CC BY
106
Цветкова Т. Г., Тишко А. Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А. М. Никифорова» МЧС России, г. Санкт-Петербург, Россия
ЛАБОРАТОРНЫЙ ФЕНОМЕН ЭДТА-ИНДУЦИРОВАННОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
Tsvetkova T. G., Tishko A. N.
The Federal State Budgetary Institute «The Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine» The Ministry of Russian Federation for Civil Defense, Emergencies and Elimination of Consequences of Natural Disasters, Saint-Petersburg, Russia
THE LABORATORY PHENOMENON OF EDTA-INDUCED PLATELET AGGREGATION
Резюме. Феномен ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов встречается крайне редко и требует особого внимания для исключения истинной тромбоцитопении. Проведено обследование 22836 пациентов, впервые обратившихся в ФГБУ «ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова» МЧС России. Использованы методы проточной цитометрии на гематологическом анализаторе Beckman Coulter LH750 и световой микроскопии образцов с К2ЭДТА и цитратом Na. Установлена встречаемость ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении, которая составила 0,13 %. По данным цитометрии установлены основные признаки данного феномена, такие как указание прибора на ложный лейкоцитоз, наличие агрегации тромбоцитов в мазках крови при микроскопии, нарастание тромбоцитопении при хранении пробы с течением времени, выявлено отсутствие влияния температуры окружающей среды на нарастание количества тромбоцитарных агрегатов. Даны рекомендации при первичном выявлении у пациента тромбоцитопении исследовать две пробы: с К2ЭДТА и цитратом Na. Также в статье приведен обзор литературы, который показывает актуальность вопроса и интерес специалистов разных стран к данной проблеме, который сохраняется уже на протяжении 40 лет.
Ключевые слова: ЭДТА-индуцированная псевдотромбоцитопения, цитрат Na, ложный лейкоцитоз.
Abstract. The phenomenon of EDTA-induced platelet aggregation is extremely rare and requires special attention for true thrombocytopenia. A survey of 22836 patients, who first applied to our hospital. Methods of flow cytometry on the Beckman Coulter LH750 hematological analyzer and light microscopy of the samples with K2EDTA and sodium citrate were used. The incidence of EDTA-dependent pseudotrombocytopenia was found to be 0.13 %. According to cytometry data, the main signs of this phenomenon are established, such as the indication of a device for false leukocytosis, the presence of platelet aggregation in blood smears during microscopy, the increase of thrombocytopenia during storage of the sample over time, revealed the absence of influence of ambient temperature on the increase in the number of platelet aggregates. Recommendations are given for the initial detection of thrombocytopenia in a patient to examine two samples: with K2EDTA and sodium citrate. Also there is a review of literature that shows the relevance of the issue and the interest of specialists from different countries to this problem, which has been already preserved for 40 years.
Keywords: EDTA-induced pseudotrombocytopenia, sodium citrate, false leukocytosis.
Введение. Вакутейнеры с ЭДТА (этилендиа-минтетрауксусной кислотой) повсеместно используются в гематологических исследованиях. Феномен ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов встречается в работе практикующего врача редко и выявляется в 0,07-0,2 % случаев [1]. Такая частота встречаемости при-
водит к недостаточной информированности врачей и к принятию тактически неверных решений. Обнаружение у пациента низких или критически низких цифр содержания тромбоцитов в периферической крови может быть интерпретировано как истинная тромбоци-топения, что обязательно потребует допол-
нительного обследования и связанных с этим временных, экономических и эмоциональных затрат. В некоторых случаях возможна постановка неверного диагноза с началом агрессивной терапии, а несвоевременное определение причины снижения тромбоцитов на этапе предоперационной подготовки может нести тяжелые последствия для пациентов с ургентной патологией. Коварство ЭДТА-ассоциированной агрегации тромбоцитов также связано с нарастанием псевдотромбоцитопении пропорционально времени взятия и хранения образца крови, что делает практически невозможным динамическое наблюдение за показателями тромбоцитов. Таким образом, редкость явления нисколько не уменьшает его значимости для конкретного пациента и требует особого внимания, как от врачей-клиницистов, так и от врачей лабораторной службы.
