CC BY
234
128,7 мг/дл при среднем значении 24 ± 17,8 мг/дл). У 7 больных наблюдался нормальный уровень как ммЛПНП, так и ХИК, а у 3 больных повышенный уровень ммЛПНП при нормальном уровне ХИК. Показатели связывания комплемента иммунными комплексами, содержащими ммЛПНП, рассчитывали как ингибирование системы комплемента в процентах от контроля системы и составили 31,1 ± 17,5% (колебания от 5 до 65%). Для оценки атерогенности иммунных комплексов использовали формулу: Атерогенность ИК =% ингибирования/ХИК, мг/дл. При расчете атерогенности ИК получены среднее значение 22 ± 23,3 ЕД (колебания от 1,6 до 122,2 ЕД). Анализ атерогенности ИК в группе больных с нормальным уровнем ХИК (до 10 мг/дл) позволяет распределить больных на 3 подгруппы: 1 подгруппа с высокой атеро-генностью ИК (4 пробы, соответственно АИК составил 122,2; 65,1; 38,5 и 58,6 ЕД); 2 подгруппа со средней атерогенностью ИК (4 пробы от 10,2 до 24,4 ЕД); 3 подгруппа с низкой - 2 пробы (3,2 и 4,8 ЕД). Анализ показателей атерогенности ИК в группе с повышенным уровнем ХИК показывает обратную картину, т.е. иммунные комплексы, содержащие высокие значения холестерина в ммЛПНП, обладают низким значением атерогенности. Это подтверждает роль системы комплемента в солюбилизации и элиминации иммунных комплексов. Иммунные комплексы, обладающие высокой комплемент активирующей способностью, опсонизируются молекулами C3b, связываются с CR1 рецепторами на эритроцитах и эффективно элиминируются из циркуляции. И наоборот, иммунные комплексы, обладающие низкой комплемент активирующей способностью, агрегируют и длительно циркулируют в кровотоке. Фагоцитоз таких комплексов незавершенный и это приводит к трансформации в «пенистые» клетки.
Разработан новый показатель атерогенности иммунных комплексов, маркер для прогноза течения патологического процесса в сосудах.
Б.Б. Шойбонов'-4, М.А. Кравченко2, А.А. Шабалина2, М.В. Костырееа2, В.Ю. Баронец3, 4. Определения холестерина в иммунных комплексах. 'ФГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН, 2ФГБУ НЦ неврологии» РАМН, 3ФГБУ Национальный научный центр наркологии Минздрава РФ, 4ФГБУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва
В настоящее время убедительно доказано, что атероген-ность сыворотки крови обусловлена присутствием множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛПНП), аутоантител к ним и иммунных комплексов. Иммунизация окисленными ЛПНП (оЛПНП) животных, содержащихся на обогащенной холестерином диете, вызывает развитие у них атеросклероза в 50% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунная реакция организма на оЛПНП может быть как про-атерогенной, так и анти-атерогенной.
Цель исследования - разработка метода определения холестерина в иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП, для рутинных исследований.
В работе исследовали сыворотки крови 15 доноров, 15 больных ИБС и 60 неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий. Забор крови проводили натощак из локтевой вены, отделяли сыворотку и определяли уровень холестерина в иммунных комплексах путем обработки сыворотки крови буфером-1 (10мМ трис-НС1-буфер, содержащий 8,3% ПЭГ-3350, 3,3% ПВП 12600, 0,15 М №С1, рН 7,4) для преципитации ИК в соотношении 1:1,2 с последующей инкубацией в течение 10 мин при 23оС. Агрегированные ИК осаждали центрифугированием при 3100g в течение 5 мин при 23оС, тщательно декантировали и преципитат ИК растворяли в исходном объеме сыворотки в буфере-2 (10мМ трис-НС1-буфер, содержащий 0,15 М №С1, рН 7,4), содержание холестерина в иммунных комплексах определяли с использованием ферментативного набора «Холестерин» («ЭКОлаб», Россия). Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследовали с помощью гемолитических тестов с использованием комплемента морской свинки. Содержание IgG в составе ПЭГ/ПВП преципитата определяли в тесте торможения гемагглютинации (РТГА) эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека, антителами барана против IgG человека.
