CC BY
365
IR KULMAGAMBETOV, MR RYSULY, AG DUISENBAEVA
Kazakh National Medical University. Institute of Clinical Pharmacology. Department of Laboratory Diagnostics and Molecular Medicine
NEW DIRECTIONS FOR TESTING DRUGS USING PLURIPOTENT STEM CELLS
Resume: Pluripotent stem cells (including induced) can differentiate into various cells of the adult organism. The presence of pluripotent cells in the adult organism is subject to scientific debate, although studies have shown that there is a possibility of obtaining pluripotent cells from adult human fibroblasts in vitro in a process called cell reprogramming.
There are both ethical and technical difficulties associated with obtaining cultures of cells from pluripotent stem cells. These problems relate, including the practice of test drugs on cultured cells of animals and humans. Such problems can be solved by using their own stem cells, or by cloning them. There was a need to develop new areas of testing drugs using cell cultures and cell lines derived from pluri-multi-potent stem cells.
И.Р.КУЛМАГАМБЕТОВ, М.Р. РЫСУЛЫ, А.Ж. ДУЙСЕНБАЕВА
С.Д. Асфендияров атындагы К,азац ¥лттъщ Медицина УниверситетI.
Клиникалыц фармокология институты. Зертханалъщдиагностика жэнемолекулярлыцмедицина кафедрасы.
ПЛЮРИПОТЕНТТ1 БАFАНАЛЫ ЖАСУШАЛАРДЫ ЦОЛДАНУ АРЦЫЛЫ ДЭР1Л1К ЗАТТАРДЫ ТЕСТ1ЛЕУДЩ
ЖАНА БАFЫТТАРЫ
ТYЙiн: Плюрипотентп баганалы жасушалар (соныц шшде индуцирленген) ересек агзаныц кез келген жасушаларына дифференциялана алады. Ересек агзада плюрипотентп жасушалардыц са;талуы гылыми ой таластардыц обьекпй болып калып отыр, бiрак; зерттеулер керсеткендей, зертхана жагдайында жасушаларды ;айта багдарлау ар;ылы ересек адамныц фибробластарынан плюрипотенттi жасушаларды алуга MYMкiндiк бар.
Плюрипотенттi жасушалардан да;ылдар алуда этикалы; сондай-а; техникалы; ;иыншылык;тар туындайды. Бул мэселелер дэрiлiк заттарды жануарлар мен адам жасушаларыныц да;ылдарында сынау тэжiрибесiне байланысты. Мундай мэселелердi езiндiк баганалы жасушаларды ;олдану немесе оларды клондау ар;ылы шешуге болады.
Плюрипотенттi- мультипотенттi баганалы жасушалардан алынган жасушалы; да;ылдар мен жасушалы; «менияларды»- ;олдану ар;ылы дэрiлiк заттарды тестшеудщ жаца багыттарыныц дамуына ;ажеттШк туындады.
УДК: 616.858
А.Ш. ОРАДОВА1, З.К. КАНЖИГАЛИНА2, Р.К. КАСЕНОВА2
1 - Научная клинико - диагностическая лаборатория, КаЗНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы; 2 - Кафедра лаборатоной диагностики, Институт постдипломного образования, КаЗНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЦИТОКИНОВ (ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ)
В этом обзоре уделено большое внимание ключевым и актуальным в настоящее время вопросам содержания цитокинов в различных биологических жидкостях в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. Ключевые слова: цитокины, иммунохимия.
Цитокины.
Цитокины в настоящее время рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществляющие межклеточные и межсистемные взаимодействия. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации,
функциональной активации и апоптоза последних. Цитокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представляют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма (Ковальчук Л.В. и соавт., 1999).
Являясь регуляторными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы.
В настоящее время существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность, происхождение, тип цитокиновых рецепторов. Традиционно, в соответствии с биологическими эффектами, принято выделять следующие группы цитокинов.
