CC BY
67
УДК619[-092:612.017.1]-076.5
Д.В. Меркурьев, Н.Б. Мерзлоеа, В.И. Батурин, Г.В. Борис, Н.И. Самойлова, А.В. Васильева
ЛАЗЕРНАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ДИАГНОСТИКЕ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА
Основной задачей клинической иммунологии на современном этапе является диагностика иммунопатологических состояний при различных заболеваниях, своевременное выявление лиц с иммунодефицита-ми, установление уровня иммунологического дефекта по параметрам иммунного статуса, подбор и оценка эффективности методов иммунотерапии, прогнозирование течения, тяжести и исхода иммунопатологических состояний [2,7]. В педиатрической практике исследование иммунологических показателей особенно важно для диагностики первичных форм иммунодефицитов, часто своевременно не диагностируемых. В работе врачей любого профиля изучение этих параметров необходимо для выявления вторичной иммунной недостаточности, которая развивается при разнообразной хронической патологии, аутоиммунных, онкологических заболеваниях, ВИЧ-инфекции, после хирургических вмешательств, тяжелых травм, стрессов, на фоне лекарственной терапии, при недостатке поступления с пищей белков, витаминов и микроэлементов 12,3,10].
Для оценки иммунного статуса используются тесты первого и второго уровней. К тестам первого уровня относятся определение содержания основных популяций лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов, уровня основных классов иммуноглобулинов в сыворот-
ке. При отсутствии изменений по данным тестам и наличии клинических признаков иммунологической недостаточности показана оценка иммунного статуса с использованием тестов второго уровня, которые включают оценку функционального состояния лимфоцитов, нейтрофилов, естественных киллеров, определение компонентов комплемента [2,3,7,9].
Раньше для количественного определения иммунокомпетентных клеток применялся тест розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) для выявления Т-лимфоцитов и мышей (М-РОК) для выявления В-лимфоцитов. Использовался также тест розеткообразования с эритроцитами, нагруженными иммуноглобулинами различных классов для индикации рецепторов к Рс-фрагментам иммуноглобулинов определенного класса. Нагрузочный тест Е-розеткообразования с теофиллином ставился для оценки субпопуляции лимфоцитов, обладающих хелперной (теофиллинре-зистентные Т-клетки) и супрессорной (тео-филлинчувствительные Т-клетки) активностью [2,3].
В настоящее время в диагностике иммунопатологических состояний кроме этого метода используются иммунофлюоресцен-ция с последующей темнопольной микроскопией, иммуноферментный анализ, поли-меразная цепная реакция, а также метод лазерной проточной цитометрии (ЛПЦ). По-
следний считается одним из самых чувствительных и специфичных методов, позволяет получать наиболее объективные данные путем анализа большого количества событий (за секунду может быть охарактеризовано до 30 тысяч клеток), что обеспечивается автоматической системой настройки прибора и контроля за качеством исследований [7,9]. Другими преимуществами ЛПЦ являются высокая точность и скорость анализа, простота постановки реакции, относительная безопасность всех реагентов для исследователя. Проведение на высоком методическом уровне оценки иммунного статуса больших контингентов лиц с помощью этого метода привело к развитию ноюго направления в клинической иммунологии - экологической иммунологии.
ЛПЦ позволяет типировать бластные и зрелые клетки крови и костного мозга миеломоноцитарного, лимфоцитарного и тромбоцитарного ряда, что важно для дифференциальной диагностики лимфо-пролиферативных заболеваний, проводить оценку содержания основных популяций лимфоцитов с применением моноклональ-ных антител, содержания внутри- и внеклеточных цитокинов и белков (комплемент, иммуноглобулины, специфические антитела, белки острой фазы и др.), а также сигнальных молекул и транскриптационных факторов с помощью парамагнитных частиц и моноклональных антител, определять цитотоксическую активность естественных киллеров, Т-киллеров и других клеток, обладающих киллердай активностью, алоптоз активированных лимфоцитов и фагоцитов, фагоцитоз путем оценки поглощения стафилококка, кишечной палочки, грибов рода Сап&йа, оценки бактерицидной и фунги-
цидной способности гранулоцитов по отношению к бактериям и грибам рода Candida, а также оценки продукции активных форм кислорода и азота гранулоцита-ми, мечеными флюоресцирующими красителями [5,7,9,12,13]. С помощью ЛПЦ можно анализировать процессинг и презентацию антигена, пролиферативный ответ лимфоцитов на Т- и В-митогены, наличие в цитоплазме CD4+ клеток цитокинов для идентификация Thl- иТЬ2-клеток [9,12]. Высокая стоимость прибора в конечном счете полностью окупается его производительностью и многогранностью применения.