В группе относительно здоровых доноров в трех пробах содержание ХИК было заметно выше, чем в остальных пробах этой контрольной группы. Полученные данные о повышенном уровне ХИК у трех доноров, возможно, свидетельствуют о субклинической стадии атеросклероза. При исключении данных доноров из группы контроля по ХИК, средний уровень ХИК составляет 7,07 ± 1,15, при колебании от 5,9 до 8,3 мг/дл. Следовательно, уровень ХИК до 8,3 мг/дл можно предварительно считать нормальным уровнем у здоровых людей. В группе больных ИБС в 100% случаев определяется повышенный уровень ХИК, и колебания составили от 11,7 до 40,3 мг/дл. Интересные результаты получены при определении ХИК в сыворотках неврологических больных с каротидным атеросклерозом. В 30 пробах содержание ХИК было на уровне контрольной группы доноров, при повышенном уровне ммЛПНП.
Выводы. 1) ХИК может служить ранним маркером атеросклероза на доклинической стадии. 2) При исследовании ХИК у больных с развившимся атеросклерозом каротидных артерий чувствительность метода составляет 50% и требуется более детальное исследование атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП. 3) У больных ИБС данный маркер может быть использован для контроля эффективности терапии при нормальных уровнях содержания холестерина и ЛПНП.
ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПЕДИАТРИИ
А.Д. Царегородцев, В.С. Сухорукое. Проблемы и перспективы лабораторной диагностики наследственных болезней у детей. ФГБУ Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России
Молекулярная медицина - один из наиболее вероятных эффективных прорывов в медицине ближайшего будущего. Это обосновано активными разработками новых видов лечения, связанных с прицельным воздействием на ген, РНК или специфические белки. Сообщения об успешных разработках все новых препаратов таргетной терапии наследственных заболеваний появляются чуть ли не ежемесячно из ведущих лабораторий мира. Ключевой проблемой на пути внедрения
методов таргетной терапии является низкий уровень раннего выявления соответствующих заболеваний. Разработка и внедрение новых диагностических технологий, направленных на выявление заболеваний, в отношении которых появились эффективные методы лечения или появление таковых можно прогнозировать в ближайшее время - являются важнейшими задачами. Более того, на первый план выходит необходимость проведения организационных мероприятий, направленных на создание банков данных о больных с заболеваниями, при которых существуют или ожидаются в ближайшее время высокоэффективные методы лечения. Примером успешной реализации таких технологий является метод определения мар-
ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПЕДИАТРИИ
керов заболевания в «сухих пятнах», внедренный в нашей стране в отношении ряда заболеваний в рамках программы неонатального скрининга. В первую очередь эффективные молекулярно-медицинские решения ожидаются в области лечения наследственных моногенных заболеваний, а впоследствии и в других областях, в том числе непосредственно не связанных с наследственными болезнями. Применение соответствующих методов диагностики и лечения на ранних этапах развития ребенка наиболее эффективно, поэтому педиатрия должна представлять собой своего рода передний край в развивающейся молекулярной медицине.
Л.И. Шагам13, П.Б. Наталин2, В.С. Сухоруков1. Высокопроизводительное секвенирование фрагментов генома — настоящее и будущее лабораторной диагностики в педиатрии.'ФГБУ Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России; 2Корпорация «Life Technologies»; 3ООО «Компания Хеликон», Москва
Клинико-генетическая диагностика периодически сталкивается с наследственными заболеваниями, выявление которых традиционными методами - ПЦР, ПЦР-ПДРФ, ПЦР-РВ, Сангеровским секвенированием и т. п. - затруднено. Это такие заболевания, как энцефалопатии, миопатии, болезни соединительной ткани, болезни метаболизма, которые при схожих симптомах могут быть вызваны мутациями в десятках различных генов. Трудности же широко распространенных сегодня методов возникают в связи с ограниченным набором локусов, которые могут быть проанализированы.