1) Интерлейкины (ИЛ-1 - ИЛ-18) - секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторное взаимодействие в иммунной системе и связь ее с другими системами организма;
2) Интерфероны (ИФНа, ИФНр, ИФНу) -противовирусные белки с выраженным иммунорегуляторным и противоопухолевым действием;
3) Факторы некроза опухоли (ФНОа, ФНОр -лимфотоксин) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием;
4) Колониестимулирующие факторы (КСФ) -стимуляторы роста и дифференцировки гемопоэтических клеток (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ);
5) Хемокины - хемоаттрактанты для лейкоцитов;
6) Факторы роста - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелиальных клеток, фактор роста эпидермиса) и трансформирующий фактор роста - ТФРр. Цитокины различаются по строению, биологической активности и ряду других признаков, однако обладают общими свойствами, характерными для данного класса пептидов. Как правило, цитокины представляют собой гликозилированные полипептиды средней молекулярной массы (менее 30 kD). Цитокины вырабатываются активированными клетками в низкой концентрации непродолжительное время, при этом их синтез всегда начинается с транскрипции генов. Свое биологическое действие на клетки цитокины оказывают через рецепторы на поверхности клеток-мишеней. Связывание цитокины с соответствующим рецептором приводит к активации клеток, их пролиферации, дифференцировке или гибели. Цитокины оказывают свое биологическое действие преимущественно локально, работая по принципу сети. Они могут действовать согласованно и вызывать каскадную реакцию, последовательно индуцируя синтез одних цитокинов другими. Такое комплексное взаимодействие цитокинов необходимо для формирования воспаления и регуляции иммунных реакций. Примером синергического взаимодействия цитокинов является стимуляция воспалительных реакций ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО, а также синтеза ^Е совместным действием ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13. Антагонистическое взаимодействие цитокинов также может быть негативным регуляторным механизмом контроля развития воспалительной реакции и синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (торможение продукции ИЛ-6 в ответ на увеличение концентрации ФНО). Цитокиновая регуляция функций клеток-мишеней может осуществляться по аутокринному, паракринному или эндокринному механизму. Система цитокинов включает клетки-продуценты; растворимые цитокины и их антагонисты; клетки-мишени и их рецепторы. Клетки-продуценты:
I. Основную группу клеток-продуцентов цитокинов в иммунной системе составляют лимфоциты.
№0 вырабатывают широкий спектр цитокинов в очень низких концентрациях.
ТМ продуцируют ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-3, ФНОа, необходимые для развития реакций клеточного иммунитета (ГЗТ, противовирусной, противоопухолевой цитотоксичности и
др.)
Набор цитокинов, секретируемых №2 (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-3), определяет развитие гуморального иммунного ответа.
В последние годы описана субпопуляция №3, вырабатывающих ТФРр, который супрессирует функцию как ТМ, так и №2.
Т-цитотоксические (CD8+), В-лимфоциты, естественные киллеры являются слабыми продуцентами цитокинов.
II. Клетки макрофагально-моноцитарного ряда продуцируют цитокины, инициирующие иммунный ответ и участвующие в реакции воспаления и регенерации.
III. Клетки, не относящиеся к иммунной системе: клетки соединительной ткани, эпителия, эндотелия спонтанно, без антигенной стимуляции, секретируют цитокины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических клеток, и аутокринные факторы роста (ФРФ, ЭФР, ТФРр и др.) [1-9]. Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.
Методы определения цитокинов.
Определение содержания цитокинов в различных биологических жидкостях имеет большое значение в
оценке функциональной активности
иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. В отдельных случаях (септический шок, бактериальный менингит), когда цитокины, в частности ФНОа, выступает в качестве ведущего фактора патогенеза, определение его содержания в крови или спинномозговой жидкости становится основным методом иммунологической диагностики. Иногда уровень цитокинов определяют с целью дифференциальной диагностики. Например, при бактериальном менингите в спинномозговой жидкости определяется ФНОа, а при вирусных менингитах в ней обнаруживается, как правило, только ИЛ-1. Однако определение присутствия цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях может давать отрицательные результаты в связи с особенностями этих пептидов. Являясь в основном короткоживущими регуляторами, цитокины имеют небольшой полупериод жизни (до 10 мин). Некоторые цитокины содержатся в крови в крайне низких концентрациях, накапливаясь в основном в очаге воспаления, кроме того, биологическая активность цитокинов может маскироваться при связывании их с молекулами ингибиторов, циркулирующих в крови. Существуют три различных подхода к количественному определению цитокинов: иммунохимический (ИФА), биотестирование и молекулярно-биологические тесты. Биологическое тестирование - самый чувствительный метод, но по специфичности уступает ИФА. Различают 4 разновидности биотестирования: по цитотоксическому эффекту, по индукции пролиферации, по индукции дифференцировки и по противовирусному эффекту. По способности индуцировать пролиферацию клеток-мишеней проводят биотестирование следующих цитокинов: ^-1, 2, ^-4, ^-5, ^-6, ^-7. По цитотоксическому действию на чувствительные клетки-мишени ^929) тестируют ТОТ-а и TNF-p. у тестируют по способности индуцировать
экспрессию молекул НЬА II на клетках-мишенях. ^-8 тестируют по способности усиливать хемотаксис нейтрофилов. Биотесты используются больше с исследовательскими целями или для подтверждения результатов ИФА [22-30].