Материалы и методы. В интервале с 2014 по 2017 год было обследовано 22836 пациентов, первично обратившихся в ФГБУ «ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова» МЧС России. При выявлении тромбоцитопении клинический анализ крови проводился в образцах, взятых одновременно в два вакутейнера: с К2ЭДТА и цитратом Na. Все образцы были проверены на гематологическом анализаторе Beckman Coulter LH750, также во всех случаях проводилась микроскопия мазков крови.
Результаты. В результате проведенного исследования был выявлен 31 случай ЭДТА-за-висимой агрегации тромбоцитов, что составило 0,13 % от общего числа проб. Группу составили 14 мужчин (45 %) в возрасте от 22 до 81 года и 17 женщин (55 %) в возрасте от 24 до 80 лет. Взаимосвязи появления ЭДТА-зави-симой псевдотромбоцитопении с полом или возрастом обнаружено не было. Также феномен проявлялся у пациентов вне зависимости от диагноза. При исследовании образцов крови в пробирках с ЭДТА на гематологическом анализаторе отметка об агрегации тромбоцитов всегда сопровождалась указанием на ложный лейкоцитоз, числовое выражение которого находилось в обратной зависимости от степени тромбоцитопении. При микроскопии мазков всегда отмечалось наличие тромбоцитарных агрегатов, сопоставимых по размеру с размером лейкоцитов. Было отмечено нарастание тромбоцитопении при хранении пробы с течением времени. При прицельном анализе одной пробы было показано, что агрегаты появлялись по мере снижения температуры образца до ком-
натной, а при помещении исследуемого образца в условия + 5оС в течение 30 минут обнаруживалась выраженная агрегация тромбоцитов и максимальная цифра ложного лейкоцитоза. Помещение образца крови в термостат (+ 37оС) не приводило к диссоциации тромбоцитарных агрегатов. Факт наличия именно ЭДТА-ассо-циированной агрегации был подтвержден отсутствием агрегатов в пробах с цитратом Na у этих же пациентов.
Обсуждение. Явление ЭДТА-ассоциированной псевдотромбоцитопении широко описано в литературе. Первое ее упоминание относится к 1978 году [2]. В 1982 году были опубликованы работы по поиску антител, предположительно являвшихся непосредственной причиной агрегации тромбоцитов в присутствии ЭДТА. Было отмечено, что агрегация тромбоцитов в ЭДТА-стабилизированной пробе максимально проявлялась при температуре от 0 до + 4 °C [3]. В 1986 году японскими учеными было предложено использовать MgSO4 в качестве антикоагулянта для корректного определения количества тромбоцитов у пациентов с феноменом ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов [4]. Тогда же было высказано предположение, что так называемый клеточный сателлизм, слипание тромбоцитов с лейкоцитами in vitro, также встречается в пробах с ЭДТА-консервантом [5], а агрегаты тромбоцитов из-за схожести в размере могут распознаваться гематологическим анализатором как лейкоциты, что приводит к появлению ложного лейкоцитоза [6]. Было предложено использовать цитрат натрия в качестве альтернативного антикоагулянта при ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов [7]. В наших наблюдениях указание на ложный лейкоцитоз встречалось в 100 % случаев, а явление клеточного сателлизма было отмечено при микроскопическом исследовании только в одной пробе с ЭДТА, который действительно не отмечался в образце с цитратом натрия.
В последующих работах была отмечена быстрая диссоциация агглютинированных тромбоцитов после добавления канамицина (20 мг) в 1 мл ЭДТА-антикоагулированной крови [8]. Нами был проведена попытка применения канамицина для диссоциации агрегатов в исследованных пробах, но положительных результатов получено не было.
Также в отдельных исследованиях обнаружено, что антитела, присутствовавшие у пациентов с феноменом ЭДТА-зависимой агрегации, направлены против мембранного антигена GP78, участвующего в агрегации тромбоцитов вместе с гликопротеиновым комплексом IIb/
IIIa [9]. Агглютинирующими антителами были признаны IgA — в 40 % случаев, IgG — в 30 % наблюдений и IgM — у 10% пациентов. Полученные данные позволили сделать вывод, что ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопения вызвана агглютинирующими антителами, которые распознают цитоадгезивные рецепторы на тромбоците GPIIb — IIIa [10].
В 2012 году группой исследователей [11] было решено, что анализ образцов крови, содержащих цитрат натрия, взятых для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ), является приоритетным методом в определении точного числа тромбоцитов.
