CC BY
34
© Коллектив авторов, 2010 УДК 616.981.49:517.958.57:577
ЛЕЧЕБНЫЙ ЭФФЕКТ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ НАНОКОНТЕЙНЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Г.М. Кремнева, В.И. Ефременко, Л.В. Романова, И.Л. Литвиненко,
А.А. Ефременко, Н.Н. Килинкарова, Т.В. Николенко Ставропольская государственная медицинская академия
Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями в нашей стране общепризнаны. Вместе с тем, остаются проблемы в инфекционной патологии, имеющие серьезное социально-экономическое значение для всех стран. К их числу, наряду с вирусными заболеваниями, относятся острые кишечные инфекционные болезни. Среди них особое место занимает сальмонеллез [12,16].
Исследование патогенеза этого заболевания выявило, что ведущая роль в нарушении гомеостаза организма принадлежит сальмонеллезному эндотоксину [4, 2].
Эндотоксин (ЭД) угнетает деятельность центральной нервной системы, может вызвать миокардит, мио-кардиодистрофию и инфекционно-токсический шок. Бактериемия приводит к инфицированию различных органов (желчного пузыря, почек, печени, костного мозга, твердых мозговых оболочек и др.) и к вторичной инвазии эпителия кишечника (особенно пейеровых бляшек). Следствием вторичной инвазии бактерий в эпителий кишечника могут быть кровотечения и перфорации, возникающие при повреждение пейеровых бляшек [5,9,18].
Для коррекции гомеостаза, нарушенного воздействием сальмонеллезного эндотоксина, используют лекарственные препараты, направленные на стабилизацию клеточных мембран органов и тканей, снижение интенсивности процессов перекисного окисления ли-
Кремнева Галина Михайловна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологической химии СтГМА, тел.: (8652) 32-95-07.
Ефременко Виталий Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии СтГМА, Заслуженный деятель науки РФ, тел.: 402-261.
Романова Людмила Викторовна, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры биологической химии СтГМА, тел.: 603-371; e-mail: alkilin @ Yandex.ru.
Литвиненко Ирина Леонидовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологической химии СтГМА, тел.: (8652) 94-56-97.
Ефременко Анна Александровна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры биологической химии СтГМА, тел.: (8652) 24-08-89.
Килинкарова Нина Николаевна, кандидат биологических наук, ассистент кафедры биологической химии СтГМА, тел.: (8652) 35-56-44.
Николенко Татьяна Владимировна, ассистент кафедры биологической химии СтГМА, тел.: 89187612756; tatyana-stv78 @ bk.ru.
пидов (ПОЛ), стимулирование метаболических процессов в почках, печени, сердце, кишечнике и других органах. Проводятся инфузионно-дезинтоксикационная терапия, восстановление водно-электролитного баланса и гемодинамики [8,15,20].
Эффективность использования лекарственных препаратов в ряде случаев оказывается невысокой из-за их токсичности, кратковременного пребывания в организме вследствие быстрой утилизации и выведения [3].
Эти недостатки можно устранить, используя ли-посомальные формы лекарственных препаратов, иммобилизованных во внутренний объем или мембрану липидных везикул.
В настоящее время появляются многочисленные сообщения о широком использовании липосом в качестве транспортеров биологически активных веществ и лекарственных препаратов [1,14,17]. Липосомы обладают возможностью in vivo направлять заключенные в них вещества в определенные органы и ткани организма, обеспечивая внутриклеточную доставку, что позволяет заметно снижать дозу препарата при сохранении эффективности биологического действия. При этом фармакокинетика липосомальных лекарственных препаратов существенно отличается от их интакт-ных форм. Токсичность препаратов резко снижается, а продолжительность их биологического действия возрастает [7].
Целью исследования было выяснение особенностей изменения обменных процессов в крови при сальмонеллезной интоксикации и разработка липосомальных лекарственных препаратов для коррекции нарушенного гомеостаза.
Материал и методы. Исследования осуществляли на базе ФГУЗ «Ставропольский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора». Эксперимент проводили на нелинейных белых мышах обоего пола, массой 18-20 г с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Мыши находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения и соблюдением стандартного пищевого рациона. У всех животных был свободный доступ к пище и воде.
