CC BY
529
использования рутинных мазков затрудняло постановку цитологического диагноза. Таким образом, для установления цитологического диагноза по жидкостным препаратам в обоих случаях необходимо проводить исследование совместно с традиционными цитологическими мазками.
Полученные с помощью жидкостных технологий препараты можно использовать для проведения иммуноцитохими-ческого исследования. Уменьшается расход дорогостоящих реактивов, что особенно важно при иммуноцитохимических и молекулярно-генетических исследованиях. Выраженность экспрессии антител совпадает при использовании обеих жидкостных методик, но в препаратах, приготовленных с помощью аппарата Е-Prep, отмечались более чистый фон, большее число патологических клеток в мазке, что значительно облегчает оценку реакции, сокращая время просмотра мазка. Благодаря достоинствам препаратов, приготовленных с помощью аппарата Е-Prep, удалось провести иммуноцитохи-мию в 3 из 18 случаев. В 2 случаях центрифужные препараты оказались неинформативны из-за большого числа элементов крови, и в 1 большое количество клеточного детрита не позволило провести иммуноцитохимию.
Монослойные препараты с хорошо сохранившимися клетками на определенной фиксированной площади позволяют использовать современные компьютерные технологии обработки изображений, проведения морфометрии.
Однако существуют и недостатки жидкостных препаратов, среди которых являются следующие.
Цитолог в своем заключении опирается не на одну, отдельно взятую клетку, а на совокупность клеток. Часто большое значение придается взаимному расположению клеток и их взаимодействию с элементами стромы, что нарушается при получении жидкостных препаратов и в большинстве случаев требует просмотра их совместно с рутинными цитологическими мазками.
Большое значение для оценки процесса имеет фон препарата, в жидкостных препаратах он значительно снижен или отсутствует - эритроциты, нейтрофильные лейкоциты, лим-
фоциты, детрит, миксоидное вещество, что лишает цитолога дополнительной диагностически важной информации.
Морфология клеток в жидкостных препаратах отличается по сравнению с рутинными цитологическими препаратами, необходим опыт в просмотре таких препаратов.
Метод жидкостной цитологии позволяет получать высококачественные стандартные, монослойные цитологические препараты, является более эффективным, чувствительным в сравнении с рутинным методом. Он может успешно использоваться в диагностике опухолей молочной железы, щитовидной, слюнной железы, опухолей мягких тканей, вы-потных жидкостей, метастазов в лимфатические узлы в сочетании с рутинным методом, так как в настоящее время еще нет достаточно накопленного опыта в просмотре таких препаратов (изменены морфология клеток, фон, пространственное расположение клеток).
Цитологические препараты, приготовленные методом жидкостной цитологии, могут успешно применяться для проведения иммуноцитохимического исследования, морфоме-трии, компьютерной обработки изображений. Более тщательный анализ структур клетки достигается благодаря равномерному распределению клеточного материала на стекле, хорошо визуализирующимся деталям ядра и цитоплазмы, чистому фону, значительному снижению числа элементов воспаления, эритроцитов, артефактов. Наряду с этим надо отметить, что метод жидкостной цитологии в сравнении с рутинным имеет свои морфологические особенности, которые необходимо учитывать: вид и снижение фона, структурные изменения, такие как преимущественно разрозненное расположение клеток, фрагментация крупных клеточных скоплений, нарушение эпителиально-стромального соотношения, уменьшение размера клеток, отдельные клетки приобретают более округлую или вытянутую форму, разреженный хроматин. Описание особенностей морфологии жидкостных цитологических препаратов при патологических процессах различных локализаций позволяет накопить необходимый опыт и в целом улучшить качество постановки морфологического диагноза.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
В. В. Делекторская. Нейроэндокринные опухоли: эпидемиология, номенклатура, лабораторная и морфологическая диагностика. ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Нейроэндокринные опухоли (НЭО) были впервые описаны в конце XIX века. Данная группа новообразований обладает общей способностью синтезировать биологически активные вещества и включает широкий спектр относительно редких опухолей, правильная диагностика, клинико-морфологическая характеристика и оценка особенностей «биологического поведения» которых являются необыкновенно сложной и актуальной задачей.
Эпидемиология. НЭО могут возникать в любых органах, но наиболее часто локализованы в различных отделах пищеварительной системы, легких и бронхах. Частота возникновения данных опухолей увеличилась приблизительно в 5 раз за последние 30 лет, что частично может быть связано с улучшением и расширением возможностей диагностики. С помощью регрессионного анализа показано, что частота встречаемости НЭО в 2013 г. составит 8 случаев на 100 000 населения.
Номенклатура. Различия в терминологии часто вызывают трудности в оценке этих опухолей. В настоящее время подразумевается, что все НЭО обладают злокачественным потенциалом и их нельзя рассматривать как доброкачественные новообразования. В соответствии с классификацией ВОЗ
2010 г выделяют 2 основных типа нейроэндокринных новообразований: нейроэндокринная опухоль (высокодифферен-цированная) и нейроэндокринная карцинома (низкодиффе-ренцированная, НЭК). Различная степень злокачественности этих опухолей (Grade, G1, G2, G3) основана на оценке гистологии и определении пролиферирующей фракции (уровня митотической активности и индекса Ki67).
Лабораторная и морфологическая диагностика. Углу -бленное изучение НЭО позволило выделить маркеры нейро-эндокринной дифференцировки клеток, которые представляют следующие классы молекул: ассоциированые с секреторными гранулами, ассоциированные с синаптическими пузырьками, промежуточные филаменты, адгезивные молекулы, цитозольные. Два основных маркера хромогранин А и синаптофизин рекомендованы для обязательного использования в процессе морфологической диагностики НЭО. Важно отметить, что хромогранин А, который продуцируется и секретируется нейроэндокринными клетками, может определяться в сыворотке и плазме крови при биохимическом исследовании, а также в ткани опухоли при иммуногистохи-мическом (ИГХ) анализе. Уровни хромогранина А в плазме крови используются для мониторинга ответа на терапию. Морфологическая верификация нейроэндокринного характера опухоли принципиально важна для выбора тактики лечения пациента. НЭО различной локализации классифицируются в соответствии со статусом дифференцировки и типом
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
опухолевых клеток. Иммуногистохимическое определение индекса пролиферации и соответственно Grade помогает химиотерапевтам классифицировать нефункционирующие НЭО на 3 различные группы в соответствии с мишенями для терапии. Гормоны, определяющие специфический тип секреции клеток опухоли, в отличие от хромогранина А не относятся к факторам, которые нужно выявлять обязательно при ИГХ-исследовании НЭО. Перспективным направлением исследования НЭО является определение ИГХ маркеров лекарственной чувствительности, к которым относятся рецепторы соматостатина, молекулы сигнального пути mTOR, MGMT и ряд других факторов.
НЭО - сложные и относительно редкие опухоли, исследование которых с использованием современных биохимических и иммуногистохимических методов является основой не только для проведения точной диагностики и дифференциальной диагностики, но и для получения оптимальных результатов лечения данной патологии, а также для внедрения в практику научных разработок и новых методов терапии.
Н. С. Сергеева, Н. В. Маршутина, И. И. Алентов, М. П. Солохина. Серологические маркеры СА 125 и НЕ4 в мониторинге больных распространенным раком яичников.
ФГБУ МНИОИ им. П. А. Герцена Минздравсоцразвития РФ, Москва
Цель - сравнить динамику изменения СА125 и НЕ4 в мониторинге больных раком яичников (РЯ) на этапах лечения и наблюдения.