Эти потребности лабораторной диагностики могут быть удовлетворены бурно развивающимися сегодня методами высокопроизводительного секвенирования нового поколения. В основе технологии лежит параллельное секвенирование всего генома или его фрагментов. Амплификация фрагментов осуществляется на основе мультиплексной ПЦР-реакции с участием нескольких тысяч пар праймеров, собранных в «панели». Мы для решения поставленных задач используем панель наследственных заболеваний Ion AmpliSeq, которая позволяет параллельно амплифицировать экзоны 328 генов, ассоциированных с более чем 700 наследственными заболеваниями, проводим секвенированиие на приборе Ion Personal Genome Machine. Продолжительность исследования составляет 2-3 дня, при этом используется минимальное количество генетического материала (30 нг ДНК), выделяемого из крови пациентов или других тканей.
Данное исследование позволяет поставить точный диагноз многим пациентам, для которых другие методы диагностики не дают результатов.
Л.В. Кузнецова, Т.Д. Измайлова, Р.Ш. Закиров, О.В. Курбатова, Е.Ю. Капустина, С.В. Петричук. Проточная энзи-мология - новые технологии цитохимических исследований в педиатрии. ФГБУ Научный центр здоровья детей РАМН, Москва
Цель исследования - разработка инновационного метода лабораторной диагностики, объединяющего диагностические возможности метода проточной цитометрии и количественного цитохимического анализа.
В основу разработки были положены стандартные протоколы количественного определения активности внутриклеточных ферментов и иммунофенотипирования лимфоцитов (ЛФ) с использованием флюоресцентных моноклональных антител (иммуноцитохимическое исследование - ИМЦИ).
Метод ИМЦИ основан на образовании нерастворимых гранул формазана - продукта ферментативной реакции в пермеабилизированных клетках при их инкубации со специфическим субстратом и красителем - п-нитротетразолием-фиолетовым. Активность фермента пропорциональна количеству и плотности образовавшихся гранул продукта, что детектируется изменением коэффициента интенсивности бокового светорассеяния. Использование метода проточной цитометрии позволяет оценить активность внутриклеточных ферментов в разных популяциях ЛФ. Так ИМЦИ ЛФ клинически здоровых детей показало, что активность ми-
тохондриального фермента - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) имеет наибольшее значение в популяции CD3+CD8+, затем в CD3+CD4+, в NK-клетках, наименьшее в популяции В-клеток. Различные патологические состояния сопровождаются нарушением соотношения активности СДГ в разных популяциях. Результаты экспериментов по стимуляции культуры ЛФ выявили рост активности СДГ при появлении клеточных маркеров активации. Таким образом, использование принципов проточной энзимологии в цитохимических исследованиях позволяет оценить не просто активность внутриклеточных ферментов лимфоцитов, но и определить функциональную активность патогенетически значимых популяций клеток.
В.А. Аксенова, П.В. Сенчихин. Методы лабораторной диагностики латентной туберкулезной инфекции. НИИ фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ
Туберкулез является инфекционным заболеванием, вызываемым комплексом M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), обычно передается воздушно-капельным путем при контакте с больными легочной формой туберкулеза. Вновь инфицированный человек может заболеть туберкулезом через несколько недель или месяцев, но большая часть инфицированных людей остается здоровыми. Латентная туберкулезная инфекция (ЛТИ), неконтагиозное бессимптомное состояние персистирует, и туберкулез может развиться спустя месяцы или годы. Основной целью диагностики ЛТИ является необходимость назначения профилактической терапии для предотвращения развития туберкулеза. До недавнего времени кожный тест с туберкулином (КТТ) был единственным методом диагностики ЛТИ. Кожная чувствительность к туберкулину развивается через 2 -10 недель после инфекции. Однако у некоторых инфицированных людей, включая больных с различными нарушениями иммунной системы, и здоровых людей, нет ответа на туберкулиновый тест. И, наоборот, у некоторых людей, у которых с очень высокой вероятностью нет инфекции M. tuberculosis, обнаруживается чувствительность к туберкулину, и наблюдаются положительные результаты КТТ после вакцинации BCG, инфицировании другой микобактериальной инфекцией (отличной от комплекса M. tuberculosis) или из-за других неизвестных факторов.