Более широкое распространение получило определение цитокина в сыворотке крови и других биологических материалах с помощью твердофазного ИФА. Исследование проводится в соответствии с протоколом, прилагаемом к диагностической тест-системе. Чаще всего применяют вариант сендвич-ELISA, заключающийся в следующем: один тип МКАТ к определенному цитокину иммобилизируется на внутренней поверхности ячеек планшетов для исследования. В лунки планшета вносят исследуемый материал и соответствующие стандарты и контроли. После инкубации и промывки в лунки вносят вторые МКАТ к другому эпитопу данного цитокина, конъюгированные с индикаторным ферментом (пероксидазой хрена). После инкубации и промывки в ячейки вносят субстрат-перекись водорода с хромогеном. В процессе ферментативной реакции изменяется интенсивность окраски лунок, которую измеряют на автоматическом фотометре для планшетов. ИФА с применением МКАТ против отдельных эпитопов в молекуле цитокинов отличается высокой чувствительностью и специфичностью, кроме того, преимуществом метода является объективный автоматизированный учет результатов. Однако этот метод также не лишен недостатков, так как обнаружение присутствия молекул цитокинов еще не является показателем их биологической активности, возможность ложноположительных результатов из-за перекрестно реагирующих антигенных эпитопов, использование ИФА не дает возможности определения цитокинов в составе иммунных комплексов. ИФА отличается от биотестирования более низкой чувствительностью при высокой специфичности и воспроизводимости. Цитокин выявляется за счет его способности связываться с двумя разными
моноклональными антителами, направленными против двух разных антигенных эпитопов в молекуле цитокина. Используется, например, комплекс стрептавидин - фермент - субстрат фермента. Однако способность большинства цитокинов образовывать комплексы с сывороточными белками и т.п. может существенно исказить результаты количественного определения уровней цитокинов. Молекулярно-биологические методы позволяют
определить экспрессию цитокиновых генов в исследуемом материале, т.е. присутствие соответствующей мРНК. Наиболее чувствительной считается обратная транскриптаза полимеразная цепная реакция (RT-PCR). Обратная транскриптаза (ревертаза) используется для получения сДНК копий с мРНК, выделенной из клеток. Количество сДНК отражает исходное количество мРНК и косвенно отражает активность продукции данного цитокина.Изучение продукции цитокинов в культурах цельной крови или выделенных из крови мононуклеаров позволяет охарактеризовать секреторную активность моноцитов крови, индуцированную митогенами: Кон А, ФГА, ЛПС. Интерпретация данных в динамике позволяет прогнозировать дальнейшее течение при
органоспецифических аутоиммунных заболеваниях, при
рассеянном склерозе, при оценке эффективности применяемых методов иммунотерапии опухолей и т.д. Тестирование по биологическим эффектам, как правило, недостаточно чувствительно и иногда недостаточно информативно. Присутствие в той же биологической жидкости молекул ингибиторов или антагонистов может маскировать биологическую активность цитокинов. При этом нередко разные цитокины проявляют одинаковую биологическую активность[10-22]. Кроме того, постановка биологических тестов требует специального дополнительного оснащения, проводится в нестандартных условиях и используется
преимущественно в научно-исследовательских целях. Заключение.
Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения, что цитокины являются важнейшими факторами иммунопатогенеза. Изучение уровня цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, соотношении процессов активации Т-хелперов I и II типов, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Гумилевская О.П., Гумилевский Б.Ю., Антонов Ю.В. Способность лимфоцитов периферической крови больных поллинозом секретировать IL-4, INF при поликлональной стимуляции in vitroy/Цитокины и воспаление. Материалы международной научно- практической школы - конференции - СПб., - 2002. - Т. 1. - С. 94.
2 Булина О.В., Калинина Н.М. Анализ параметров цитокинового звена иммунитета у детей, страдающих атопическим дерматитом.// Цитокины и воспаление. - 2002. - № 2. - С. 92.
3 Скляр Л.Ф., Маркелова Е.В. Цитокинотерапия рекомбинантным интерлейкином-2 (ронколейкином) у больных с вирусным гепатитом. // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 4. - С. 43-66.