В сыворотке крови 18 больных РЯ, из которых 15 имели серозный, 2 - эндометриоидный и 1 - недифференцированный рак, оценили концентрацию НЕ4 на анализаторе Architect (AbbottDiagnostics, США) с использованием наборов «ARCHITECTHE4 assay» (AbbottDiagnostics, США), уровень CA125 - на анализаторе AxSym (AbbottDiagnostics, США) c использованием наборов «СА 125-AxSym» (AbbottDiagnostics, США) в динамике лечения и наблюдения.
Для всех точек измерения обоих маркеров, полученных при динамическом наблюдении каждой пациентки, было высчитано отношение абсолютного значения маркера к значению его дискриминационного уровня. В качестве дискриминационного уровня СА125 было выбрано значение 35 ед/мл, для НЕ4 - 70 пмоль/л у пациенток в пременопаузе и 140 пмоль/л у пациенток в постменопаузе. В большинстве случаев изменения уровней обоих маркеров коррелировали с ответом на лечение и клиническим течением болезни. При этом у 12 пациенток динамика изменений СА 125 как в процессе лечения, так и в процессе развития рецидивов оказалась более выраженной, чем НЕ4, у двух больных НЕ4 имел преимущества по сравнению с СА 125 и у 4-х -динамика обоих маркеров оказалась сходной.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ряде случаев HE4 может дать дополнительную информацию о динамике опухолевого процесса при РЯ.
Е. С. Герштейн, В. В. Пророков, Е. А. Короткова, В. В. Делекторская, Д. А. Головков, Н. Е. Кушлинский. Прогностическое значение опухольассоциированных протеиназ у больных раком толстой кишки. ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Разработка новых подходов к лечению рака толстой кишки (РТК) - важная проблема онкологии, привлекающая пристальное внимание клиницистов, поскольку, несмотря на успехи, достигнутые в диагностике и совершенствовании хирургических методов лечения, смертность от этого заболевания остается довольно высокой. Многие исследователи связывают дальнейший прогресс в повышении эффективности лечения РТК не только с рациональным использованием комбинированных и комплексных методов лечения, но и с разработкой принципиально новых патогенетических методов терапии, основанных на современных достижениях в изучении биохимии и молекулярной биологии опухолей.
Известно, что одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеиназами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоан-гиогенеза. В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеиназ, к важнейшим из которых следует отнести семейство матриксных металлопротеиназ или матриксинов, названных так за свою способность специфически гидроли-зовать все основные белки ВКМ, а также активирующий их протеолитический каскад активации плазминогена с образованием плазмина. Важную роль в регуляции инвазии и ме-тастазирования играют также природные ингибиторы этих протеиназ: тканевые ингибиторы ММП (ТИМП) и ингибиторы активаторов плазминогена - PAI-1 и PAI-2.
Цель исследования - проанализировать взаимосвязь содержания ММП-2, 7, 9, ТИМП-1, 2, а также uPA, tPA и PAI-1 с основными клинико-морфологическими особенностями РТК, а также прогнозом выживаемости пациентов и на основании полученных результатов оценить возможное клиническое значение определения данных маркеров при РТК.
В исследование вошли 2 группы пациентов. 1-я группа -67 больных РТК (38 мужчин и 29 женщин) в возрасте от 38 до 78 лет (медиана - 62 года), лечившихся в ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в 2000 г. и прослеженных в течение 6-134 мес (медиана - 59 мес) после операции; у этих пациентов определяли концентрацию uPA, PAI-1 и tPA в цитозолях тканей с помощью наборов реактивов для иммунофермент-ного анализа, разработанных в Католическом Университете г. Наймеген (Нидерланды). 2-я группа - 9 больных РТК (50 мужчин и 49 женщин) в возрасте от 37 до 80 лет (медиана -61 год), оперированных в отделении проктологии ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в 2005-2008 гг., у которых в экстрактах опухолей и участков гистологически не измененной слизистой толстой кишки, а также в плазме крови, полученной до начала лечения и через 5-27 дней после операции, определяли содержание ММП-2, 7, 9, ТИМП-1 и ТИМП-2 стандартными наборами для прямого иммуноферментного анализа серии Quantikine® (R&D Systems, США). При сравнении и анализе взаимосвязи показателей использовали непараметрические критерии: парный тест Вилкоксона, тест Манна-Уитни и тест корреляции рангов Спирмена (R). Выживаемость больных оценивали методом Каплана-Мейера (при сравнении кривых использовали F-тест Кокса), а также использовали регрессионную многофакторную модель Кокса. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica (версия 8.0).
Содержание uPA, tPA и PAI-1 в опухолях и окружающей неизмененной слизистой толстой кишки не зависело от ключевых клинико-морфологических особенностей РТК, что не исключало их потенциальной роли в качестве независимых факторов прогноза выживаемости больных. Для проверки этой гипотезы были проанализированы результаты более чем 10-летнего наблюдения за обследованными пациентами с учетом концентрации изучаемых белков в опухоли. В качестве пороговых значений рассматривали по два уровня для каждого маркера: показатель медианы и показатель верхнего квартиля концентрации в опухоли. В целом по группе достоверного влияния на выживаемость пациентов ни для одного из исследуемых маркеров не обнаружено. В прослеженной группе было всего 2 пациента с I стадией заболевания и 4 - со II, все они живы в течение всего периода наблюдения. Достоверное влияние на выживаемость больных РТК с III стадией оказывал только уровень PAI-1 в опухоли: при содержании этого маркера, равном или выше верхнего квартиля (3,17 нг/мг белка), 10-летняя выживаемость пациентов была более чем вдвое меньше, чем у пациентов с меньшим уровнем PAI-I. При этом, если во всех остальных подгруппах медиана выживаемости либо не была достигнута за весь период наблюдения, либо превышала 100 мес, то в подгруппе
больных с III стадией и уровнем PAI-1 > 3,17 нг/мг белка, она составила всего 63 мес. Выживаемость больных РТК с IV стадией достоверно не зависела от уровней экспрессии изученных компонентов системы активации плазминогена в опухоли. Дополнительно была проанализирована выживаемость больных с использованием в качестве пороговых значений уровней маркеров, соответствующих верхней границе нормы (95% показателей неизмененной слизистой). Достоверных различий в зависимости от уровней uPA и tPA и в этом случае выявлено не было, а для PAI-1 выживаемость больных с высоким (более 4,0 нг/мг белка) и низким уровнем маркера в опухоли различалась еще больше, чем при пороговом значении 3,17 нг/мг белка.