Набор QuantiFERON®-TB Gold In-Tube (IT) предназначен для диагностики in vitro. Метод основан на использовании стимулирующей смеси белков ESAT-6, CFP-10 и TB7.7 для стимуляции клеток гепаринизированной цельной крови. Количественное определение интерферона гамма (IFN-y) методом иммуноферментного анализа используется для выявления in vitro клеточного ответа на стимуляцию этими пептидными антигенами, ассоциированными с инфекцией Mycobacterium tuberculosis. Многочисленные исследования показали, что эти пептидные антигены стимулируют IFN-y T-клеточный ответ у людей, инфицированных M. tuberculosis, но в общем случае не стимулируют такого ответа у неинфицированных людей или людей, прошедших BCG-вакцинацию, здоровых лиц или лиц с низким риском ЛТИ. QuantiFERON®-TB Gold IT является непрямым методом выявления инфекции M. tuberculosis (включая заболевание) и предназначен для использования в сочетании с оценкой риска наличия инфекции, рентгенографией и другими клиническими и лабораторными исследованиями. По результатам клинических испытаний, проведенных в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова специфичность теста у взрослых и детей составила 100%, чувствительность теста у взрослых составила 86,6%, у детей - 76,6%.
T-SPOT®.TB является тестом для in vitro диагностики туберкулеза путем выявления эффекторных T-клеток, которые отвечают на стимуляцию антигеном Mycobacterium tuberculosis, и предназначен для применения в качестве дополнительного средства диагностики туберкулезной инфекцииТ-SPOT.TB является упрощенным вариантом метода иммуноферментного бляшкообразования (ELISPOT).
T-SPOT.TB был разработан для выявления эффекторных T-клеток, которые ответили на стимуляцию специфическим антигеном M. tuberculosis. T-SPOT.TB позволяет подсчитать отдельные ТБ-специфичные T-клетки. Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяются из образцов цельной крови и отмываются, чтобы удалить любые источники мешающего фонового сигнала. Затем МНПК подсчитывают, чтобы убедиться, что в анализируемую среду будет добавлено стандартное количество клеток. Подсчет служит гарантией, что даже у лиц с низкими титрами T-клеток вследствие ослабления иммунной системы (иммунная недостаточность и иммуносупрессия) в микротитровальные лунки добавляется адекватное количество клеток. Стадии отмыва и подсчета наравне с методом ELISPOT обеспечивают наилучшие условия для выявления больных ТБ и латентной ТБ инфекции. По результатам клинических испытаний, проведенных в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова специфичность теста у взрослых составила 93,3%, у детей - 100%; чувствительность у взрослых составила 86,6%, у детей - 93,3%.
Т.И. Туркина, С.Н. Щербо, Е.В. Колодий, М.В. Дегтярева, Е.В.Киселева. Исследование ненасыщенности липидов плазмы крови у новорожденных детей с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении. ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва
Целью исследования явилось определение ненасыщенности липидов сыворотки крови (двойные связи - ДС) методом озонирования у недоношенных новорожденных детей с низкой, очень низкой и экстремально низкой массой тела (НМТ, ОНМТ и ЭНМТ соответственно) при рождении. Под наблюдением находилось 25 новорожденных детей с 1-х сут жизни до 1-го мес жизни, с весом при рождении 750-4020 г, гестационным возрастом 28-40 недель. В 1-ю группу вошли недоношенные новорожденные с ЭНМТ (12,0%); 2-ю группу составили недоношенные новорожденные с ОНМТ (8,0%); 3-4-ю группы составили новорожденные с массой тела от 2001 до 2500 г при рождении (28% и 12% соответственно); 5-я группа - доношенные дети, получавшие лечение в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) (16%). Определение ненасыщенности липидов плазмы крови проводили методом озонирования на анализаторе двойных связей. Метод озонирования основан на взаимодействии озона со связью С=С ненасыщенных жирных кислот в эквимольном соотношении. Расход озона на химическую реакцию регистрировался спектрофотоме-трически. Метод обладает высокой чувствительностью, точностью (±1%), селективностью и экспрессностью(1-3 мин на одно определение).