В практическом здравоохранении для диагностики иммунопатологических состояний наиболее широко используется количественное определение субпопуляций лимфоцитов. Иммунофенотипирование лимфоцитов имеет высокую диагностическую и прогностическую значимость при первичных и приобретенных иммунодефи-цитах, аутоиммунных, лимфопролифера-тивных, инфекционных заболеваниях, при развитии посттрансплантационного иммунитета [7]. Каждой стадии дифференциров-ки иммунокомпетентных клеток соответствует свой набор антигенов, которые по международной классификации называются дифференцировочными и разделяются на кластеры дифференцировки, обозначаемые CD [6]. Диагностическую значимость имеет как определение процента клеток, несущих на своей поверхности искомый антиген, так и интенсивность свечения позитивных клеток, характеризующая выраженность экспрессии антигена на поверхности клеточной мембраны.
В основе ЛПЦ лежит взаимодействие моноклональных антител, меченых флюо-
ресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном лазерном цито-метре по специальным программам (СеллК-ВЕСТ, СИМУЛСЕТ и другие). Применение одного типа моноклональных антител, меченых флюорохромом (так называемая одинарная метка), не всегда дает объективную информацию о той или иной популяции лимфоцитов, поскольку каждая клетка несет на своей поверхности одновременно несколько типов антигенов. Более точное и информативное исследование субпопуляций достигается при использовании антител с двойной меткой, т.е. к образцу крови добавляют одновременно два типа антител, несущих на себе различные флюоресцентные красители (флюоресцеин-5-изотиоцио-нат, фикоэритрин и другие). Таким образом, можно дифференцировать лимфоциты, связавшие на своей поверхности только первый тип антител, только второй и оба типа [7,12,131
В большинстве лабораторий для диагностики иммунодефицитных состояний в периферической крови определяется процентное содержание следующих видов клеток CD19 (В-лимфоциты общие) или CD20 (В-лимфоциты зрелые), CD3 (Т-лимфоциты общие), CD4 (Т-лимфоциты-хелперы/ индукторы), CD8 (Т-лимфоциты-супрессоры / цитотоксические клетки), CD45RO (Т-клетки памяти), CD3/HLADR (активированные Т-лимфоциты), CD 16 или CD56 (натуральные киллеры). Важное значение придается иммунорегуляторному индексу (CD3/CD4).
Внедрение с 1983 года метода ЛПЦ дало мощный толчок развитию клинической иммунологии в России. В Пермской областной детской клинической больнице метод
ЛПЦ внедрен в 2003 году. Первоначально иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга применялось с целью диагностики и контроля за эффективностью терапии при онкологических заболеваниях. В настоящее время появилась возможность использования данного метода для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитных состояний у детей.
Вторичная иммунная недостаточность является составным компонентом патогенеза многих аутоиммунных заболеваний [2]. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) - классическое аутоиммунное заболевание, в основе которого лежит повышенное разрушение тромбоцитов под действием антитромбоцитарных аутоанти-тел при сохранении или раздражении мега-кариоцитарного ростка по данным миело-граммы [1,4,11]. При этом заболевании описаны различные дефекты иммунитета на уровне клеточной системы: снижение числа и функции Т-супрессоров, нарушение соотношения С04/СЭ8, присутствие Т-лимфоцитов с фенотипом С04+/СВ8* в циркуляции, увеличение числа активированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы II класса МНС - Н1А [1,4,7,14]. Рад авторов [6,7] ушывают на активацию В-клеточного звена при ИТП. В то же время однозначных представлений о состоянии 8-и ИК-клеточного звеньев иммунитета нет. Учитывая это обстоятельство, а также принимая во внимание неблагоприятную экологическую ситуацию в Пермском крае, несомненно оказывающую влияние на иммуно-регулеторные процессы в организме, целью нашего исследования мы поставили изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови детей, больных
ИТП, а также выявление различий по иммунологическим параметрам между острой и хронической формами заболевания.
