган: действия

протеолитической гиперферментемии, цитокинов и среднемолекулярных пептидов [1]. Для части гепатоцитов на 14-е сутки опыта характерна гиперплазия гранулярной цитоплазматической сети, прилежащей к ядрам с крупными ядрышками, совместно с энергизированными митохондриями (рис. 3, в). Эта часть, очевидно, представляет собой популяцию гипертрофированных клеток, несущих повышенную функциональную нагрузку. Выявляются гепатоциты и с мелкокапельной липидной дистрофией, уплотненной цитоплазмой, конденсацией хроматина и микросегрегацией ядрышек (рис. 3, г), то есть чертами апоптоза. Наряду с этим, в зонах фокальных некрозов видны

гепатоциты (рис. 3, д), с субклеточными признаками дезинтеграции

цитоплазматической сети и митохондрий с расширенными кристами и плотным матриксом, появлением деструктивных зон просветлений хроматина ядер, ядрышками, еще имеющими черты нуклеолонемности, но уже почти утратившими гранулярную часть. Наличие в таких клетках центриолей (рис. 3, д) указывает на несостоявшийся митоз в условиях действия опухолевых цитотоксических факторов, препятствующих реализации компенсаторноприспособительных клеточных реакций в части гепатоцитов.

Рис. З. Ультраструктура клеток печени крыс через 14 суток развития карциносаркомы W256; а — застойный синусоид с гемолизированными, секвестрированными эритроцитами и адгезией тромбоцитов к эндотелию; б — фрагмент гепатоцита с гиперплазией гладкой сети и митохондрий при активации функции детоксикации; в —часть гипертрофированного гепатоцита с развитой гранулярной сетью, энергезированными митохондриями и укрупненным ядрышком в состоянии повышенной функции; г — фрагмент апоптозного гепатоцита с уплотненной цитоплазмой, конденсацией хроматина, микросегрегацией ядрышка; пространство Диссе заполнено коллагеном; д — фрагмент гепатоцита с центриолями (стрелки) и с признаками дисфункции гранулярной сети, митохондрий, хроматина ядра и ядрышка — показателями несостоявшейся адаптивной клеточной реакции; е — апоптозно измененный эндотелиоцит синусоида с обилием клеточного детрита. Увеличение х10000 (а, г, е), х12600 (б, в, д).

а

б

в

г

д

е

Вероятно, в силу этих же причин усиливаются апоптозные изменения клеток эндотелия синусоидов, в которых часто наблюдается клеточный детрит (рис. 3, е) - свидетельство большей повреждаемости клеток печени. По-прежнему, как и на 7-е суток опыта, в клетках Купфера выражена активация фагоцитоза, а клетки Ито имеют признаки трансдифференциации и интенсивного синтеза тропоколлагена, в результате чего большинство пространств Диссе переполнено фибриллами коллагена (рис. 3, г).

Таким образом, дистрофические, некротические и апоптозные изменения клеток паренхимы и стромы печени, по-видимому, являются следствием воздействия повреждающих факторов эндогенной интоксикации в результате системного действия опухоли на организм, которое способствует прогрессии в печени терминальной тромботической ангиопатии, вызывает комплекс клеточных и субклеточных компенсаторно-приспособительных реакций, противостоящих онкофакторам. Такие реакции снижаются к 14-м суткам развития опухоли в силу развития дезинтеграции и гибели гепатоцитов, уже ставших на путь адаптивного восполнения функций утраченных клеток.

В настоящее время при онкопатологии изыскиваются возможности нейтрализации действия опухолевых цитокинов [8], что, с учетом полученных нами данных, вселяет надежду на успех в поиске путей коррекции возникающих в печени при развитии злокачественной опухоли структурнометаболических нарушений применением мембранопротекторов, повышением детоксикационных потенций органа и стимуляции в нем внутриклеточных гиперпластических процессов, противостоящих паранеопластическим повреждающим и протеолитическим эффектам и токсическому воздействию молекул средней массы.