Тогда же, в 2012 году, Lippi G., Plebani M. [12] было предложено пять основных критериев ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении:
— низкое количество тромбоцитов (обычно <100х10Л9/л);
— возникновение тромбоцитопении в образцах с ЭДТА при комнатной температуре без подтверждения в пробах, собранных с другими антикоагулянтами, и/ или нагретых до температуры ~ +37 °C;
— снижение количества тромбоцитов в пробе с ЭДТА при хранении;
— выявление агрегатов тромбоцитов в ЭДТА-стабилизированных образцах при помощи показателей анализаторов или при помощи микроскопии;
— отсутствие клинических признаков или симптомов тромбоцитопении.
Этими же исследователями предложено несколько способов предупреждения ЭДТА-зави-симой агрегации тромбоцитов, таких как нагревание образца до 37 °C, добавление веществ или специальных антикоагулянтов (буферный цитрат натрия, гепарин, оксалат аммония, р-гидроксиэтилтеофиллин, фторид натрия, CPT (тринатрийцитрат, пиридоксальный 5'-фосфат и трис), антиагреганты, азид калия, амикацин, канамицин или другие аминогликозиды, замещение кальция одновременным добавлением хлорида кальция/гепарина). Было подтверждено, что наиболее подходящим для пациентов с ЭДТА-ассоциированной агрегацией тромбоцитов является анализ образцов крови с использованием цитрата натрия, СРТ или хлорида кальция/гепарина в качестве добавок, а также сохранение образцов крови при + 37 °C до момента определения количества тромбоцитов.
В 2014 году Nagler M. и соавт. отметили, что ЭДТА-псевдотромбоцитопения может легко диагностироваться даже врачами общей прак-
тики без какого-либо опыта в лабораторных гематологических исследованиях. Был представлен первый отчет, иллюстрирующий типичные схемы гистограмм гематологического анализатора распределения тромбоцитов (РЬТ) и лейкоцитов (ШВС) на примере клинического случая 37-летней пациентки с подозрением на острый лейкоз. Исследование образца крови с ЭДТА выявило атипичные лимфоциты и изолированную тромбоцитопению вместе с типичными образцами гистограмм лейкоцитов и тромбоцитов: зубчатую кривую гистограммы тромбоцитов и особый пик на левой стороне гистограммы лейкоцитов. ЭДТА-псевдотром-боцитопения была подтверждена нормальным количеством тромбоцитов при исследовании крови с цитратом натрия [13].
В 2015 году было проведено ретроспективное исследование случай-контроль на основе базы данных Больницы Университета Токио. Авторами проанализированы 104 пациента с диагнозом ЭДТА-псевдотромбоцитопении в период с 2009 по 2012 год. Изучалась частота осложнений и течение болезни. Прогноз оценивали с использованием многовариантного регрессионного анализа Кокса, учитывающего возраст, пол, наличие аутоиммунных заболеваний, заболеваний печени и злокачественных опухолей. У пациентов с ЭДТА-ассоциированной агрегацией тромбоцитов была более высокая частота злокачественных опухолей и более низкая частота гипертонии и диабета, чем в контрольной группе. После корректировки фоновых факторов прогноз пациентов с ЭД-ТА-псевдотромбоцитопенией был значительно хуже, чем у пациентов контрольной группы, так как они имели более высокую смертность [14].
В 2017 году БЫХ. и соавт. опубликовали случай ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов у 68-летнего пациента с послеоперационным сепсисом, у которого в послеоперационном периоде развилась выраженная тромбоцито-пения. Примечательно было то, что феномен ЭДТА-псевдотромбоцитопении исчез, когда пациент был успешно пролечен. Было сделано заключение, что низкое количество тромбоцитов у послеоперационных больных с сепсисом можно рассматривать как возможное проявление ЭДТА-псевдотромбоцитопении [15], хотя в этой группе тромбоцитопения может наблюдаться по клиническим причинам, например, при синдроме диссеминированного внутрисо-судистого свертывания. Также в 2017 году таои Н. и соавт. отметили, что микроскопическое
исследование мазков периферической крови имеет ключевое значение для подтверждения правильного диагноза и позволяет дифференцировать артефакт ЭДТА-зависимой псевдо-тромбоцитопении и гепарин-индуцированную тромбоцитопеню [16].