Для моделирования экспериментальной сальмо-неллезной интоксикации 480 животным вводили вну-трибрюшинно однократно сальмонеллезный эндотоксин в дозе 0,2 мкг (0,25 ЛД50), выделенный по методу Буавена из Salmonella typhimurium - штамм 9640.
Из числа экспериментальных животных формировали следующие группы: контрольная (20 животных), данной группе животных сальмонеллезный ЭД
не вводили; группа животных (120 мышей), которым вводили внутрибрюшинно однократно сальмонел-лезный ЭД; группа животных (120 мышей), которым проводили коррекцию гомеостаза, нарушенного воздействием сальмонеллезного ЭД, растворами лекарственных средств, введенными внутрибрюшинно; группа животных (120 мышей), которым проводили лечение липосомальными лекарственными средствами, введенными внутрибрюшинно; группа экспериментальных животных (120 белых мышей), которым вводили липосомальные лекарственные препараты перорально.
Эксперимент проводили в течение 30 дней. Животных декапитировали на 3,10,20, 30 сутки с целью получения цельной крови, сыворотки крови без признаков гемолиза для исследования показателей, отражающих изменение (ПОЛ): содержание малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови по методу В.Б. Гаврилова (1987), уровень каталазы по методу С.И. Крайнева, О. Д. Кушманова с соавт. (1974), величина суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови по методу А.А. Покровского (1977).
Для повышения эффективности биологического действия лекарственных средств были получены их липосомальные формы.
Формирование липосом осуществляли из комплекса фосфолипидов и холестерина, выделенных из головного мозга свиньи, путем экстракции смесью хлороформа и этанола в соотношении 2:1 и последующего осаждения при добавлении к экстракту 1,5-2 объёмов охлажденного ацетона.
Жирорастворимый препарат а-токоферол добавляли в момент приготовления липосом методом «выпаривания и обращения фаз» в мембрану, а водорастворимые препараты: рибоксин, эссенциале, селенит натрия, аскорбиновую кислоту - иммобилизовали во внутренний объем липосом при шестикратном «замораживании - оттаивании» липидных везикул, процент включения составлял 72,22,1%.
Учитывая пролонгированное действие липосо-мальных лекарственных препаратов, их вводили экспериментальным животным внутрибрюшинно и перорально 6 раз с интервалом 2 суток, начиная со второго дня после инъекции сальмонеллезного эндотоксина, в тех же разовых и курсовых дозах, что и интактные лекарственные средства.
Статистическая обработка результатов проводилась с определением средней арифметической ошибки. Обработку данных проводили методом вариационной статистики на компьютере 1ВМ. Достоверность различий между группами определяли с помощью ^критерия Стьюдента. Статистически достоверными
считали отличия, соответствующие величине ошибки достоверности р<0,05.
Результаты и обсуждение. Известно, что при сальмонеллезной интоксикации происходит активация ПОЛ. Считают, что причиной интенсификации ПОЛ являются активированные фагоциты, продуцирующие активные формы кислорода [10,11]. У больных сальмонеллезом наблюдается низкая активность катала-зы, активно разрушающая возрастающие при данной патологии концентрации перекиси водорода.
На третьи сутки после введения сальмонеллезно-го ЭД в сыворотке крови животных отмечалось повышение МДА до 4,7±0,41 мкмоль/мл (норма 3,6±0,41 мкмоль/мл). На 30 сутки содержание МДА уменьшилось до 4,0±0,32 мкмоль/мл, что выше контрольных величин на 11,1%.
СПА после введения сальмонеллезного ЭД на 3 сутки достоверно превышала фоновые значения и составила 0,625±0,054 ед.опт.пл./мл (норма 0,125±0,134 ед.опт.пл./мл) (р<0,05). К концу эксперимента (на 30 сутки) СПА ещё более увеличилась, будучи выше контроля на 780% (р<0,05).
В ответ на введение сальмонеллезного ЭД на 3 сутки в крови наблюдалось статистически достоверное понижение активности каталазы до 12,5±0,91 ммоль/мл/мин. (норма 24,0±1,23 ммоль/мл/мин.) (р<0,05). На 30 сутки активность каталазы снизился до 9,25±0,89 ммоль/мл/ мин. (р<0,05), что ниже фонового значения на 61,5%.