Morphometries and ultra structural indexes of rat’s liver cells in late stages of Walker- 256 carcinocarcinoma Т.А. Kunts, GM. Vakulin, E.V. Ovsyanko, A.V. Efremov, М^. Pustovetova

Abstract. We studied rat’s Wistar liver cells on 7 and 14 days after Walker-256 carcinocarcinoma implantation into hip muscle. Correlation of subcellular nonspecific endogenous paraneoplastic intoxication with morphometrics data of liver’s parenchyma and stroma were revealed. We showed that thrombotic microangiopathy, hemolysis of deformed and sequestrated erythrocytes and platelets adhesion to them and to endothelium cause tissue hypoxia. Parenchymal and stromal cell’s dystrophy, necrosis and apoptosis on 7 day of the experiment were accompanied by subcellular signs of functional stress in some hepatocytes, increased detoxication and adaptive cell reactions, which decreased to 14 day.

Key words: liver, morphometry, ultra structure, Walker-256 carcinocarcinoma

Литература

1. Ганцев Ш. Х. Онкология. - М., 2004. - 516 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1999. - 459 с.

3. Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю. Гибель клетки (апоптоз). - М., 2001. -160 с.

4. Онкология / Национальное руководство. - M., 2008. - 1072 c.

5. Овсянко Е.В., Ефремов А. В., Мичурина С.В. и др. Ультраструктурный и стереологический анализ клеток карциносаркомы WALKER 256 на разных стадиях их дифференцировки // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2009.

- Т. 148, № 9. - С. 337-342.

6. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. - М., 2000. - 592 с.

7. Хегай И.П., Попова Н.А., Иванова Л.Н. Влияние экспрессии гена вазопрессина на рост карциносаркомы Walker 256 у крыс // Генетика. - 2000. -

8. Elaraj D.M., Weinreich D.M., Varghese S. et al. The role of interleukin 1 in growth and metastasis of human cancer xenografts // Clin. Cancer Res. - 2006. - Vol. 12, № 4. - P. 1088-1096.

9. Gressner A.M. Transdifferentiation of hepatic stellate (Ito) cells to myofibroblasts: a key event in hepatic fibrogenesis // Kidney Int. - 1996. - Vol. 49, № 1. - P. 39-45.

10.Keller H., Eggli P. Protrusive activity, cytoplasmic compartmentalization, and restriction rings in locomoting blebbing Walker carcinosarcoma cells are related to detachment of cortical actin from the plasma membrane // Cell Motil. Cytoskeleton. -1998. - Vol. 41, № 2. - P. 181-193.

11.Okuno M., Adachi S., Akita K. et al. Liver fibrosis and hepatic stellate cells // Connect Tissue. - 2000. - Vol. 32. №4. - P. 401-406.

12. Onori P., Morini S., Franchitto A. et al. Hepatic microvascular features in experimental cirrhosis: a structural and morphometrical study in CCl4-treated rats // J. Hepatol. - 2000. - Vol. 33, № 4. - P. 555-563.

13. Perroud A. P. A. S., Ashimine R., Castro G. M. et al. Cytokine gene expression in Walker 256: A comparison of variants A (aggressive) and AR (regressive) // Cytokine. - 2006. - Vol. 36, № 3-4. - P. 123-133.

14. Rebeca R., Bracht L., Noleto G. R. et al. Production of cachexia mediators by Walker 256 cells from ascitic tumors // Cell Biochem. Funct. - 2008. - Vol. 26, № 6.

- P. 731-738.

© СИДОРЕНКО Ю.С., ШИХЛЯРОВА А. И., ФРАНЦИЯНЦ Е.М., НЕПОМНЯЩАЯ Е.М., КОМАРОВА Е.Ф., БАРСУКОВА Л.П., МАРЬЯНОВСКАЯ Г.Я., Т.П. ПРОТАСОВА

УДК: 001.5:616-07:616.84:612.014.426

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО

ВЛИЯНИЯ ПОЛИМОДАЛЬНЫХ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Ю.С. Сидоренко, А.И. Шихлярова, Е.М. Франциянц, Е.М. Непомнящая, Е.Ф.