4 Marty C., Misset B, Tamion F, et al. Circulating interleukin-8 concentrations in patients with multiple organ failure of septic and nonseptic origin //Critical Care Medicine. - 1994. - V. 22. - P. 673-679.
5 Шаимова В.А., Симбирцев, А.Ю.Котов. Провоспалительные цитокины при различных типах течения гнойной язвы роговицы. // Цитокины и воспаление. Материалы международной научно - практической школы - конференции - СПб., - 2002.- № 2. - С. 52.
6 Teitelbaum S.L. Bone resorption by osteoclasts.//Science. - 2000. - V. 289. - P. 1504-1508.
7 Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. // М., - 2002. - 736с.
8 Иммунология. // Под ред. У.Пола (пер. с англ.),1,2,3 том.- М., Мир, - 1987.
9 Иммунологические методы.//Под ред. Г.Фримеля. - М., Медицина, -1987.- 472с.
10 Клиническая иммунология.//Под ред. А.В.Караулова. - М., Медицинское информационное агентство, - 1999 - 604с.
11 Лебедев К.А., Понякина И.Д. //Иммунная недостаточность. - М.: Медицинская книга, 2003. - 240с.
12 Лимфоциты. Методы.// Под ред. Дж. Клауса (пер. с англ.). - М.: Мир, 1990 - 214с.
13 Меньшиков И.В., Берулова Л.В.// Основы иммунологии. Лабораторный практикум. - Ижевск, 2001. - 134с.
14 Петров Р.В.// Иммунология. - М.: Медицина, 1987. - 329с.
15 Ройт А. // Основы иммунологии. - М.: Мир, 1991. - 327с.
16 Тотолян А.А., Фрейдлин И.С.// Клетки иммунной системы. 1,2 том. -Санкт-Петербург: Наука, 2000 - 321с.
17 Стефании Д.В., Вельтищев Ю.Е.// Клиническая иммунология детского возраста. - М.: Медицина, 1996 - 383с.
18 Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. //Клетки иммунной системы. 3,4 том. - СПб.: Наука, 2001 - 391с.
19 Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорова И.Г.//Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 430с.
20 Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. //Экологическая иммунология. - М.:ВНИРО, 1995. - 219с.
21 Беляева О. В., Кеворков Н. Н. Влияние комплексной терапии на показатели местного иммунитета больных пародонтитом // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т. 1. - № 4. - С. 34-37.
22 Cytokine gene polymorphisms in Chinese patients with psoriasis / Y.T. Chang [at al.] // British Journal of Dermatology. - 2007. - Vol. 156.
- P. 899—905.
23 IL-6 and IL-10 promoteir gene polymorphiisms in psoriasis vulgaris / W. Baran [at al.] // Acta Derm Venereol. - 2008. - Vol. 88. - P. 113-116.
24 Immunologic changes in TNF-alpha, sE-selectin, sP-selectin, sICAM-1, and IL-8 in pediatric patients treated for psoriasis with the goeckerman regimen / L. Borska [at al.] / / Pediatric Dermatology. - 2007. - Vol. 24, № 6. - P. 607-612.
25 Increased expression of the orphan nuclear receptor NURR1 in psoriasis and modulation following TNF-a inhibition / M. O'Kane [at al.] // Journal of Investigative Dermatology. - 2008. - Vol. 128. - P. 300-310.
26 Review article: anti TNF-a induced psoriasis in patients with inflammatory bowel disease / G. Fiorino [at al.] // Aliment Pharmacol Ther.
- 2009. - Vol. 29. - P. 921-927.
27 Tobin, A.-M. TNFa inhibitors in the treatment of psoriasis and psoriatic arthritis / A.-M. Tobin, B. Kirby // Biodrugs. - 2005. - Vol. 19, № 1. - P. 47-57.
28 Tumour necrosis factor alpha (TNF-a) converting enzyme and soluble TNF-a receptor type 1 in psoriasis patients in relation to the chronic alcohol consumption / A.B. Serwin [at al.] // Journal European Academy of Dermatology and Venereology. - 2008. - Vol. 22. - P. 712-717.
29 Serum levels of TNF-a, IFN-y, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity / O. Arican [at al.] // Mediators of Inflammation. - 2005. - Vol. 5. - P. 273-279.
30 Cytokine profiles during infliximab monotherapy in psoriatic arthritis / A. Mastroianni [at al.] // British Journal of Dermatology. - 2005. -Vol. 153. - P. 531-536.