Для коррекции гомеостаза, нарушенного воздействием сальмонеллезного эндотоксина, использовали растворы лекарственных средств (разовые дозы в пересчете на одно животное): рибоксин (2,5 мг), эссенциале (2,5 мг), селенит натрия (0,000017 мкг), а-токоферол (0,5 мкг), аскорбиновая кислота (2,0 мг). Растворы вводили внутрибрюшинно 120 белым мышам, массой 18-20 г на 2, 3, 4, 5, 6, 7 сутки в объеме
0,5 мл. Дозы рассчитывали в соответствии с фармакопейными данными на массу животного. Суточные дозы лекарственных препаратов на одно животное массой 20 г уменьшены в 3500 раз по сравнению с суточными дозами для взрослого человека весом в 70 кг [13].
Исследование показателей, отражающих степень ПОЛ мембран, показало, что у экспериментальных животных, которым вводили растворы лекарственных средств внутрибрюшинно, содержание МДА на 3 сутки увеличилось на 47,2% (р<0,05), на 30 сутки - на 5,6% выше нормы (р<0,05). СПА на 3 сутки достоверно повысилась на 380% (р<0,05), к концу эксперимента (на 30 сутки) оказалась выше нормы на 644% (р<0,05). Активность каталазы на 3 сутки исследования уменьшилась на 60,5% (р<0,05), на 30 сутки активность каталазы оставалась ниже нормы на 61,5% (р<0,05) (табл.1).
Таблица 1
Интенсивность перекисного окисления липидов мембран при лечении растворами лекарственных средств,
вводимыми внутрибрюшинно
Наименование показателей Фоновое значение Сроки наблюдения, сутки
показателей п = 20 3 п = 30 10 п = 30 20 п = 30 30 п = 30
МДА (ммоль/мл) 3,6±0,41 5,3±0,54* 5,1±0,64* 4,6±0,31* 3,8±0,28*
СПА (ед.опт. пл./мл) 0,125±0,034 0,600±0,072* 1,375±0,094* 1,025±0,064* 0,930±0,028*
Каталаза (ммоль/ мл/мин.) 24,0±1,23 9,5±0,87* 7,25±0,86* 6,75±0,34* 9,25±0,92*
Примечание к табл. 1-3. п - число животных в группе; * - р<0,05 по сравнению с фоновыми значениями; ** - р<0,05 в сравнении показателей при внутрибрюшинном введении растворов лекарственных средств и липосомальных лекарственных форм; *** -р<0,05 в сравнении показателей при внутрибрюшинном и пероральном введении липосомальных лекарственных форм.
У животных, которым лечение проводили липосо-мальными лекарственными препаратами, вводимыми внутрибрюшинно, содержание МДА на 3 сутки повысилось на 55,6% (р<0,05), на 30 сутки достигло нормы (3,6±0,41 мкмоль/л). СПА на 3 сутки достоверно увеличилась и оказалась выше нормы на 600% (р<0,05), к концу эксперимента показатель СПА оставался повышенным на 400% (р<0,05). Активность каталазы на 3 сутки достоверно понизилась на 54,2% (р<0,05), а к 30 суткам оказалась ниже нормы на 56,25% (р<0,05) (табл. 2).
В сыворотке крови животных, которым липосо-мальные лекарственные препараты вводили перорально, содержание МДА на 3 сутки увеличилось всего на 13,9% (р<0,05), а к концу эксперимента (на 30 сутки) стало ниже нормы на 5,6%. СПА на 3 сутки достоверно повысилась, оказавшись выше нормы на 760% (р<0,05), на 30 сутки СПА оставалась выше нормы на 149,6% (р<0,05). Каталазная активность на 3 сутки исследования уменьшилась на 63,5% (р<0,05), на 30 сутки активность каталазы незначительно увеличилась, но сохранялась ниже нормы на 57,3% (р<0,05) (табл.3).
У экспериментальных животных, которым проводили лечение липосомальными лекарственными препаратами, введенными внутрибрюшинно и перорально, содержание МДА на 20-30 сутки достигло контрольных величин (3,6±0,41 мкмоль/л). СПА понижалась в течение всего времени эксперимента. Эта тенденция была более значительной у животных, которым проводили лечение липосомальными препаратами перорально. Активность каталазы повышалась во всех группах животных, но была более выраженной у мышей, которым липосомальные лекарственные препараты вводили перорально.