Комарова, Л.П. Барсукова, Г.Я. Марьяновская, Т.П. Протасова

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, директор - д. м. н., проф. О.И. Кит.

Резюме. В экспериментах на 7S белых крысах с эктопическим ростом в легких саркомы 45 установлено противоопухолевое действие сверхнизкочастотного магнитного поля с частотами импульсов, близких к ритмам головного мозга, и СКЭНАР-терапии. Характер регрессии опухолевых узлов и компенсаторных процессов в ткани легкого отражает способность к сонастройке центральных и местных механизмов обеспечения структурного гомеостаза, проявлением которого служит активация клеточных элементов соединительной ткани (лимфоцитов, фибробластов, макрофагов, альвеолоцитов II типа и др.), эластических и ретикулярных волокон.

Ключевые слова: эктопический рост саркомы 45, морфология легких, магнито- и СКЭНАР-терапия, противоопухолевый эффект.

Сидоренко Юрий Сергеевич - академик РАН и РАМН, зам. директора по науке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический

институт Минздравсоцразвития России»; e-mail: rnioi@list.ru.

Шихлярова Алла Ивановна - д.б.н., проф., рук. лаборатории биофизики рака ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России»; e-mail: rnioi@list.ru.

Франциянц Елена Михайловна - д.б.н., проф., руководитель гормональной лаборатории ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздравсоцразвития России»; е-mail: rnioi@list.ru.

Интерес к изучению сочетанного центрального и периферического влияния на мозг при опухолях внемозговой локализации, с одной стороны, связан с тем, что процессы опухолевой трансформации в значительной степени обусловлены потерей контроля со стороны нервной системы и следующей за этим утратой тканевой регуляции. С другой стороны, опираясь на кортико-висцеральную теорию патологии, не исключается возможность интегративной регуляции роста неоплазмы при контролируемых воздействиях на уровне мозга и тканевых эффекторных систем [1,6].

Известна высокая чувствительность мозга к сверхнизкочастотному магнитному полю малой интенсивности (СНЧМП) [4], а также возможные механизмы его противоопухолевого, антиканцерогенного и антистрессорного влияния [8, 10, 11, 12,]. Использование полимодальной технологии создает условия для повышения эффективности центральной (на мозг) магнитотерапии СНЧМП путем сочетания с периферическим (в проекции органа-мишени) СКЭНАР -воздействием электроимпульсов. В механизме реализации последнего принимают участие регионарные, сегментарные и генерализованные реакции, которые связаны с изменениями афферентов соматосенсорной системы, факторов локальной сосудистой регуляции и эндогенных регуляторов иммунитета [3, 5, 12].

Целью исследования явилась оценка возможности восстановления тканевой

2

регуляции на основе анализа результатов экспериментально-гистологических исследований органа-мишени, подверженного опухолевой трансформации, при центральном и периферическом воздействиях полимодальных факторов.

Материалы и методы

В настоящем исследовании были использованы 78 белых беспородных крыс-самцов (180-200 г) разводки вивария ФГУ «РНИОИ Росмедтехнологий». Штамм саркомы 45 был получен в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Клетки опухоли вводили в подключичную вену крыс в объеме 0,5 мл, содержащем 2 млн. опухолевых клеток и стерильный физиологический раствор.

Через 1 неделю после эктопической перевивки в лёгкое клеток саркомы 45 и на протяжении 5 недель проводили воздействие физическими факторами -СНЧМП и СКЭНАР без специального противоопухолевого химио- или лучевого лечения. Воздействие СНЧМП осуществляли на голову животного-опухоленосителя в период с 9 до 10 часов утра с последовательностью частот

0,03 Гц - 0,3 Гц - 9 Гц, временем предъявления сигнала - 5 мин. - 1 мин. - 1 мин. и интенсивностью 5 мТл - 3,5 мТл - 2,8 мТл соответственно. Каждое из значений интенсивности на протяжении курса уменьшали по экспоненте с коэффициентом 0,7, доходя до уровня значений 0,8 мТл - 0,5 мТл - 0,3 мТл. Через 15-20 мин. после СНЧМП следовало СКЭНАР-воздействие, заключающееся в обработке кожных покровов импульсным электрическим током вдоль позвоночника с амплитудой 135 у.е., а на области проекций легких, печени и грудины - от 30 до 60 у.е. (в зависимости от чувствительности) и модуляцией 2:1 при ежедневном изменении частоты в алгоритме 15,3 Гц - 18,6 Гц - 24,4 Гц - 30,5 Гц - 33,6 Гц.