Анализ результатов 5-летнего наблюдения показал, что высокие уровни ММП-7 (более 4,0 нг/мл) и ТИМП-1 (более 347 нг/мл) в плазме крови являются факторами неблагоприятного прогноза РТК в общей группе пациентов. Далее мы проанализировали, каким образом концентрация ММП и ТИМП в плазме крови и опухоли влияет на выживаемость в зависимости от степени распространенности опухолевого процесса. Для этого все больные были разделены на 3 группы в зависимости от наличия лимфогенных и гематогенных метастазов: I группа - без лимфогенных и гематогенных метастазов T1-4N0M0 (41); II группа - только с лимфогенными метастазами T1-4N+M0 (23); III группа - с диссеминированным процессом T1-4N0 + M+ (23). В группе I достоверные различия выявлены только для ММП-7 плазмы крови: выживаемость больных с низким плазматическим содержанием ММП -7 составила 100%, а пациентов с высоким уровнем маркера -всего 60% (р = 0,0003). В группе II ни один из маркеров не влиял на выживаемость пациентов. В то же время выживаемость больных с диссеминированным процессом зависела не только от уровня ММП-7 в плазме крови, но и от содержания этой протеиназы в опухоли. В группе с низкой концентрацией ММП-7 в плазме 3-летняя выживаемость составила 65%, а в группе с высокой концентрацией - только 8% (р = 0,007; 5-летнюю выживаемость в этой группе проследить не удалось). В подгруппе с низким содержанием ММП-7 в опухоли (менее 7,8 нг/мг белка) медиана выживаемости составила 15,6 мес, а при более высоком уровне ММП-7 - 9,2 мес (р = 0,03). У больных диссеминированным РТК проявилось и прогностическое значение содержания ТИМП-1 в плазме крови: при низком уровне маркера медиана выживаемости не достигнута, а при высоком она составила всего 9 мес, выживаемость - 57 и 11% соответственно (р = 0,01). При многофакторном анализе, включавшем стадию заболевания, локализацию, гистологическое строение (степень дифферен-цировки), глубину инвазии опухоли, наличие лимфогенных или гематогенных метастазов, а также все исследованные биохимические показатели, уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови оказались независимыми факторами прогноза РТК (р = 0,02 и 0,006 соответственно) наряду с показателем гематогенного метастазирования М+.
При исследовании компонентов системы активации плазминогена показано, что значимым, но не независимым фактором неблагоприятного прогноза общей 5- и 10-летней выживаемости больных РТК является высокое содержание PAI-1 в опухоли, роль которого достоверно выражена преимущественно у пациентов III стадии. Высокие предоперационные уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза РТК, а при однофакторном анализе неблагоприятное прогностическое значение имеет и высокий уровень ММП-7 в опухоли больных с диссеминированным процессом.
А. Н. Понукалин, В. М. Попков, Н. Б. Захарова, В. Ю. Михайлов. Перспективы включения молекулярных маркеров в стандарты диагностики и стадирования рака мочевого пузыря. НИИ фундаментальной и клинической уронефроло-гии ГБОУ ВПО Саратовского ГМУ им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвития РФ
Как известно, стадия рака мочевого пузыря (РМП) определяет вид, характер лечения и прогноз заболевания для пациента. Однако частота ошибок, при определении стадии РМП в настоящее время достигает 73%. Считается, что диагностическое значение биомаркеров при РМП недостаточно изучено. Окончательно не определен основной перечень серологических и мочевых биомаркеров в ранней диагностике РМП и при выборе оптимальной тактики хирургического и патогенетического лечения заболевания.
Цель исследования - определение перечня молекулярных маркеров ранней диагностики РМП и при выборе оптимальной тактики хирургического и патогенетического лечения заболевания. Проведено обследование 121 больного, с диагнозом рака мочевого пузыря - 76 человек, группа контроля
- 25 пациентов. Группу сравнения составили 20 пациентов с циститом и мочекаменной болезнью. Из 76 пациентов с раком мочевого пузыря в группы с немышечно-инвазивным РМП (НМИРМП) (Та - Т1 N0 МО) включены 16 человек, мышечно-инвазивным РМП (МИРМП) (Т2а N0 М0; Т3а N0 М0) - 39 человек и раком, прорастающим и выходящим за пределы стенки мочевого пузыря (Т3б N0 МО - 14; Т3б N1M0-6; Т4 N1M1-1) - 21 человек. При гистологическом исследовании у всех 76 больных диагностирован переход-ноклеточный рак. Исследование содержания онкомаркеров, факторов апоптоза и ангиогенеза проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. При определении онкомаркеров в сыворотке крови - ТРА и TPS, в моче - UBC использовали наборы фирмы IDL Biotech AB (Швеция). Содержание факторов роста (фактора роста эндотелия сосудов
- ФРЭС), апоптоза (FAS-рецептор и FAS-L) определяли с помощью наборов реактивов фирм Biosource, Europe S. A. При определении содержания онкомаркеров UBC, ТРА и TPS в моче и в сыворотке крови отмечено значимое увеличение уровня UBC у больных поверхностным раком. Нарастание содержания TPS в сыворотке крови пациентов групп сравнения значительно меньше, чем у пациентов с раком мочевого пузыря. Изменение содержания факторов апоптоза - Fas и FasL в плазменной взвеси мононуклеаров у больных раком мочевого пузыря происходило по мере нарастания глубины инвазии и снижения степени дифференцировки ткани опухоли. По мере развития глубины инвазии в сыворотке крови практически у всех больных раком мочевого пузыря нарастало содержание ФРЭС. Наиболее высокие значения ФРЭС отмечены у больных экстраорганным и низкодифференци-рованным РМП. Установлено, что в диагностике НМИРМП целесообразно использовать определение содержания UBC II в моче, TPS и ТРА, для оценки глубины инвазии, прогноза развития рецидивов, продолженного роста опухоли проводят определение TPS и ТРА, ФРЭС, FAS и FASL. Применение предложенного перечня молекулярных маркеров позволяет перейти к качественно новому уровню диагностики и лечения рака мочевого пузыря.
Г. В. Коршунов, Н. Н. Павленко, Д. М. Пучиньян, Е. В. Гладкова, С. Г. Шахмартова. Цитокины в сыворот ке крови больных с опухолями костей. ФГБУ «Саратовский НИИГО» Минздравсоцразвития РФ
Цель - оценить уровни фактора некроза опухоли-а: (ФНО-а), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и неоптерина при доброкачественных и злокачественных опухолях костной ткани.
257 больных с опухолями злокачественного характера (метастатическое поражение костей, солитарная миелома) и доброкачественного (гигантоклеточная опухоль, костная киста, фиброзная дисплазия, хондрома, костно-хрящевой экзостоз) костной системы определяли в сыворотке крови содержание ФНО-а, ИЛ-6 и неоптерина в период поступления их в стационар ИФА-методом на ридере «Anthos 2020» (Австрия) с помощью наборов фирмы Human (Германия), «Bender Med Systems» (Австрия). При статистической обработке использовали как параметрические, так и непараметрические критерии.
Содержание ФНО-а в сыворотке крови больных с доброкачественными опухолями составило 22,3±2,1, при злокачественных опухолевых процессах - 43,75±2,4 пг/мл (р < 0,001). Диагностическая чувствительность теста (ДЧ) -87,5%, диагностическая специфичность (ДС) - 96,3%, диагностическая значимость (ДЗ) - 94,3%.
Содержание ИЛ-6 в сыворотке крови больных с доброкачественными опухолями составило 23,4±2,1, при злокачественных опухолевых процессах - 12,2±2,4 Ед/мл (р < 0,001). ДЧ теста - 85,7%, ДС - 75,0%, ДЗ - 77,1%.
Содержание неоптерина в сыворотке крови больных с доброкачественными опухолями составило 5,3±2,1, при злокачественных опухолевых процессах - 13,75±2,4 нмоль/л (р < 0,001). ДЧ теста - 91,3%, ДС - 72,9%, ДЗ - 79,0%.
Все три теста способны к дифференцированию доброкачественных и злокачественных опухолей костной ткани, но по общей диагностической точности и специфичности тест ФНО-а превосходит определения ИЛ-6 и неоптерина.