Обследовано 14 детей с острой ИТП в фазе клинико-гематологического криза в возрасте от 5 месяцев до 12 лет (в среднем 4,9±1,2 года, медиана 4 года) со стажем заболевания от 2 недель до 3 месяцев (в среднем 3 недели), а также 15 детей, больных хронической ИТП, в возрасте от 4 до 15 лет (в среднем 10,6 ± 2,7 года, медиана 12 лет) со стажем заболевания от 8 месяцев до 8 лет (в среднем 3,6 г,) в период клинико-гематологического или только гематологического рецидива. На момент обследования у больных не отмечалось острых инфекционных процессов или обострения хронических заболеваний. Во всех случаях исследование осуществлялось на фоне отсутствия терапии глюкокортикоидами и иммуномо-дуляторами. Анализы проводились на проточном цитофлоуметре «FACStrab фирмы »Весton Dickinson» (США) методом прямой иммунофлюоресценции с двойным окрашиванием по программе *Cell Quest Pro» с использованием моноклональных антител (<-lQ Test* и «Immunotech», Нидерланды) к CD20, CD3, CD4, CD8, CD56, CD3/HLADR. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 клеток в гейте. Учитывались абсолютные показатели иммунологических параметров. Рассчитывался индекс CD4/CD8. Сравнение показателей CD3, CD4, CD8 и индекса CD4/CD8 осуществлялось с возрастными нормативами, разработанными для Уральского региона [3]. Остальные иммунологические параметры сравнивались с общепринятыми возрас-
тными нормативами [2] в связи с отсутствием региональных нормативов. Достоверность различий средних величин устанавливали с помощью критерия t Сгьюдента.
Более чем у половины детей с острой ИТП (57,2%) уровень CD20 был снижен, причем у 21,4% отмечалось значительное снижение {^лимфоцитов (в 2 раза и более по сравнению с возрастной нормой). У остальных пациентов с одинаковой частотой (21,4%) регистрировались возрастные уровни этих клеток или значения, превышающие норму.
Уровень CD3 у основной части больных (82%) был в норме, у одного больного -значительно превышал нормативные показатели, еще у одного пациента - был ниже возрастного норматива.
Наиболее глубокие изменения затрагивали Т-хелперное звено. Так, дефицит абсолютного числа CD4 был зафиксирован у 82% обследованных. Только у 18% заболевших количество этих клеток было в норме. Уровень CD8 у большинства пациентов (55%) соответствовал возрастным нормативам. У 27% больных регистрировался дефицит Т-супрессоров, у 18% - активация этого вида клеток. Индекс CD4/CD8 был снижен у 54,5% обследованных, у остальных он находился в пределах нормы,
Количество CD3/HLADR клеток чаще не выходило за рамки возрастного норматива (64%), реже изменялось с одинаковой частотой (18%) как в сторону увеличения, так и снижения.
Большая часть детей (55%) имела сниженный показатель NK-клеточного иммунитета. У 36% детей количество CD56 было в норме, у 9% - резко увеличено.
Комбинированный клеточный дефицит В-лимфоцитов и Т-хелперов наблюдался
в 54,5% случаев, а дефицит одновременно по всем ведущим звеньям клеточного иммунитета (СЭ20, С04, СШ) был отмечен у 27,3% пациентов.
Таким образом, течение острой НТП характеризовалось наиболее частым угнетением Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов на фоне нормальных показателей общего числа Т-лимфоцитов. Несколько реже при этой форме заболевания имел место В-и ИК-клеточный иммунодефицит.