А.Ш. ОРАДОВА1, З.К. КАНЖИГАЛИНА2, Р.К. КАСЕНОВА2
ЦИТОКИННЫН, ЗЕРТХАНАЛЫК ДИАГНОСТИКАСЫ
Тушн: Шолуы бул улкен назар мацызды белшген жэне сура; к0кейкестi к^рп уа;ытта эр TYрлi биологиялы; суйьщтьщтарда иммун кузырлы жасушаларды функционалды; белсендiлiктi багалауда цитокиндердiц мазмунию жэне иммундi жауаптыц реттеуi. ТYЙiндi свздер: цитокин, иммунитетке ;атысты химия.
A.S. ORADOVA1, Z.K. KANGIGALINA2, R.K. KASENOVA2
LABORATORY DIAGNOSIS OF CYTOKINES
Resume: In this review, paid great attention to critical and emerging issues currently cytokine content in various biological fluids in the assessment of the functional activity of immune cells and the regulation of the immune response. Keywords: cytokines, immunochemistry.
УДК 57.089:59
Т. А. КУДАЙБЕРГЕНОВА, Б.А. РАМАЗАНОВА, Л.Т ЕРАЛИЕВА
Казахский Национальный медицинский университет им С.Д. Асфендиярова НИИ ФПМ им. Б.А. Атчабарова
РАЗВИТИЕ ЭТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ВЫПОЛНЯЕМЫХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ
ЖИВОТНЫХ В КАЗНМУ ИМ С.Д. АСФЕНДИЯРОВА
В Казахском национальном медицинском университете им С.Д. Асфендиярова предлагается создать собственный этический потенциал для выполнения биомедицинских исследований на лабораторных животных, который включает следующие элементы: этические правила университета по проведению научных и учебных исследований на лабораторных животных; локальная этическая комиссия по надзору за условиями содержания и экспериментирования над животными; соответствующие национальным и международным стандартам условия содержания и экспериментирования над лабораторными животными в виварии и лабораториях университета; профессорско-преподавательский состав, научные сотрудники, докторанты и студенты, обладающие знаниями и навыками экспериментирования над лабораторными животными в соответствии с национальными и международными этическими стандартами.
Собственный этический потенциал по выполнению биомедицинских исследований на лабораторных животных будет способствовать защите животных от негуманного обращения и соблюдения соответствия биомедицинских исследований на лабораторных животных национальным и международным этическим стандартам, а также международной аккредитации КазНМУ им С.Д. Асфендиярова.
Ключевые слова: Этическая комиссия университета, лабораторные животные, биомедицинские исследования.
Казахский национальный медицинский университет им С.Д. Асфендиярова стремится к созданию научной среды, которая способствует уважению прав и благосостояния не только человека, участвующего в качестве субъекта в исследованиях, но также созданию условий для гуманного обращения с лабораторными животными в экспериментах и надлежащего этического контроля над их содержанием. Развиитие собственного этического потенциала по содержанию и экспериментированию над лабораторными животными необходимо для совершенствования системы этического надзора и экспертизы биомедицинских исследований, проводимых на лабораторных животных соответственно национальным и международным стандартам, которая обеспечит "благополучие лабораторных животных", предотвращая негуманное выполнение болезненных экспериментальных процедур и умерщвление животных, неоправданное и неэтичное использования лабораторных животных в учебных целях и безразличное отношение к животным у студентов и сотрудников университета, повысит уровень научной деятельности и признание научных достижений университета международным научным сообществом, а также увеличит международное сотрудничество и академическую репутацию КазНМУ.
Целью работы является предложение составляющих элементов этического потенциала биомедицинских исследований выполняемых на лабораторных животных в КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова и обоснование необходимости их развития.
Современный уровень развития медицинской науки характеризуется грандиозными изменениями в технологическом оснащении медицинской практики. Благодаря успехам генной инженерии, трансплантологии, появлению оборудования для поддержания жизни пациента и накопления соответствующих практических и теоретических знаний в области медицины и здравоохранения произошли существенные изменения в состоянии здоровья населения. Вместе с этим увеличилась потребность в экспериментировании, так как любые достижения медицинской науки нельзя применять на практике без постановки экспериментов на людях, которые в свою очередь должны проходить обязательные предварительные испытания на лабораторных животных. Свыше 100 миллионов животных ежегодно используются в научных экспериментах по всему миру [1]. Новые фармакологические препараты, медицинская техника, хирургические способы лечения проходят обязательное тестирование на безопасность для человека посредством постановки медико-биологических экспериментов и