А. А. Ващенко, В. Г. Зайцев, О. В. Островский, Р. А. Хвастунов. Определение содержания циркулирующей ДНК в сыворотке крови как основа для разработки теста мониторинга течения онкологических заболеваний. Волгоградский государственный медицинский университет
Цель исследования - оценка возможности использования содержания внеклеточной циркулирующей ДНК
(цДНК) в сыворотке крови для мониторинга течения онкологических заболеваний. Исследовали образцы сывороток, полученных от здоровых добровольцев и пациентов, страдающих различными формами онкологических заболеваний. Выделение цДНК проводилось с помощью набора ДНК-сорб АМ (Интерлабсервис, Россия) с последующей оценкой содержания цДНК по поглощению в УФ-области спектра. В образцах сывороток 25 здоровых добровольцев содержание цДНК составило 0,017 мг/мл (медиана; 95% доверительный интервал: 0,013000,018). В сыворотке крови больных онкологическими заболеваниями (34 пациента) до проведения хирургического вмешательства содержание цДНК составило 0,028 мг/мл (медиана; 95% доверительный интервал: 0,019-0,041). Были определены достоверные различия по критерию Манна-Уитни между содержанием цДНК в сыворотке больных онкологическими заболеваниями и здоровых добровольцев (р < 0,001). У 19 пациентов были повторно взяты образцы сыворотки после проведения операции. Содержание цДНК составило 0,013 мг/мл (медиана; 95% доверительный интервал: 0,007-0,021). По критерию Вилкоксона обнаружены статистически значимые различия по содержанию цДНК у больных до и после оперативного вмешательства (р < 0,001).
Таким образом, способ оценки содержания цДНК в сыворотке крови может быть использован для создания лабораторного теста мониторинга течения онкологического процесса.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ПРОБЛЕМЕ
Р. Р. Ажигова, В. Д. Ермилова, О. Д. Галдава, Л. Т. Ля-кина, О. Т. Шарашенидзе, И. Б. Манухин, К. П. Лактионов, О. М. Кузнецова, Т. Т. Березов. Рецепторы эпидермального фактора роста в раке эндометрия и яичников. ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Известно, что чувствительность к эндокринным стимулам свойственна, как правило, опухолям с достаточно высокой степенью дифференцировки, сохраняющим определенную зависимость от регуляторных воздействий со стороны организма или от внешних стимулов. Между тем одной из фундаментальных особенностей высокозлокачественных опухолей является способность к неограниченному автономному росту. В основе этого свойства лежат эффекты факторов роста - белков или полипептидов, продуцируемых опухолевыми клетками или другими компонентами опухолевой ткани (фибробластами, инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, эндотелиоцитами) и взаимодействующих со специфическими рецепторами на поверхности клеток-продуцентов или соседних клеток, стимулируя в результате последующей сложной цепи событий клеточное деление. Наиболее изученным и клинически реализованным является механизм действия сигнальной системы рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР) и родственных ему рецепторов семейства c-erbB или HER (human epidermal growth factor receptor). В это семейство входят четыре белка - собственно РЭФР (ErbB-1, HER1), а также ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4) - сходные по структуре трансмембранные рецепторы, внутриклеточная часть которых обладает тирозинкиназной активностью. Известно довольно много лигандов рецепторов семейства c-erbB, наиболее известными из них являются эпи-дермальный и a-трансформирующий факторы роста, амфи-регулин и cripto, взаимодействующие только с РЭФР, а также херегулины (неурегулины), взаимодействующие с ErbB-3 и ErbB-4 [35]. Ни одного лиганда, взаимодействующего с рецептором ErbB-2 (HER2/neu), до настоящего времени не обнаружено. Пристальный интерес к РЭФР в последнее время связан также с тем, что на стадию клинических испытаний и прак-
тического использования вышли препараты, специфически воздействующие на РЭФР - моноклональные антитела к рецептору (Эрбитукс) и ингибиторы его внутренней тирозинки-назы (Iressa®, Tarceva™), реализующей первый этап передачи митогенного сигнала. Эти препараты уже рекомендованы для лечения немелкоклеточного рака легкого, опухолей головы и шеи, колоректального рака и рака поджелудочной железы.
Цель - сравнительное изучение частоты выявления и содержания РЭФР в злокачественных и доброкачественных опухолях эндометрия и яичников, оценка их взаимосвязи с основными клинико-морфологическими характеристиками новообразований и прогнозом.
В исследование было включено 125 больных раком эндометрия, 44 больных раком яичников с различными стадиями заболевания и 10 пациенток с доброкачественными новообразованиями яичников (в возрасте от 27 до 75 лет). У всех больных диагноз рака эндометрия, рака (РЯ) и доброкачественные новообразования яичников подтверждены данными гистологического исследования опухоли. Концентрацию РЭФР определяли в гомогенатах опухолей. Кусочки тканей опухоли массой 300-500 мг подвергали гомогенизации либо хранили в течение 1-30 дней при температуре -70oC. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков жира и некроза, взвешивали и растирали в жидком азоте. Полученный порошок переносили в центрифужные пробирки, предварительно помещенные в ледяную баню, и добавляли TED-буфер (10 мМ трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотрейтол; рН 7,4), содержащий 10% глицерина (по объему), из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Тщательно перемешивали гомогенат и центрифугировали 30 мин 105000xg при 4oC (центрифуга Optima ТМ TLC, «Beckman», США). Осадок, полученный после центрифугирования, регомогенизировали в 1 мл буфера А (0,25 мМ K,Na-PBS, 70 мг/л бацитрацина, 1 г/л бычьего сывороточного альбумина) и центрифугировали еще раз в течение 10 мин при 2000xg, 4oC на той же центрифуге. Надосадочную фракцию, представляющую собой грубую мембранную суспензию, замораживали в жидком азоте, хранили при температуре -70oC, а затем использовали для определения РЭФР Содержание
РЭФР в мембранной фракции опухолей и нормальных тканей эндометрия, яичников проводили модифицированным радио-лигандным методом T. J. Benraad и J. A. Foekens. В качестве меченого лиганда использовали мышиный ЭФР (receptor grade; фирма «Sigma», США), йодированный с помощью Na[125I] в присутствии хлорамина Т (уд. радиоактивность 45-12G Ки/ммоль). Суспензию мембран (G,1 мл; концентрация белка G,2-1 мг/мл) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (2G-25oC) с 3,5 нМ [125Г]-ЭФР в присутствии и в отсутствие 200-кратного избытка немеченого ЭФР («Sigma», США), периодически встряхивая на миксере. По окончании инкубации помещали пробирки в ледяную баню и осаждали лиганд-рецепторный комплекс охлажденной суспензией ги-дроксилапатита (Sigma; DNA-grade) в PBS-буфере (2:1 по объему). После дополнительной инкубации при G-4oC в течение 3G мин добавляли к пробам по G,5 мл PBS и центрифугировали 3-5 мин при 2GGGxg, 4oC (центрифуга РС-б), надосадочную жидкость удаляли, и затем трижды промывали осадок гидрок-силапатита 1 мл PBS. Просчитывали радиоактивность осадка на гамма-счетчике (фирма «LKB», Швеция) и вычисляли количество специфически связанного [125Ц-ЭФР по разнице между общим (в отсутствие конкурента) и неспецифическим (в присутствии избытка немеченого лиганда) связыванием. Количество РЭФР выражали в фмоль/мг мембранного белка. Пробы считали рецепторположительными при содержании РЭФР не менее 5 фмоль/мг белка. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 17.G for Windows. Достоверность различий частот признаков в изучаемых группах определяли с использованием критерия %2. Различия между показателями считались статистически значимыми при p < G,G5. Построение кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера. Проведен однофакторный (log-rank тест) и многофакторный (по Сох) анализ полученных данных. В опухолях эндометрия также определяли концентрацию РЭ и РП декстран-угольным методом по связывающей способности цитоплазматических белков-рецепторов по отношению к [3H]-ORG-2G5S и [3H^2 в цитозольной фракции опухолей эндометрия. Образцы опухоли эндометрия массой от 2GG до 5GG мг измельчали в фарфоровой ступке при охлаждении жидким азотом. Смешивали с буфером. Состав буфера: 1G ммоль/л трис-HCl («Е. Merck», Германия), 1,5 ммоль/л ЭДТА («Sigma», США), 1 ммоль/л дитиотрейтола («Koch-Light Laboratories», Великобритания), G,G3% азида натрия («Е. Merck», Германия), рН 7,4 при 2G0С, 1G% глицерин марки «осч» (по объему). После размораживания смесь центрифугировали 1G мин при 25GG-3GGGg. Из надосадочной жидкости получали цитозоль, центрифугируя пробы при 1G5GGGg в течение 1 ч (ротор АН-650, центрифуга модели «Sorvall, FRC-1» фирма «Du Pont Instruments», Великобритания). Для работы использовали цитозоль с концентрацией общего белка около 1,G мг/мл. Инкубацию проб цитозо-ля с [3H] стероидами проводили в течение 12-14 ч при G-4oC. Пробы 1GG мкл цитозоля инкубировали с радиоактивными лигандами [3H]-ORG-2G5S или с [3ЩЭ2. Чистота используемых лигандов была не менее 9S%. Специфическое связывание цитоплазматических белков-рецепторов со стероидами определяли при насыщающей концентрации радиоактивного лиганда 1G нМ с учетом неспецифического связывания в присутствии 1GG-кратного избытка ORG-2G5S («Amersham», Великобритания) - для прогестерона и диэтилстильбестрола («Calbiochem», США) - для эстрогенов. Для разделения связанного стероида от свободного пробы обрабатывали углем, активированным декстраном T7G. В надосадочной жидкости определяли радиоактивность на спектрометре модели MARK 3S (фирма «Тшсог Europa», Голландия). Эффективность счета по тритию составляла около 4G%.