При хронической ИТП, по сравнению с острой, дефицит В-клеточного звена отмечался несколько чаще (66,7%), хотя выраженное снижение этого вида клеток (в 2 раза и более) регистрировалось примерно с такой же частотой, как и при острой форме (267*). В 13,3% случаев уровень С020 увеличен, в 20% - соответствовал возрастным нормативам.
Количество СОЗ у большинства детей (66,7%) было в пределах нормы. Однако более часто, чем при острой форме заболевания, у детей с хронической ИТП наблюдалось снижение этого вида клеток (26,7%). Водном случае имело место увеличение показателя СОЗ по сравнению с возрастной нормой.
Дефицит Т-хелперов был зафиксирован также у 66,7% обследованных, в остальных случаях количество СЕ>4 не выходило за пределы возрастного норматива. С высокой частотой у детей с хроническим течением ¡отологического процесса наблюдалось снижение абсолютного уровня Т-супрессоров (60%). Нормальные значения этого параметра имели место в 26,7% случаев, повышенные - в 13,3%. Коэффициент СГ>4/С08 у 2/3 больных был в норме, у остальных пациентов ниже нормы.
Основному количеству обследованных детей (66,7%) были свойственны возрастные показатели активированных Т-лимфоцитов. В каждом пятом случае наблюдалось снижение этого параметра. Повышенные значения СОЗ/НЬАО!* были зарегистрированы у 13,3% больных.
Дефицит натуральных киллеров выявлен более чем у половины заболевших (53,3%)- В 2 раза чаще, чем при острой форме заболевания, наблюдалась активация ЫК-клеточного звена иммунитета (20%). Возрастные показатели СЭ56 отмечались в каждом четвертом случае.
Комбинированный дефицит В-лим-фоцитов и Т-хелперов выявлялся несколько чаще, чем при острой форме (63,7%). Одновременное снижение абсолютных значений С020, СБ4, СБ56 также с большей частотой (33,3%) наблюдалось в случае хронизации заболевания.
Приведенные данные позволяют констатировать, что при хронической форме заболевания, так же, как при острой, с большой частотой регистрируется дефицит В-, ЫК-клеточного звеньев иммунитета. С другой стороны, если при острой ИТП выявлена депрессия Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов при нормальном количестве общих Т-лимфоцитов, то при хронической форме с одинаковой частотой отмечалось угнетение как Т-хелперов, так и цитотокси-ческих Т-лимфоцитов. При этом общее количество Т-лимфоцитов было снижено у каждого четвертого больного.
Тем не менее, несмотря на визуально определяемую значительную разницу по ряду иммунологических параметров между острой и хронической формами заболевания, достоверных отличий ни по одно-
му из оцениваемых показателей получено не было.
Результаты проведенного исследования согласуются с мнением многих авторов [4,14], что при хронической форме заболевания дефицит Т-супрессоров встречается чаще и выражен в большей степени, чем при острой ИТП. В то же время в отношении В-лимфоцитов получены данные, противоположные точке зрения большинства авторов. Мы предполагаем, что низкие уровни В-лимфоцитов у обследованных больных связаны с недостаточным стимулирующим влиянием Т-хелперов, дефицит которых отмечался у большей половины пациентов как с острой, так и с хронической формами заболевания. Низкие показатели М-клеток у половины детей могли быть связаны с воздействием вирусов простого герпеса, цито-мегаловируса, высокие титры к которым обнаруживались у 2/3 больных.
Проведение комплексного иммунологического обследования с изучением фенотипа лимфоцитов периферической крови предполагаем желательным и вполне обоснованным мероприятием у больных тром-боцитопенической пурпурой. Выявленные сдвиги в иммунитете требуют соответствующей коррекции и динамического контроля после ее проведения. Иммунологический мониторинг наиболее важен для больных с хроническим течением заболевания, которым в любой момент может потребоваться оперативное лечение. Большую роль играет этот метод в дифференциальном диагнозе ИТП с вторичными тромбо-цитопеническими пурпурами, протекающими в сочетании с первичными иммуноде-фицитами.