Для верификации опухолевого процесса на этапах эктопического роста С - 45 животных декапитировали, предварительно усыпив парами хлороформа, извлекали легкие, подсчитывали количество опухолевых узлов и определяли их размер. Для гистологического исследования брали верхнюю и нижнюю доли правого и левого легкого, кусочки ткани фиксировали в растворе 10%

3

нейтрального формалина с последующей стандартной проводкой через спирты восходящей концентрации и заключали в парафин. Приготовленные из парафиновых блоков гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопию осуществляли в проходящем свете при увеличении Ч5, Ч10, Ч40, Ч100 (Ьеюа БЫ ЬБ2). Для статистической обработки результатов экспериментов использовали параметрические методы в пакете прикладных программ 81айвйеа у. 6.1. Достоверными считали различия между основной и контрольной группами при уровне значимости р<0,05 и р<0,01, вычисленного по 1-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

К одному из наиболее значимых результатов лечебного влияния СНЧМП и СКЭНАР-терапии мы отнесли показатели продолжительности жизни животных-опухоленосителей. При анализе сроков жизни у крыс контрольной группы (без воздействия) и опытной группы «с эффектом» и «без эффекта» было установлено, что период времени от момента «выхода» опухолевых узлов в ткани легкого вплоть до момента гибели существенно различался (табл. 1).

Таблица 1

Основные параметры роста и развития опухолей в легких крыс после применения ______________________электромагнитного воздействия_____________________________

Показатели Г руппы животных

Контрольная (без воздействия) (n=22) Опытная (с воздействием)

«без эффекта» (n=10) «с эффектом» (п=46)

Продолжительность жизни, дни (недели) 38,5±3,5 (5-6 недель) 108,5±3,51 (15-16 недель) более 3151,2 (45 недель)

Срок «выхода» опухолевых узлов после введения С-45, недели 3-4 5-6 5-6 или отсутствуют

Количество опухолевых узлов в сроки «выхода», штук 5-7 до 6 4-5 или отсутствуют

4

Размеры опухолевых узлов в 3 0,5±0,05 0,4±0,05 0,2±0,051,2 или

сроки «выхода», см отсутствуют

Примечание. 1 - статистически достоверно по отношению к показателям группы без воздействия (р<0,05); 2 - достоверно по отношению к группе «без эффекта» от примененного воздействия (р<0,05).

Так, у животных с эффективным воздействием продолжительность жизни была увеличена в 7 раз относительно контроля. Увеличение сроков жизни с 5 до 15 недель было отмечено и у крыс-опухоленосителей без выраженного противоопухолевого эффекта, что на фоне стабилизации роста опухоли свидетельствовало об общем биорегуляторном влиянии используемых факторов. Достоверные межгрупповые различия были получены и по показателям размеров опухолевых узлов в срок «выхода». В опытной группе крыс «с эффектом» лечения объем опухолевых узлов был в 2,5 раза меньше, чем в контроле, причем у 48% крыс, поддавшихся лечебному влиянию СНЧМП и СКЭНАР, опухолевые узлы не были обнаружены, а в 28% - отмечено наличие единичных мелких узлов, что можно отнести к эффекту торможения роста опухоли. Таким образом, суммарный противоопухолевый эффект составил 76%, что, в отличие от 100% роста опухоли в контроле, позволяло отнести применяемые воздействия к факторам с высокой противоопухолевой эффективностью.