Заключение. В ответ на введение сальмонел-лезного эндотоксина наблюдались выраженные изменения показателей ПОЛ: содержания МДА, СПА,
активности каталазы, которые не восстанавливались к концу эксперимента. Лечение растворами лекарств и липосомальными препаратами, вводимыми внутрибрюшинно и перорально, приводило к нормализации уровня МДА и способствовало тенденции к восстановлению СПА и активности каталазы. Наибольший лечебный эффект вызвали ли-посомальные лекарственные средства, введенные перорально.
Литература
1. Абрамов, К.С. Некоторые аспекты направленного транспорта лекарств в организм с помощью полимерных наночастиц/ К.С. Абрамов, И.Н. Скидан, А.Е. Гуляев // Клинич. исслед. лекарствен. средств в России. - 2001.-№ 2. -С. 18-21.
2. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология/ Л.Б. Борисов. - М., 2002. - 389 с.
3. Дудниченко, А.С. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и клинике / А.С. Дудниченко, Ю.М. Краснопольский.
B.И. Швец. - Харьков, 2002. - 246 с.
4. Еськов, А.П. Эндотоксикоз. Модель и лабораторная диагностика / А.П. Еськов, Р.И. Каюмов,
А.Е. Соколов // Токсикологич. вестн. - 2001. -№4. - С. 13-16.
5. Еськов, А.П. Механизм повреждающего действия бактериального эндотоксина / А.П. Еськов // Эфферент. терапия. - 2003. - №12. -
C. 71-74.
6. Ефременко, В.И. Методы приготовления липо-сом. Иммобилизация в липосомы различных веществ, стерилизация и лиофилизация липо-сом / В.И. Ефременко, Т.В. Таран, Л.М. Кузяко-ва. - Ставрополь, 1998. - 76 с.-Деп. в ВИНИТИ 11.12.98, №3636-В98.
Таблица 2
Интенсивность перекисного окисления липидов мембран при лечении липосомальными препаратами,
вводимыми внутрибрюшинно
Фоновое Сроки наблюдения, сутки
Наименование показателей значение показателей п = 20 3 10 20 30
п = 30 п = 30 п = 30 п = 30
МДА (ммоль/мл) 3,6±0,41 5,6±0,40 * 4,8±0,38 * 4,0±0,34 ** 3,6±0,27
СПА (ед.опт. пл./мл) 0,125±0,034 0,875±0,094 * ** 1,250±0,048 * 1,0±0,062 * 0,625±0,059 * **
Каталаза (ммоль/мл/мин.) 24,0±1,23 11,0±0,93 * 8,25±0,79 * 9,0±0,61 * 10,5±0,37 *
Таблица 3
Интенсивность перекисного окисления липидов мембран при лечении липосомальными препаратами,
вводимыми перорально
Фоновое Сроки наблюдения, сутки
Наименование значение
показателей показателей 3 10 20 30
п=20 п = 30 п = 30 п = 30 п = 30
МДА (ммоль/мл) 3,6±0,41 4,1±0,24 *** 3,8±2,4 *** 3,6±0,24 3,4±0,17
СПА (ед.опт. пл./мл) 0,125±0,034 1,075±1,09 * 1,125±0,097 * 0,930±0,017* 0,312±0,021* ***
Каталаза (ммоль/мл/мин.) 24,0±1,23 8,75±1,12 * 8,0±0,67 * 8,75±0,73 * 10,25±0,62*
7. Ефременко, В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине) / В.И. Ефременко. - Ставрополь, 1999. -263 с.
8. Лобзин, Ю.В. Клиника, диагностика и лечение актуальных кишечных инфекций / Ю.В. Лобзин,
В.М. Волжанин, С.М. Захаренко. - СПб., 1999. -184 с.
9. Лобзин, Ю.В. Руководство по инфекционным болезням / Ю.В. Лобзин. - СПб., 2003. - 136 с.
10. Мартыненко, Л.Д. Перекисное окисление липидов при экспериментальной сальмонеллезной инфекции / Л.Д. Мартыненко, А.П. Шевелев.
Э.Н. Симованьян // Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунол. - 1990. - №4. - С. 7-11.
11. Оконенко, Л.Б. Перекисное окисление липидов при сальмонеллезе / Л.Б. Оконенко // Лаб. дело. - 1987. - №1. - С. 55-58.