Библиографический список
Х.Донюш, ЕК Современное состояние вопроса об идиопатической тромбоцитопе-нической пурпуре у детей / ЕК Донюш Ц Педиатрия. - 1999. - № 2. - С. 56-78.
2. Змушко, ЕЛ. Клиническая иммунология: руководство для врачей / ЕК Змушко, Е.С. Белозеров, ЮА. Мишин. - СПб.: Питер, 2001.-576 с.
3. Иммуноаллергологическая диагностика в практике врача-педиатра: пособие для врачей / ВА. Черешнев, ИЛ. Корюкина, МЛ. Ргпецкая и др. - Пермь: ГОУ ВПО «ПГМА Минздрава России», 2004. - 65 с.
4. Колесникова, ОМ. Тромбоцитопени-ческая пурпура у детей / ОЛ. Колесникова. -Барнаул: АГМУ, 2003.-34 с.
5. Мазуров, ДБ. Оценка поглощения бактерий гранулоцитами и моноцитами периферической крови методом проточной цитометрии / ДВ. Мазуров, К.Ф. Хамидуми-на, Б£. Пинегин Ц Иммунология. - 2000. -№1.- С. 57-61.
6. Иазаренко, ГЛ. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / ГЛ. Иазаренко, АА. Кышкун. - М.: Медицина, 2000. - 544 с.
7. Петров, ВЮ. Современные аспекты этиопатогенеза, клинического течения и терапии острой тромбоцитопенической пурпуры у детей: автореф. дис. - д-ра мед. наук IВЮ.Петров. - М., 2005, - 43 с.
8. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека: пособие для врачей-лаборантов / БЛ Пинегин, АА Яри-лин, AB. Симонова и др. - М.: Государственный научный центр РФ - Институт иммунологии МЗ РФ, 2001.-53 с.
9. Хаитов, РМ Оценка иммунного статуса человека в норме и патологии / РМ. Хаитов, Б£. Пинегин // Иммунология. -2001. - №4. - С. 4-6.
\0 Ярцев, МН. Иммунная недостаточность: кли нико-лабораторная оценка иммунитета у детей / МН. Ярцев, КЛ. Яковлева // Иммунология. - 2005. - №1. - С. 36-44.
U.Cines, DB. Immune thrombocytopenic purpura / DB. Cines, VS. Blanchette // N. Engl. J. Med. - 2002. - VoL 346. - №13. - P. 995-1008.
12Jackson, A Basic pheno typing of lymphocytes: Selection and testing of agents and interpretation of data / A Jackson // Clin. Immunol. - 1990. - №10. - P. 43-55.
MLyons, AB. Determination of lymphocyte division by flow cytometry / AB, Lyons // j. of Immunol. Methods. - 1994. - Vol. 171, -P. 131-137.
ЦЯоЬЬ, G. ldiopatic thrombocytopenic purpura: Predictors of chronic disease / G. Robb, К. Штат //Arch. Dis. Child. - 1990. -Vol. 65. - P. 502.
D.V. Merkuryev, N.B. Merztova,
V.I. Baturin, G.V. Boris, S.I. Samottova,A.V. Vasifyeva
USER FLOW CYTOMETRY
IN DIAGNOSIS OF HUMAN UMMUNE STATE
The most up-to-date technology in diagnosis of human immune state is laser flow cytometry (LFC) that informs about quantitative and functional state of immune system. The aim of investigation was to study subpopulation composition of peripheric blood lymphocytes in children with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Fourteen children with acute (TP and fifteen ones with chronic ITP were examined. Analyses were fulfilled with flow cy-tometer «FACStrak». Absolute number of CD20, CD3> CD4, CD8, CD56, CD3/HLADR was calculated No reliable differences between acute and chronic ГГР by the parameters investigated were obtained.
Keywords: immune system, laser flow cytometry, lymphocyte subpopulations, children, idiopathic thrombocytopenic purpura.
Пермская государственная медицинская академия им. Е.А. Вагнера Росздрава.
ГУЗ Пермская областная детская клиническая больница, г. Пермь
Материал поступил в редакцию 4.05.06