Гистологический контроль легких через одну неделю от момента перевивки

опухоли до начала воздействий СНЧМП и СКЭНАР-терапии показал, что

первичные изменения в ткани верхней и нижней долей левого и правого легкого

идентичны в обеих группах животных. К одному из первых пусковых

механизмов патологического влияния опухолевых клеток на ткань легкого

можно было отнести редукцию кровотока и обильные крупноочаговые

кровоизлияния. Фактически, вся ткань легкого была пропитана кровью,

межальвеолярные пространства были заполнены массой эритроцитов, а также

скоплением лимфоцитов (рис. 1а). В результате такой «атаки» возникали

крупные очаги дистелектаза, межуточная пневмония, участки микроабсцессов в

5

просвете альвеол.

«Разрушительный» этап в легких крыс продолжался и на 2-й неделе после перевивки в обеих группах, несмотря на начало СНЧМП и СКЭНАР-воздействий. На препаратах легкого в нижней и верхней долях наблюдалась деградация бронхиоло-альвеолярных структур , главным образом, из-за выхода из просвета сосудов агрегаций опухолевых клеток и их прорастанием в виде тонких удлиненных тяжей (рис. 1б). По мере опухолевого роста границы между отдельными тяжами сливались и образовывались крупные конгломераты опухолевых клеток с изогнутой краевой линией, отделяющей их от пропитанной кровью ткани легкого (рис. 1в). Формирование опухолевых узлов характеризовалось сдавлением и разрушением легочных структур, плотной упаковкой опухолевых клеток, сохраняющих типичную для С-45 веретеновидную форму и высокий пролиферативный потенциал, что подтверждалось обилием фигур патологического митоза (рис. 1 г).

При продолжении лечебных сеансов магнито- и СКЭНАР-терапии обнаружились деструктивные изменения в опухолевых узлах легких. Начиная с 3-й недели от момента перевивки С-45, обращала на себя внимание мобилизация клеточного звена иммунной системы и формирование плотного кольца зрелых лимфоцитов по периферии опухолевого узла (рис. 2а). Вместе с гистиоцитами, макрофагами, фибробластами лимфоидные клетки проникали в промежутки между отдельными сформированными группами опухолевых клеток, что способствовало дезинтеграции и ослаблению целостности опухолевого узла [2]. Иными словами, одними из первых проявлений влияния управляющих воздействий на злокачественную опухоль внутриорганной локализации явилось нарушение ее территориальной целостности и формирование микропопуляций опухолевых клеток в виде объединений типа синцитиев (рис. 2 б).

На препаратах опухоли легкого были отмечены значительные участки единичных или мелких групп опухолевых клеток, разграниченных клетками

6

соединительной ткани с преобладанием лимфоцитов и фибробластов (рис. 2в). Наблюдались инволютивные изменения со стороны ядерного аппарата опухолевых клеток - явления кариорексиса, кариолизиса. На отдельных участках скопления голых гиперхромированных ядер отмечалось распыление ядерного хроматина - «ядерный взрыв», характеризующий распад геномной основы клеток опухоли (рис. 2г). Клетки принимали вид теней, сохраняя расплывчатые очертания расплавленной цитоплазмы (рис. 2д). На 5-6 неделях в ткани легкого у крыс с выраженным противоопухолевым эффектом были обнаружены аморфные гомогенно окрашенные поля, образованные лизированным материалом опухоли, а также разрастание молодой соединительной ткани.

Сопоставляя ход опухолевой прогрессии после внутривенной перевивки саркомы 45 в легкое крыс с последовательностью этапов регрессии опухоли при эффективных воздействиях СНЧМП и СКЭНАР-терапии можно отметить диаметрально противоположную направленность связанных между собой процессов: в первом случае - от клеток, к популяции и опухоли, а во втором -от опухоли, к популяции и клеткам. Эта отличительная особенность прямого и обратного развития опухоли, отражает реализацию механизмов межсистемной интеграции в организме-опухоленосителе, где в роли пускового управляющего воздействия выступают факторы электромагнитной природы.