Таким образом, в течение почти 40 лет феномен ЭДТА-зависимой агрегации тромбоцитов периодически становится объектом пристального изучения, оставляя актуальными вопросы быстрой и своевременной диагностики, прогностического значения феномена ЭДТА-ассо-
циированной агрегации тромбоцитов, а также некоторые вопросы патофизиологии самого процесса. Поскольку ЭДТА-псевдотромбоцито-пения — это лабораторный феномен, на аналитическом этапе лабораторных исследований необходим алгоритм его быстрого обнаружения и определение истинного количества тромбоцитов, который заключается в использованном нами методе выполнения клинического анализа крови на гематологическом анализаторе одновременно из двух проб — с К2ЭДТА и цитратом натрия.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Jianhua Lin, Yaoling Luo, Shaoyu Yao et al. Discovery and Correction of Spurious Low Platelet Counts due to EDTA-Dependent Pseudothrombocytopenia // Journal of Clinical Laboratory Analysis. 2015. Vol. 29. P. 419-426.
2. Murai Y, Shirakura T, Matzuda T et al. A case of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia-study on antiplatelet factor present in patient's plasma // Japanese. Rinsho Ketsueki. 1978. Apr; 19 (4). P. 361-6.
3. Pegels JG, Bruynes EC, Engelfriet CP et al. Pseudothrombocytopenia: an immunologic study on platelet antibodies dependent on ethylene diamine tetra-acetate // Blood. 1982. Jan; 59(1). P. 157-61.
4. Nakamoto K, Sugibayashi S, Takahashi A et al. Platelet count in EDTA-dependent pseudothrombocytopenia-application of MgSO4 as an anticoagulant. // Japanese. Rinsho Byori. 1986. Feb; 34 (2). P. 167-73.
5. Reusser P, Osterwalder B, Speck B. EDTA-dependent pseudothrombopenia. // German Schweiz Med Wochenschr. 1986 Nov 8. 116 (45). P. 1566-9.
6. Mancini S, d'Onofrio G, Zini G et al. Pseudothrombocytopenia and pseudoleukocytosis. Study of 17 cases of EDTA-dependent platelet agglutination // Italian Recenti Prog Med. 1986. Dec; 77 (12). P. 573-9.
7. Maslanka K, Meloch R, Mularczyk M et al. Pseudothrombocytopenia // Polish Acta Haematol Pol. 1991. 22 (1). P. 160-4.
8. Sakurai S, Orita T, Ohkubo A et al. Effects of antibiotics on the dissociation of platelet adherence in pseudothrombocytopenia. // Japanese. Rinsho Byori. 1992. Dec; 40 (12). P. 1275-80.
9. De Caterina M, Fratellanza G, Grimaldi E et al. Evidence of a cold immunoglobulin M autoantibody against 78-kD platelet glycoprotein in a case of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia // J Clin Pathol. 1993. Feb; 99 (2). P. 163-7.
10. Casonato A, Bertomoro A, Pontara E et al. EDTA dependent pseudothrombocytopenia caused by antibodies against the cytoadhesive receptor of platelet gpIIB-IIIA // J Clin Pathol. 1994. Jul; 47(7). P. 625-30.
11. Ozcelik F, Arslan E, Serdar MA et al. A useful method for the detection of ethylenediaminetetraacetic acid- and cold agglutinin-dependent pseudothrombocytopenia // J Med Sci. 2012. Nov; 344(5). P. 357-62.
12. Lippi G, Plebani M. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: further insights and recommendations for prevention of a clinically threatening artifact // Clin Chem Lab Med. 2012. Aug; 50(8). P. 1281-5.
13. Nagler M, Keller P, Siegrist D et al. A case of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: simple recognition of an underdiagnosed and misleading phenomenon // BMC Clin Pathol. 2014. May 1. P. 14-19.
14. Ohashi-Fukuda N, Inokuchi R, Sato H et al. Poorer prognosis with ethylenediaminetetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia: a single-center case-control study // Medicine (Baltimore). 2015. Apr; 94(15): e674. doi: 10.1097/MD.0000000000000674.
15. Shi X, Lin Z, He L et al. Transient appearance of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a postoperative patient with sepsis: A case report // Medicine (Baltimore). 2017. Mar;96(11): e6330. doi: 10.1097/MD.0000000000006330.
16. Titou H, Jalal Y, Boui M. A non-EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: about a case // Pan Afr Med J. 2017. Feb 22;26:88. doi: 10.11604/pamj.2017.26.88.11097. eCollection 2017.