РЭФР выявлены в 4G% опухолей, РЭ - в 87,2%, РП - в SG,S% у больных раком эндометрия. Не отмечено связи между частотой обнаружения РЭФР+ и РЭ+, РП+. Наиболее часто выявляли РЭФР+РЭ+РП+ опухоли (48,8%) и реже - РЭФР+РЭ+РП+ (3G,4%).
Значения РЭФР+ колебались в широких пределах от 10 до 310 фмоль/мг белка, а медиана составила 93 фмоль/мг белка; РЭ - от 11 до 684 фмоль/мг белка (медиана 66 фмоль/мг белка); РП - от 21 до 1880 фмоль/мг белка (медиана 253 фмоль/мг белка). Отмечена тенденция к снижению частоты выявления и уровней РЭФР у больных раком эндометрия в возрасте старше 70 лет. Содержание РЭФР было обратно пропорционально индексу массы тела (ИМТ) больных раком эндометрия независимо от других клинических признаков. Частота выявления и уровни РЭФР более медианы (93 фмоль/мг белка) в опухоли были достоверно ниже у больных с ожирением. При этом частота выявления РЭФР в опухолях эндометрия была в 1,8 раза ниже у пациенток с сахарным диабетом II типа, чем у пациенток без такового. РЭ+ и РП+ в опухолях больных раком эндометрия не были связаны с ИМТ пациенток. Частота выявления РЭФР+ опухолей была достоверно ниже при Ш-1У стадиях (65,4%) по сравнению с 1-11 стадиями (90,9%). При этом частота выявления и уровни РЭ+ и РП+ в опухолях эндометрия среди больных с Ш-ГУ стадиями достоверно уменьшались (р = 0,001). Отмечено также достоверное увеличение числа РЭФР-РЭ-РП- опухолей при Ш-ГУ стадиях заболевания (26,9%) по сравнению с 1-11 (3,0%). Напротив, число пациенток с РЭФР+РЭ+РП+-опухолями снижалось с увеличением стадии опухолевого процесса: с 33,3% при 1-11 стадиях до 19,2% при Ш-ГУ стадиях (р = 0,001). Частота выявления РЭФР в первичной опухоли больных раком эндометрия с высокой степенью ее дифференци-ровки составила 64,7%, с умеренной - 25,0%, с низкой - 52,2%, различие между 1-й и 2-й группой достоверно (р = 0,001). При этом уровни РЭФР в опухолях эндометрия более медианы (93 фмоль/мг белка) выявляли при высокодиффренцированных (50%), реже, при низкодифференцированных (34,5%) и крайне редко при умеренно дифференцированных опухолях (4,4%). Выявлено достоверное снижение числа РЭФР+РЭ+РП+, опухолей при снижении степени дифференцировки рака эндометрия: при высокой степени дифференцировки 55,8%, при умеренной 25,0%, при низкой 17,4% (р = 0,001). РЭФР выявляли с одинаковой частотой в эндометриоидной аденокарциноме и железисто-плоскоклеточном раке эндометрия - 44,0 и 33,3% соответственно, при этом уровни РЭФР также не были связаны с гистологическим вариантом строения опухоли (медианы 98 и 88 фмоль/мг белка соответственно). В то же время частота выявления РЭ и РП была достоверно ниже при железисто-плоскоклеточном раке (75,8 и 69,7% соответственно), чем при эндометриоидной аденокарциноме (90,1 и 87,9% соответственно). Однако уровни РЭ и РП в первичных опухолях этих групп пациенток достоверно не различались. В эндометрио-идных аденокарциномах чаще выявляли три вида рецепторов РЭФР+РЭ+РП+ (42,0%), чем при железисто-плоскоклеточном раке (3,5%) (р = 0,003). Установлена корреляционная зависимость между глубиной инвазии опухоли и содержанием РЭФР в первичной опухоли больных раком эндометрия (г = 0,37; р = 0,009). Частота выявления РЭФР+-опухолей была наибольшей у больных раком эндометрия без инвазии (70%) и наименьшей - при глубине инвазии опухоли в стенку матки более 2,0 см (0%) (р = 0,03). Однако отмечен сложный характер взаимосвязи значений РЭФР в опухоли с глубиной ее инвазии в стенку матки у больных раком эндометрия. Так, группа больных без опухолевой инвазии характеризовалась высокой частотой выявления РЭФР+-опухолей (70,0%) и низкими уровнями рецептора (26 фмоль/мг белка). Почти у половины больных (45,8%) с глубиной инвазии 1-1,4 см выявлены наиболее высокие значения РЭФР (240 фмоль/мг белка). В опухоли больных с глубиной инвазии в миометрий более 2,0 см РЭФР не обнаружены. Глубина инвазии рака эндометрия в стенку матки у 11 пациенток с отрицательным рецепторным статусом опухоли РЭФР-РЭ-РП- была достоверно больше (1,4±0,3 см), чем у 38 больных с положительным РЭФР+РЭ+РП+ (0,7±0,1 см) (р = 0,0001). Не обнаружено корреляционной зависимости между РЭФР, РЭ, РП и размером первичной опухоли эндометрия. Кроме того, отмечена тенденция к увеличению максимально-
го размера опухоли эндометрия при отрицательном рецептор-ном статусе опухоли РЭФР-РЭ-РП-. 10-летняя выживаемость больных раком эндометрия в общей группе после проведенного лечения равнялась 53,2±4,7% (медиана 139 мес). Стало быть, половина обследованных больных прожила более 11 лет после проведенной терапии. Отдаленные результаты лечения больных 1а, 1Ь и II стадий статистически не различались и 10-летняя выживаемость в этих группах была выше 70%. В то же время 3-летняя выживаемость больных с III стадией рака эндометрия равнялась 0% (медиана 21,5 мес), а 1-летняя выживаемость больных с IV стадией равнялась 27% (медиана 12,0 мес). Проведенный многофакторный анализ отдаленных результатов лечения больных раком эндометрия показал, что независимыми факторами прогноза были стадия заболевания (р = 0,00001), возраст (р = 0,002) и наличие сахарного диабета II типа (р = 0,01). Самостоятельной прогностической ценностью при раке эндометрия РЭФР в первичной опухоли не обладал. Так, 10-летняя выживаемость у больных раком эндометрия с РЭФР+ опухолями составила 55,6±7,1%, тогда как с РЭФР- - 51,3±6,4%, различия не достоверны. Отмечено, что общая выживаемость больных раком эндометрия в прогностически благоприятной группе пациенток в возрасте до 60 лет достоверно различалась при РЭФР- (48,1±8,3%) и РЭФР+ (77,3±8,2%) опухолях (р = 0,007). В то же время выживаемость больных раком эндометрия достоверно различалась в группах с РЭ+ и РЭ- опухолями (р = 0,009). Положительные уровни РЭ были прогностически благоприятным фактором рака