Впервые определены нормативные значения ненасыщенности у здоровых доношенных новорожденных (28%- группа контроля): ДС = 15,4 ± 2,0 ммоль/л. Сравнительный анализ показал, что у новорожденных 1-й и 2-й групп уровень ДС был значительно ниже нормы, с сохранением минимальных значе-
ний в 1-й группе к 3-м суткам жизни: ДС = 7,5 ± 1,20 ммоль/л (p < 0,05). Длительное сохранение показателя ДС на низком уровне является прогностически неблагоприятным признаком при тяжелом течении инфекционного процесса (сепсиса), вплоть до летального исхода. Показатель ДС в 3-, 4-, 5-й группах характеризовался недостоверным снижением ненасыщенности липидов. При стабилизации клинического состояния и нормализации показателей системной воспалительной реакции к 3-, 4-, 28-м суткам жизни уровень ДС постепенно нормализовался.
Показатель ДС можно использовать в качестве дополнительного критерия в лабораторной диагностике и мониторинге; для объективизации формирования адекватной тактики лечения (введения антиоксидантной и иммунокорреги-рующей терапии, мембраностабилизирующих препаратов), прогнозирования осложнений.
Воздвиженская Е.С., Сивцева Е.М., Длин В.В. N-терминальный натрийуретический пептид С-типа у детей с нефротическим синдромом при гломерулонефри-те. ФГБУ Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России
Целью исследования явилось определение уровня N-терминального натрийуретического пропептида С-типа в крови у детей с нефротическим синдромом при гломеру-лонефрите. Определение выполнялось иммуноферментным методом с помощью набора фирмы Biomedica (Словакия) на лабораторном анализаторе Wallac 1420 Multitabel Counter (Victor 2) у 71 ребенка (возраст от 2 до 18 лет). В основную группу вошел 31 ребенок со стероидрезистентным нефроти-ческим синдромом, группу сравнения составили 40 детей со стероидчувствительным нефротическим синдромом. Влияние стероидной терапии на уровень данного пропептида анализировалось у детей обеих групп. Контрольную группу составили 18 практически здоровых детей. Не выявлено взаимосвязи уровня N-терминального натрийуретического пропептида С-типа с активностью и вариантом нефротического синдрома при гломерулонефрите у детей (основная группа-7,57 ± 3,25 пмоль/л, группа сравнения - 7,17 ± 3,48 пмоль/л) Не установлено взаимосвязи уровня изучаемого пропептида и возраста больных детей (r = 0,1 и r = -0,31 соответственно; р > 0,5), в то время как у детей контрольной группы выявлена сильная отрицательная достоверная корреляционная связь (r = -0,725;р < 0,05). Показано, что уровень N-терминального натрийуретического пропептида С-типа зависит от выраженности снижения фильтрационной способности почек (7,57 ± 3,48 пмоль/л и 37,97 ± 18 пмоль/л при скорости клубочковой фильтрации > 90 мл/мин. и < 80 мл/мин. соответственно). Предполагается, что степень повышения данного пропепти-да в крови может отражать прогрессирование хронической почечной недостаточности и служить одним из прогностических критериев заболевания. Установлено подавляющее влияние стероидной терапии на уровень пропептида в крови у детей с нефротическим синдромом.
публикации по проблеме
А.К. Берешева. Особенности анализа при С-методе дифференциального окрашивания цитогенетического исследования хромосомных вариантов. ФГБУ Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России
При дифференциальном С-методе окрашивания цитоге-нетического исследования в настоящее время обнаружены более 50 видов хромосомных вариантов (С-варианты) генома человека в виде экстремального увеличения или уменьшения околоцентромерного гетерохроматина, инверсий (частичных или полных), а также двойные или увеличенные спутники или спутничные нити.
Практика классического цитогенетика показала, что при анализе С-вариантов в исследовании необходимо учитывать следующие особенности: 1) локализацию С-гетерохроматина, в том числе выявление частичных и полных инверсий; 2) экстремальное увеличение или уменьшение околоцентромер-ных гетерохроматиновых участков, оценивается по системе анализа (Прокофьева-Бельговская, Захаров, 1981) (более 3 и менее 1 балла соответственно); 3) сочетание частичной или полной инверсии с увеличенным или уменьшенным гетерохроматиновым участком в одной хромосоме; 4) наличие гетероморфизма околоцентромерных гетерохроматиновых райо-
