CC BY
8Дресвянский В. П. и др. Лазерная люминесцентная микроспектроскопия ... DOI: 10.24412/CL-34446-2023 -4-191-194
ЛАЗЕРНАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСПЕКТРОСКОПИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
В. П. Дресвянский1, Н. Л. Лазарева1, А. Л. Ракевич1, О. Т. Русинек2,3, А. Б. Купчинский3, Е. Ф. Мартынович1,2
1 Иркутский филиал Института лазерной физики СО РАН, г. Иркутск 2Иркутский государственный университет, г. Иркутск 3Байкальский музей СО РАН, п. Листвянка alberet94@mail.ru
В настоящее время люминесцентные методы являются мощным инструментом исследования различных объектов как органического, так и неорганического происхождения. Научное направление люминесцентной спектроскопии высокого разрешения интенсивно развивается в ведущих лабораториях мира, благодаря многим практическим приложениям в физике, химии, геномике и протеомике, медицине и других науках о жизни, нанодиагностике, в технических науках и т. д. [1; 2] Цель данной работы заключается в развитии и апробации методов люминесцентной микроспектроскопии для исследования биологических объектов. В докладе будут представлены результаты люминесцентных исследований органов и тканей эндемичных пелагических ракообразных в процессе их онтогенеза на примере Epischura baicalensis Sars, 1900, а также диатомовых водорослей, как важнейшего организма экосистемы оз. Байкал и других биологических объектов.
Основным экспериментальным методом проведения исследований является метод конфокальной сканирующей люминесцентной микроскопии с временным разрешением, реализующий принцип время-коррелированного пространственно-селективного счета одиночных фотонов. Исследования проводились на высокочувствительном сканирующем конфокальном люминесцентном микроскопе с пикосекундным временным разрешением MicroTime 200 фирмы PicoQuant Gmbh с пространственно-селективным время-коррелированным счетом одиночных фотонов. Микроскоп позволяет регистрировать продольные и поперечные пространственные распределения концентраций центров свечения и строить изображения микрообъектов внутри облученного объема среды в люминесцентном излучении при шаге сканирования 10 нм с селекцией изображений по времени затухания свечения. Для измерения спектров люминесценции использовался оптически совмещенный с конфокальным микроскопом компактный высокочувствительный оптический спектрометр QE65000 (Ocean Optics) с
охлаждаемым широкодиапазонным фотоприемником. Микроскоп позволяет использовать методики визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS), исследовать временную зависимость интенсивности флуоресценции и др. Чувствительность прибора на уровне единичных молекул в сочетании со сверхвысоким временным разрешением позволяет проводить уникальные исследования в области лазерной люминесцентной микроспектроскопии биологических объектов.
На рис. 1 представлены обзорные люминесцентные изображения Е. baicalensis, полученные на инвертированном микроскопе ОНтрш IX 71 при освещении объектов исследования расфокусированным излучением лазерного диода с длиной волны излучения 405 нм. Как видно из данных, представленных на рис. 1, характер свечения у разных особей отличен. Например, красное свечение визуализируется в разных местах тела рачков и имеет разную интенсивность свечения. Разные органы у одной и той же особи люминесцируют по-разному. Данный факт подтверждается результатами измерений спектров фотолюминесценции представленными на рис. 2.
Рис. 1. Люминесцентные изображения Е. Ьакактч^', полученные на инвертированном микроскопе ОИшриБ IX 71 при возбуждении люминесценции источником с длиной волны
излучения 405 нм
Результаты лазерной конфокальной сканирующей люминесцентной микроскопии с временным разрешением показали, что основной вклад в спектры люминесценции E. baicalensis вносит свечение Green Fluorescent Protein (GFP) и хлорофилла - составная часть фитопланктона. Наблюдаемое в спектрах фотолюминесценции небольшое смещение в коротковолновую область полос, связанных со свечением хлорофилла с максимумом на 680 нм, по нашему мнению, обусловлено двумя причинами. Во-первых, это зависит от места локализации фитопланктона в теле E. baicalensis.
Дресвянский В. П. и др. Лазерная люминесцентная микроспектроскопия ...
Так, в ротовой полости рачка фитопланктон еще находится в не переработанном виде. По мере продвижения по кишечнику рачка, в результате метаболических процессов происходит эволюция фитопланктона, что приводит к наблюдаемому в экспериментах изменению спектров фотолюминесценции в красной области. Во-вторых, это может быть связано с тем, что максимум интенсивности в зависимости от концентрации хлорофилла может смещаться. Известно, что интенсивность полос люминесценции фитопланктона зависит от концентрации хлорофилла и может служить экологическим маркером водоема [3].
Характерные спектры свечения диатомовых водорослей при возбуждении фотолюминесценции пикосекундными лазерными импульсами с длиной волны излучения 375 нм приведены на рис. 3.
В спектрах наблюдаются две ярко выраженные полосы свечения разной интенсивности с максимумами около 680 и 730 нм, соответственно. При этом на длине волны 680 нм обнаруживается высоко интенсивная полоса фотолюминесценции.
На рис. 4 представлены результаты исследования временных параметров фотолюминесценции диатомовых водорослей. В кривых затухания фотолюминесценции хлорофилла наблюдаются временные экспоненты: 5,832; 1,413; 0,783.
В процессе исследования было установлено существенное уменьшение интенсивности излучения объектов с максимумами на длинах волн 680 и 730 нм. Предположительно это связано с изменениями естественных условий среды обитания (см. рис. 3). Пробы хранились при температуре, близкой к естественным условиям среды обитания (от +3 до +5 °С), а естественное освещение отсутствовало. Вследствие чего возможно были нарушены процессы фотосинтеза диатомовых водорослей. В естественных условиях с глубиной не только убывают интенсивность освещения и световой
150Q:
Wavelength (nmj
Рис. 2. Характерные спектры фотолюминесценции
Е. Ьтсактч^'
1600014000' 12000
(гкп)
Рис. 3. Графики фотолюминесценции диатомовых водорослей, полученные 20 марта (красный), 21 марта (черный), 22 марта (синий)
Рис. 4. Кривая затухания фотолюминесценции диатомей рода Koliella
период, но изменяется также качество света вследствие неодинакового поглощения лучей солнечного спектра разной длины световых волн. Качество и количество световой среды являются определяющими факторами для процесса фотосинтеза, который обеспечивается взаимодействием различных пигментов. Данные исследований показывают, что изменения факторов для процесса фотосинтеза, существенным образом влияют на характер спектров фотолюминесценции диатомей.
Работа выполнена в рамках плана фундаментальных исследований Российской академии наук на период до 2025 года (№ проекта 0243-2021-0004).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Dynamic Superresolution Imaging of Endogenous Proteins on Living Cells at Ultra-High Density / G. Giannone, E. Hosy, F. Levet, A. Constals, K. Schulze, A. I. Sobolevsky, M. P. Rosconi, E. Gouaux, R. Tampe, D. Choquet, L. Cognet // Biophysical Journal. 2010. Vol. 99. P. 1303-1310.
2. The bright future of single-molecule fluorescence imaging / M. F. Juette, D. S. Terry, M. R. Wasser-man, Z. Zhou, R. B. Altman, Q. Zheng, S. C. Blanchard // Current Opinion in Chemical Biology. 2014. Vol. 20.
3. Popik A. Yu., Gamayunov E. L. The dependence of the fluorescence spectrum of phytoplankton on external influences // Pacific Science Review A: Natural Science and Engineering. 2015. Vol. 17. P. 29-33.