12. Покровский, В.И. Инфекционные болезни и эпидемиология / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико. - М., 2003. - 811 с.
13. Справочник Видаль (Vidal): лекарственные препараты в России. - М.,200б. - 1632 с.
14. Хворостов, И.Н. Экспериментальное фармако-
логическое и токсикологическое изучение ли-посомальных форм антибиотиков группы ами-ногликозидов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук / И.Н. Хворостов. - Волгоград, 2001. - 18 с.
15. Ющук, Н.Д. Инфекционные болезни/ Н.Д. Ющук, Ю.Я. Венгеров. - М., 2003. - 544 с.
16. (Ammond R., Rouland H., Welsby F.) Эммонд, Р Инфекционные Болезни / Р Эммонд, Х. Роуланд, Ф. Уэлсби. - Практика. М., 1998. - 439 с.
17. Betheder, D. Biovector in nanoparticles improve antinoceptive efficacy of nasal morphine /
D. Betheder, S. Sperandio, J-P Latapie // Pharm. Res. - 2000. - Vol.17, №6. - P. 743-748.
18. Field, M. Secretion of electrolytes and water by mammalian small intestine / M. Field // In: Physiology of the gastrointestinal tract. - 1981. - Vol. 36. -P.963-982.
19. Lotz, M.I. Role of splenic red pulp endotoxin - induced disseminated intravascular coagulation / M.I. Lotz, I. Farud, I.V. Balis / Lab. Invest. - 1981. -Vol. 45, № 5. - P. 469-477.
20. Maclin, L.T. Handbook of Vitamins: Nutritional, Biochemical and clinical aspects / L.T. Maclin. - New York, 1984. - 145 p.
ЛЕЧЕБНЫЙ ЭФФЕКТ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ НАНОКОНТЕЙНЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Г.М. КРЕМНЕВА, В.И. ЕФРЕМЕНКО, Л.В. РОМАНОВА, И.Л. ЛИТВИНЕНКО, A.A. ЕФРЕМЕНКО,
Н.Н. КИЛИНКАРОВА, Т.В. НИКОЛЕНКО
При сальмонеллезной интоксикации установлены изменения показателей перекисного окисления липидов в крови: увеличение малонового диальдегида (МДА), суммарной пероксидазной активности (СПА), уменьшение активности каталазы. Для коррекции выявленных нарушений использовали растворы лекарственных средств: рибоксин, эссенциале, селенит натрия, a-токоферол, аскорбиновую кислоту, вводимые белым мышам внутрибрюшинно, а также препараты, инкапсулированные в липосомы. Введение растворов лекарственных средств приводило к снижению содержания МДА, незначительному увеличению активности каталазы и дальнейшему снижению СПА. У экспериментальных животных, которым проводили лечение липосомальными лекарственными средствами вну-трибрюшинно и перорально, нормализация всех показателей происходила быстрее, особенно при перо-ральном введении.
Ключевые слова: сальмонеллезный эндотоксин, липосомальные лекарственные препараты, перекис-ное окисление липидов
THE THERAPEUTIC EFFECT OF LIPOSOME NANOCONTAINERS COMPOSED OF DRUGS IN THE CASE OF SALMONELLA INTOXICATION
KREMNEVA G.M., EFREMENKO V.I., ROMANOVA L.V., LITVINENKO I.L., EFREMENKO A.A., KILINKAROVA N.N., NIKOLENKO T.V.
Recent studies on the molecular pathogenesis of Salmonella intoxication have led to an improved understanding of toxin production role. The experimental animals were treated with: riboksin, Essenciale,
a-tocopherol, sodium selenite, ascorbic acid. The free drugs were injected intraperitoneally. Liposomes composed of these drugs were produced. Liposomal drugs were injected intraperitoneally. The result was that Salmonella intoxication of experimental animals increased the activity of lipid peroxidation. Malondialdehyde was increased beginning from the 3rd day of process. The total peroxidase activity increased. The activity of catalase decreased at the beginning of the experiment, but the tendency of its increasing took place. The treatment with free drugs decreased the level of malondialdehyde, total peroxidase activity and increased the catalase activity. Results showed that the treatment of experimental animals with liposomal drugs especially used per os demonstrated the more pronounced therapeutic effect than free drugs.
Key words: Salmonella endotoxin, liposomal drugs, lipid peroxidation