эндометрия. РЭФР выявлены в 17 из 44 первичных злокачественных опухолей яичников (38,6%) и не выявлены в 75% доброкачественных новообразований, а в 16 наблюдениях (36,4%, каждой третьей) содержание РЭФР в РЯ превышало выше указанный пороговый уровень группы контроля (13 фмоль/мг белка; р = 0,01). При этом наибольшее содержание РЭФР в опухоли больных РЯ составило 1120 фмоль/мг белка, что многократно превышало пороговое значение РЭФР в доброкачественных новообразованиях яичников. Не установлено связи между содержанием РЭФР в опухоли и концентрацией СА-125 в сыворотке крови больных РЯ. У больных РЯ с односторонним и двусторонним опухолевым поражением яичников частота выявления РЭФР была одинаковой и составила соответственно 40 и 37,9%, а медианы этого маркера также в этих двух группах пациенток не различались (37,5 и 36,5 фмоль/мг белка соответственно). Установлена достоверно большая частота обнаружения РЭФР-опухолей яичников среди больных РЯ с I стадией процесса (71,4%) по сравнению с пациентками с большей распространенностью заболевания. Также необходимо отметить, что если в группе больных с I—II стадиями РЯ частота выявления значений РЭФР более 13 фмоль/мг белка составила 22,2% (2 из 9), то у больных с Ш—^ стадиями она уже равнялась 40% (14 из 35) (р = 0,001). Не обнаружено достоверных различий в содержании РЭФР в РЯ с учетом стадии заболевания. Показатели РЭФР в РЯ не зависели от наличия или отсутствия асцита. РЭФР- опухоли встречались среди высокодифференцированных в 81,8% случаев, в умеренно дифференцированных — в 53,9% и в низко дифференцированных — в 61,1%. Анализ отдаленных результатов лечения больных РЯ с учетом РЭФР в опухоли проводится.
Представленные данные свидетельствуют о том, что РЭФР-РЭ-РП- опухоли у больных раком эндометрия чаще были связаны с такими неблагоприятными клинико-морфологическими признаками заболевании, как большой размер первичной опухоли и глубина инвазии рака эндометрия в стенку матки, низкая степень дифференцировки опухоли и поздние Ш—^ стадии заболевания. В общей группе больных раком эндометрия 10-летняя общая выживаемость больных с РЭФР+ опухолями выше, чем с РЭФР- более чем в 1,6 раза. Наилучшие отдаленные результаты отмечены среди больных раком эндометрия с РЭФР+РЭ+РП+ опухолями, а наихудшие с рецепторным статусом РЭФР-РЭ-РП-. При
многофакторном анализе только такие клинические признаки как стадия заболевания (р = 0,00001), наличие сахарного диабета II типа (р = 0,0006) и возраст пациенток до 60 лет (р = 0,0015) могли служить независимыми факторами прогноза общей выживаемости. Частота выявления и уровни РЭФР были достоверно выше в РЯ, чем в доброкачественных опухолях. Не обнаружено достоверных различий в содержании РЭФР в РЯ с учетом стадии заболевания и наличия асцита.
И. В. Бабкина, Е. Ю. Руссо, И. В. Булычева, И. Н. Кузнецов, Ю. Н. Соловьев, Е. А. Тен, М. Д. Алиев. Растворимая форма молекулы адгезии эндотелия сосудов 1 типа (sVCAM-1) при опухолях костей. ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Саркомы костей до настоящего времени остаются одним из самых трудных в диагностическом и лечебном плане разделов клинической онкологии. Эти заболевания объединяют группу различных морфологических вариантов опухолей, которые встречаются в основном в молодом возрасте, отличаются тяжестью клинического течения, низкой эффективностью лечебных мероприятий, ранним метастазированием и неблагоприятным прогнозом. Известно, что на опухолевый рост в костях оказывают влияние различные факторы и среди них молекулы адгезии эндотелия сосудов (VCAM). VCAM-1 - это молекула адгезии эндотелия сосудов 1 типа - один из членов семейства иммуноглобулинов, который вовлекается в лейко-цитарно-эндотелиальное взаимодействие. VCAM1 является лигандом интегрина VLA-4. Его обнаружили в составе лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов. Взаимодействие VCAM-1/ VLA-4 опосредует прочную адгезию циркулирующих лейкоцитов (кроме нейтрофилов) к эндотелию. VCAM-1 принимает участие в адгезии лейкоцитов вне сосудов, в процессах взаимодействия предшественников лимфоцитов со стромаль-ными клетками костного мозга, а также В-клеток с дендритными клетками фолликулов лимфатических узлов. VCAM-1 обладает относительно селективной лейкоцитарной адгезией, обеспечивая накопление мононуклеарных клеток в процессе смены острой и фазы воспаления хронической. sVCAM-1 -это продукт протеолитического распада VCAM-1 известно, что он содержится как в крови практически здоровых людей, так и у пациентов с различными заболеваниями. Показано, что уровень sVCAM-1 в сыворотке крови повышается при раке молочной железы, матки, раке почек, мочевого пузыря, раке предстательной железы, заболеваниях крови.
Цель исследования - провести сравнительный анализ содержания sVCAM-1 в сыворотке крови практически здоровых людей, больных злокачественными и пограничными опухолями костей с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.
Обследовали 166 больных опухолями костей (112 мужчин и 54 женщины) в возрасте от 14 до 68 лет (средний возраст 30,1±2,0 лет). Злокачественные опухоли выявлены у 152 пациентов [остеосаркома - 68, хондросаркома - 46, саркома Юинга - 26, злокачественная фиброзная гистиоцитома кости (ЗФГ) - 12], пограничные - гигантоклеточная опухоль кости (ГКО) - у 14. У всех больных диагноз установлен впервые и подтвержден данными гистологического исследования опухоли. До проведения настоящего исследования специфическое лечение пациенты не получали. В качестве контроля использованы сыворотки крови 50 практически здоровых людей (28 мужчин и 22 женщины) в возрасте от 13 до 68 лет (средний возраст 28,1±3,1 лет). Концентрацию sVCAM-1 определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием наборов реактивов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).