Под влиянием изменчивости среды (ткань легкого) в условиях внешних регуляторных воздействий (СНЧМП и СКЭНАР-терапии) в популяции опухолевых клеток возрастала гетерогенность. Отдельные группы опухолевых клеток проявляли признаки утраты злокачественности, начиная с трансформации доминирующей веретеновидной формы в округлую, отмечалось выстраивание клеток в однослойные структуры линейного или фолликулоподобного типа (рис. 3а-б), усиление процессов клеточной

регенерации. Во многих полях зрения обнаруживались значительные участки, заполненные фибробластами (рис. 3в). Известно, что эти клетки способны

7

вырабатывать эластин, образующий эластические волокна, которые располагаются в межальвеолярных стенках и обеспечивают основную опорную функцию. Кроме того, были обнаружены скопления альвеолоцитов II типа (пневмоциты II порядка), представляющие собой активно секретирующую и пролиферирующую эпителиальную поверхностную клетку, вырабатывающую фосфолипиды, главным компонентом которых является

дипальмитоилфосфатидилхолин. Известна роль этого секреторного продукта в образовании сурфактанта, обеспечивающего уменьшение межмолекулярных сил тканевой жидкости в альвеолах, снижению поверхностного натяжения и раздувания альвеолярных мешочков для усиления воздухообмена (рис. 3д).

О формировании защитно-компенсаторных процессов в легких крыс, пораженных опухолью при эффективных воздействиях СНЧМП и СКЭНАР-терапии свидетельствовало состояние и таких соединительнотканных элементов, как макрофаги, тучные клетки, эластические, коллагеновые и ретикулярные волокна. На препаратах встречались эластические структуры околодольковой, междольковой, межсосудистой, перивазальной и перибронхиальной локализации. Волокна имели слоистое расположение и характеризовались выраженной резервной извилистостью (рис. 4а). Увеличение содержания ретикулярных волокон свидетельствовало о повышении активности обменных процессов в легких. Глубокие качественные преобразования легочной соединительноткан стромы выражались в приобретении волокнами пучкового характера за счет латеральной агрегации при бронхиолярных структурах (рис. 4б). По ходу волокон наблюдались перехваты и колбообразные выпячивания - ложные бронхи, окруженные скоплением

бронхоассоциированных лимфоидных элементов (БАЛТ-система), что являлось структурной основой внесосудистых иммунных реакций в легких (рис. 4в). Особого внимания заслуживало сохранение реснитчатого эпителия в бронхах легкого крысы с характерным подслоем гладких мышечных волокон, слоем базальных клеток и цилиндрического эпителия (рис. 4г). Функционирование

8

слизистой оболочки бронхиол во многом обеспечивало условия сохранения респирации в условиях онкопатологии.

Учитывая дистрофический и дегенеративный характер преобразований ткани опухоли и восстановительную направленность гистологических изменений в ткани лёгкого, по-видимому, можно считать оправданным подход к сочетанному (центральному и локальному) полимодальному воздействию факторов электромагнитной природы, который реализует принцип двойного управления функциями [7]. Способность к сонастройке центральных и местных механизмов обеспечения структурного гомеостаза продемонстрирована активацией клеточного микроокружения опухоли эктопически растущей в ткани лёгкого. Механизмы восприятия, передачи и кумуляции электромагнитного сигнала во многом не ясны. По-видимому, от мембран рецепторов сигнал может трансформироваться и распространяться через системы молекулярных посредников - аденилатциклазу, ЦАМФ, кальциевый и др. механизмы. Необходимо подчеркнуть, что по данным К.В. Судакова [10], П.В. Симонова [9], Е. НеёЬош [13], на уровне информационной системы мозга, которую, в первую очередь, представляют неокортекс и гиппокамп, происходит перекодировка, трансформация сигнала и передача информации молекулам соединительной ткани, гормонам, олигопептидам, простагландинам, гликопротеинам, иммунным комплексам, механизмы работы которых полифункциональны. Мы обращаемся к естественным аутоколебательным процессам, органически присущим организму и его подсистемам. Роль СНЧМП и СКЭНАР является лишь триггерной, пусковой и запускаемые механизмы самоорганизации могут быть рассмотрены как альтернатива дезинтеграционному влиянию опухоли. Возможность коррекции и синхронизации биологических процессов создаёт условия повышения противоопухолевой резистентности и оказывает «колебательную» помощь организму во взаимоотношениях с опухолью. Этому способствует технология сочетания центрального (СНЧМП)- и периферического (СКЭНАР)-воздействия,

9

позволяющая реализовать повышение защитного потенциала организма также и в условиях специфической противоопухолевой терапии.