Значимые уровни sVCAM-1 выявлены во всех образцах сыворотки крови. При новообразованиях костей наиболее часто содержание sVCAM-1 в крови было в пределах от 400 до 500 пг/мл. В сыворотке крови практически здоровых людей все значения sVCAM-1 были ниже 500 пг/мл, а наиболее часто концентрация sVCAM-1 составляла 200-300 пг/мл, что совпадает с результатами других исследователей. В группе больных
новообразованиями костей среднее содержание sVCAM-1 в сыворотке крови составило 444,7±37,4 пг/мл и было почти в 2 раза выше по сравнению с показателями в контрольной группе - 242,5±23,2 пг/мл (р < 0,001). Достоверных различий в содержании sVCAM-1 при злокачественных и пограничных опухолях костей не выявили. Не было различий в уровнях sVCAM-1 в сыворотке крови с учетом возраста ни у больных злокачественными и пограничными опухолями костей, ни у практически здоровых людей. У всех пациентов с ГКО опухоль была локализована в трубчатых костях. При злокачественных новообразованиях у 94 (62%) пациентов опухоль диагностировали в трубчатых костях, у 58 (38%) - в плоских костях. Более высокие значения sVCAM-1 были выявлены при поражении трубчатых костей, по сравнению с плоскими (481,0±63,5 пг/мл, медиана - 477,1 пг/мл и 369,6±37,1 пг/мл, медиана - 374,8 пг/мл соответственно), однако различия были недостоверными (р > 0,05). С помощью статистических методов исследования нами установлено, что у 75% практически здоровых людей значения sVCAM-1 в сыворотке крови были ниже 300 пг/мл, а у 75% больных новообразованиями костей - выше этого уровня, поэтому концентрация sVCAM-1, равная 300 пг/мл, была принята за пороговое значение при дальнейшем анализе полученных результатов. Так, у больных остеосаркомой частота выявления sVCAM-1 выше 300 пг/мл составила 76,5%, саркомой Юинга - 69,3%, ЗФГ - 66,7%, хондросаркомой - 43,5%. При остеосаркоме среднее содержание и медиана sVCAM-1 были достоверно выше (537,3±81,2 пг/мл, медиана - 491,3 пг/мл), чем при хондросаркоме - (344,4±58,1 пг/мл, медиана - 302,6 пг/мл) (р = 0,03). Корреляции между содержанием sVCAM-1 в сыворотке крови и размером опухоли ни у больных злокачественными, ни пограничными новообразованиями костей не выявили. У 48 больных злокачественными опухолями костей, которым проводили адъювантное химиотерапевтическое лечение, проведен анализ содержания sVCAM-1 в сыворотке крови до начала лечения и с учетом степени лечебного патоморфоза опухоли, исследованной после ее хирургического удаления. У 1 пациента лечебный патоморфоз в опухоли отсутствовал, у 23 - диагностировали II степень выраженности лечебного патоморфоза, у 20 - III степень, у 4- IV степень. Достоверно более низкие исходные значения sVCAM-1 в сыворотке крови обнаружены у пациентов, у которых достигнута III и IV степени лечебного патоморфоза (412,6±45,5 пг/мл, медиана - 479,6 пг/мл при III степени и 498,1±53,4 пг/мл, медиана - 498,1 пг/ мл при IV). При отсутствии лечебного патоморфоза в опухоли или его выраженности, соответствующей II степени, значения показателя sVCAM-1 в сыворотке крови были выше и составили в среднем 527,3±60,9 пг/мл (медиана 538,5 пг/мл).
У пациентов с новообразованиями костей среднее содержание sVCAM-1 в сыворотке крови было достоверно выше, чем у практически здоровых людей. Не выявлено различий в содержании sVCAM-1 при пограничных и злокачественных опухолях костей. Достоверных различий в содержании sVCAM-1 в сыворотке крови больных с учетом возраста и типа пораженной кости не выявлено, взаимосвязи между размером опухоли и уровнем sVCAM-1 также не обнаружено. У пациентов с положительным эффектом от химиотерапевти-ческого лечения, соответствующим III-IV степени лечебного патоморфоза опухоли, исходные уровни sVCAM-1 в сыворотке крови были ниже, чем у пациентов, у которых отметили резистентность к химиотерапии или II степень выраженности лечебного патоморфоза.
Н. Б. Захарова, О. Ю. Никольский, А. Н. Понукалин. Перспективы использования "мочевых" биомаркеров в стандартах обследования больных раком почки. НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ГБОУ ВПО Саратовского ГМУ им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвития РФ
В диагностике стадии рака почки (РП), рецидива заболевания после оперативного лечения может быть использовано лабораторное исследование в сыворотке крови и опухолевой ткани фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor - VEGF). В целом ряде исследований показано,
что концентрацию ряда медиаторов воспалительного процесса и факторов роста можно определять в моче для оценки характера поражения почечной паренхимы. Возможность использования «мочевых» маркеров в диагностических целях при РП практически не рассматривалась. Вместе с тем именно такой неинвазивный метод количественного анализа медиаторов воспаления и ангиогенеза перспективен для разработки новых технологий циторедуктивных нефрэктомий, применения неоадъювантной таргетной терапии, ранней диагностики стадии заболевания Т1а и Т1Ь, рецидивов заболевания.
Цель работы - установить возможность использования мочевых биомаркеров в стандартах обследования больных раком почки. Обследованы пациенты с РП (n = 21, с доброкачественными опухолями почек - 6 пациентов, с РП стадии Т1а и T1b -6, с РП III стадии - 7), проходившие лечение в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В. И. Разумовского Минздравсоцразвития России. Оценку стадии заболевания проводили по результатам комплексного обследования, включающего изучение жалоб и сбор анамнеза, ультразвуковое исследование, пошаговую, спиральную и мультиспиральную компьютерную томографию с реконструкцией изображения, магнитно-резонансную томографию, общий и биохимический анализ крови. Контрольная группа была сформирована из 20 практически здоровых лиц.
Для количественного анализа биомаркеров взятие крови у пациентов исследуемой и контрольной групп проводили натощак, в утренние часы из кубитальной вены с использованием систем для забора крови «Vacuette» с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собирали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи вносили 20 мкл раствора «ProClin 300» («SUPELCO», США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разливали в пробирки с крышками типа «Eppendorf» и хранили до проведения исследования при -25oC.
Концентрацию VEGF и МСР-1 в сыворотке крови и моче обследуемых пациентов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя соответствующие наборы реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).
Показано, что в моче больных РП, не содержащей консерванта «ProClin 300», уже в течение 2 часов при комнатной температуре происходит резкое снижение концентрации исследуемых показателей. Основной причиной значительного падения концентрации определяемых показателей в моче больных РП, очевидно, может быть контаминация ее микроорганизмами, которые в процессе жизнедеятельности секре-тируют большое количество ферментов, способных к инактивации или деструкции исследуемых биомаркеров.
У больных с доброкачественными образованиями почек отмечены низкий уровень VEGF и МСР-1 в сыворотке крови и подъем их содержания в моче в 1,5-2 раза. У пациентов с РП стадии Т 1а и T1b, с размером опухоли до 4 см с сыворотке крови и моче повышение содержания VEGF и МСР-1 было в 5-9 раз. Наиболее высокие цифры биомаркеров в сыворотке крови и моче отмечены у больных РП III стадии.
Наибольшую диагностическую значимость для раннего выявления РП стадий Т1а и T1b имеют одновременное количественное определение в сыворотке крови и моче VEGF и МСР-1. Исследование концентрации биомаркеров в моче позволяет подтвердить РП на стадиях Т1а и T1b. Для определения биомаркеров в моче необходимо использовать консервант с противомикробной активностью, например «ProClin 300».
Д. Н. Кушлинский, Н. В. Левкина, Е. С. Герштейн, В. Д. Ермилова, И. В. Терешкина, К. П. Лактионов, Л. В. Ада-мян. Клиническое значение исследования компонентов VEGF-сигнального пути и матриксных металлопротеи-наз у больных новообразованиями яичников. ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН; ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и пе-ринатологии им. акад. В. И. Кулакова РАМН, Москва
Трудности ранней диагностики и высокий метастатический и инвазивный потенциал рака яичников определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения и прогрессирования этой опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно воздействующих на молекулы, играющие ключевую роль в инвазии, отдаленном метастазировании и образовании асцита. Одним из важнейших факторов, необходимых для роста и распространения опухолей, является неоангиогенез. Центральную роль в его регуляции играет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Биологические эффекты VEGF опосредованы специфическими мембранными рецепторами. В регуляции опухолевого ангиогенеза принимают участие два типа рецепторов VEGF - VEGFR-1/ Flt-1 и VEGFR-2/Flk-1/KDR, биологическая роль которых различна: VEGFR-1 индуцирует протеазную активность в эндотелиальных клетках и стимулирует миграцию в опухолевую ткань макрофагов, a VEGFR-2 вызывает дифференци-ровку, пролиферацию и миграцию клеток эндотелия сосудов. Влияние VEGF на опухолевую прогрессию осуществляется в комплексном взаимодействии с матриксными металлопро-теиназами (ММП) - цинк-зависимыми эндопептидазами, способными специфически гидролизовать основные белки внеклеточного матрикса. ММП-зависимый гидролиз окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного ма-трикса - один из главных молекулярных механизмов инвазии и метастазирования. Использование антиангиогенных препаратов, в том числе, природных и синтетических ингибиторов ММП, считается в настоящее время одним из наиболее перспективных направлений молекулярно-направленной противоопухолевой терапии, а компоненты VEGF-сигнальной системы и различные ММП рассматриваются в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности опухолей.
Цель данного исследования - сравнительная оценка содержания VEGF и его рецепторов 1 и 2 и типа, а также некоторых представителей семейства ММП (ММП-2, 7 и 9) в опухолях больных раком, доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников и анализ взаимосвязи этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями рака яичников.
В исследование вошли 50 больных раком (33 первичных и 17 - после предоперационной терапии), 9 больных пограничными и 22 доброкачественными новообразованиями яичников. Материал для исследования брали во время операции: кусочки тканей (200-500 мг) доставляли на льду в лабораторию и хранили при -70oC до начала обработки. Образцы тканей лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ р-пшцерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Лизаты центрифугировали в течение 30 мин при 20000 об/мин, 4oC. Концентрацию исследуемых белков определяли с помощью стандартных наборов для прямого иммуно-ферментного анализа: «Human VEGF 1ттипоа88ау», «Hyman VEGFR1 Immunoassay», «Human VEGFR2 Immunoassay», «Human/Mouse/Rat ММР-2 (total)», «Human ММР-7 (total)», «Human ММР-9 (total)» (Quantikine®, R&D Systems, США). Данные обрабатывали с помощью программы «Statistica 7.0». При сравнении показателей и анализе их взаимосвязей использовали непараметрические методы: критерии Манна-Уитни и Kruskel-Wallis, тест корреляции рангов Спирмена (R).
Во всех исследованных опухолях яичников обнаружены измеримые количества VEGFR1, а VEGF и VEGFR2 выявлены в 97% образцов первичного рака. VEGF найден во всех пограничных и только в 60% доброкачественных новообразований, а VEGFR2 - во всех доброкачественных и 91% пограничных опухолей яичников. Содержание VEGF высоко достоверно увеличивается при переходе от доброкачественных опухолей к пограничным и злокачественным (р < 0,0001), содержание VEGFR1 в трех типах новообразований практически не различается, а уровень VEGFR2 снижен в ткани рака и
пограничных опухолей по сравнению с доброкачественными опухолями яичников. В опухолях больных раком яичников, оперированных после проведения химиотерапии, содержание VEGF достоверно ниже, а содержание VEGFR2 - выше, чем в опухолях первичных больных, и примерно соответствует показателям доброкачественных опухолей. Содержание VEGFR1 в опухолях первичных и ранее леченных больных не различается. Во всех исследованных опухолях яичников обнаружены измеримые количества ММП-2. ММП-9 выявлена в 94% образцов первичного рака яичников, в 90% доброкачественных и 82% пограничных опухолей, ММП-7 - во всех пограничных опухолях, в 90% доброкачественных и 91% образцов первичного рака. Содержание ММП-2 в ткани первичного рака яичников достоверно снижено по сравнению с доброкачественными опухолями, а содержание ММП-7 и ММП-9 - повышено. В пограничных опухолях уровень ММП-2 такой же, как в ткани рака яичников, а уровень ММП-9, напротив, соответствует показателям доброкачественных новообразований. Уровень ММП-7 в пограничных опухолях выше, чем при других типах новообразований. В опухолях, исследованных после ранее проведенного лечения, содержание ММП-2 достоверно и значительно повышено по сравнению с первичным раком, уровень ММП-7 не меняется, а уровень ММП-9 недостоверно снижен. Таким образом, закономерности, продемонстрированные для ММП-2, противоположны обнаруженным для других ММП и VEGF. Только в доброкачественных новообразованиях яичников выявлена достоверная положительная взаимосвязь между содержанием ММП-7 и ММП-9 (R = 0,47; р = 0,02). В то же время, выявлена высоко достоверная отрицательная взаимосвязь между показателями содержания VEGF и ММП-2 в общей группе больных и у больных первичным раком (R = -0,47; р = 0,00002 и R = -0,40; р = 0,02 соответственно), а содержание VEGFR2 в ткани первичного рака положительно коррелирует с уровнем ММП-2 (R = 0,39; р = 0,03). В общей группе наблюдаются также положительные корреляции между уровнями VEGF и ММП-7, VEGF и ММП-9 (в обоих случаях R = 0,29; р = 0,03), а также между ММП-2 и VEGFR2 (R = 0,43; р = 0,0006). Разнообразие и разнонаправленность взаимосвязей между уровнями экспрессии компонентов VEGF-сигнального пути и отдельных представителей семейства ММП, обнаруженных у больных различными новообразованиями яичников, свидетельствуют о сложной взаиморегуляции этих двух систем и ее изменении при переходе от доброкачественных опухолей к злокачественным. Для того чтобы оценить клиническое значение исследуемых маркеров, мы проанализировали их взаимосвязь с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания. Обнаружено достоверное увеличение уровня VEGFR2 в опухолях больных III стадии по сравнению с I, увеличение содержания ММП-7 при III стадии по сравнению со II. Отмечены достоверные различия в зависимости от гистологического типа рака: повышение уровня VEGF и снижение VEGFR2 и ММП-2 в муцинозных раках по сравнению с серозными, снижение уровня ММП-2 и повышение VEGFR1 эндометриоидных раках по сравнению с серозными. Достоверной взаимосвязи исследованных показателей с размером и степенью дифференцировки первичной опухоли, наличием отдаленных метастазов и/или асцита выявить не удалось.
В ткани рака яичников достоверно повышено по сравнению с доброкачественными опухолями содержание VEGF, а содержание ММП-2, напротив, снижено. Отсутствие четкой взаимосвязи тканевых концентраций исследованных маркеров с основными клинико-морфологическими характеристиками рака яичников не исключает их потенциальной роли в качестве независимых факторов прогноза безрецидивной и общей выживаемости, что может быть доказано при более длительном наблюдении за больными. Высокий уровень VEGF в ткани рака яичников подтверждает перспективность включения антиангиогенных препаратов, в том числе, природных и синтетических ингибиторов ММП в схемы лечения этого тяжелого заболевания.