HISTOLOGICAL CRITERIA OF ANTI TUMOR INFLUENCE OF POLYMODAL PHYSICAL FACTORS IN THE EXPERIMENT

Yu.S.Sidorenko, A.I.Shikhlyarova, E.M.Frantziyantz, E.M.Nepomnyashaya, E.F.Komarova, L.PBarsukova, G.Ya.Maryanovskaya, T.P.Protasova Federal State Institution «Rostov Cancer Research Institute»

Abstract. Anti tumor effect of ultra low intensity magnetic field with intensity close to brain rhythms and to SCENAR-therapy was found out in the experiment on 75 white rats with ectopic growth of carcinoma 45 in lungs. Regression pattern of tumor nodules and compensatory process in the tissue reflect ability of central and local mechanisms of structural homeostasis to co-settings by activating cellular elements of connective tissue (lymphocytes, fibroblasts, macrophages, type II alveolocytes etc.), elastic and reticular fibers.

Key words: ectopic growth of carcinoma 45, lung’s morphology, magnetic and SCENAR-therapy

Литература

1. Балабан П.М., Гуляева Н.В. Общность молекулярных механизмов нейропластичности и нейропатологии: интегративный подход // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова - 2006. - Т. 92, № 2. - С. 145-151.

2. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т. С. и др. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Реакция активации как путь к здоровью через процессы самоорганизации. - Екатеринбург: Филантроп, 2002. - 196 с.

3. Гринберг Я.З. СКЭНАР-терапия: эффективность с позиций методов электролечения / СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза // Сб. статей. -Таганрог, 1996. - Вып. 2. - С. 18-32.

4.Музалевская Н.И., Урицкий В.М. Противоопухолевое действие слабого

10

сверхнизкочастотного стохастического магнитного поля со спектром 1//

// Биофизика - 1997. - Т. 42, № 4. - С. 961-970.

5. Ревенко А.Н. Адаптационно-адаптивная регуляция (СКЭНАР): теоретическое и практическое обоснование / СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза // Сб. статей. - Таганрог, 1998. - Вып. 1. - С. 16-27.

6. Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам гомеостаза. - М.: Медицина, 1977. - С. 125-152.

7. Саркисов Д.С. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций. - М.: Медицина, 1987. - 275 с.

8. Сидоренко Ю. С. Некоторые медико - биологические аспекты биотерапии рака. - Ростов н/Д: ЗАО «Ростиздат», 2008. - 544 с.

9. Симонов П.В. Информационный мозг. - М., 1993. - 350 с.

10. Судаков К.В. Информационный принцип в физиологии: анализ с позиций общей теории функциональных систем // Успехи физиол. наук. - 1995. - Т.26, №4. - С. 3-24.

11. Франциянц Е.М., Шихлярова А. И., Кучерова Т. И. Роль антиоксидантных систем мозга в механизме антиканцерогенного влияния сверхнизкочастотных магнитных полей // Вопр. онкологии. - 2002. - Т. 48, №2. - С.216-222.

12. Шихлярова А.И., Максимов Г.К., Барсукова Л.П. и др. Регуляторное влияние сверхнизкочастотных магнитных полей на энергетический метаболизм мозга и печени крыс-опухоленосителей (на модели саркомы 45 и химического канцерогенеза) // Вестн. ЮНЦ. - 2006. - Т. 2, № 2. - С. 96-103.

13. Hedbom E. Characterization of a family of proteoglycans with the capacity to bind collagens: Doct. diss. - Lond. Univ. - 1993. - 380 р.

11