CC BY
165УДК 631.421.2:616-002.828:638.252
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА КРИПТОКОККОЗА В РЕСПУБЛИКАНСКОМ ЦЕНТРЕ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ И БОРЬБЕ СО СПИД И ДРУГИМИ ИНФЕКЦИОННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В ГОРОДЕ КАЗАНИ
Шахбазова Е.н. (зав. лаб.)*, жадько Е.н. (врач-бактериолог), котляр Е.Ю. (врач-бактериолог), Эахарова о.с. (врач-бактериолог), килина л.н. (зам. гл. врача), нагимова Ф.и. (зам. гл. врача), галиуллин н.и. (гл. врач)
Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения республики Татарстан, Россия
© Коллектив авторов, 2014
Криптококкоз - «пробуждающийся гигант» среди системных микозов, преимущественно развивающийся у больных СПИД. Клиническая диагностика криптококкоза затруднена из-за почти полного отсутствия характерных симптомов. Данные о частоте этого заболевания в России отсутствуют, в последние годы отмечают рост числа зарегистрированных случаев в Санкт-Петербурге. В 2010 году выявлен первый случай криптококкоза у ВИЧ-инфицированного пациента в республике Татарстан, на конец 2013 года в лаборатории микробиологии ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения республики Татарстан» выделено 13 штаммов Cryptococcus neoformans у пациентов с клиническими признаками менингоэн-цефалита.
Ключевые слова: антимикотики, ВИЧ-инфекция, ВИЧ-инфицированный пациент, криптококкоз внелегочный, флукона-
Контактное лицо: Шахбазова Елена Николаевна, e-mail: lenashakhbazova@yandex.ru
LABORATORY DIAGNOSTICS OF CRYPTOCOCCOSIS IN THE REPUBLICAN CENTER FOR AIDS AND INFECTIOUS DISEASES TREATMENT AND PROPHYLAXIS IN THE KAZAN CITY
shakhbazova E.N. (head of the laboratory), Zhad'co E.N. (physician-bacteriologist), Kotlyar EJ. (physician-bacteriologist), Zakharova o.s. (physician-bacteriologist), Kilina L.N. (deputy of chief physician), №gimova F.I. (deputy of chief physician), Galiullin N.I. (chief physician)
Republican Center for AIDS and Infectious Diseases Treatment and Prophylaxis of Ministry of Health of the Republic Tatarstan, Russia
© Collective of authors, 2014
Cryptococcosis - «the awakening giant» among a systemic mycoses, mainly developing in patients with AIDS. Clinical diagnosis of cryptococcosis is very difficult because of the almost complete absence of characteristic symptoms. Data on the frequency of this disease in Russia are absent, in recent years increased the number of registered cases in St. Petersburg. In 2010 was detected the first case of cryptococcosis in HIV-infected patient in the Republic of Tatarstan. At the end of 2013 in the microbiology laboratory of «Center for AIDS and infectious diseases treatment and prophylaxis» were detected 13 strains of Cryptococcus neoformans from patients with clinical signs of meningoencephalitis.
Key words: antimycotics, extrapulmonary cryptococcosis, fluconazole, HIV-infection, HIV-infected patient
введение
Криптококкоз может протекать как острое, по-дострое или хроническое заболевание. Клинические проявления криптококкоза зависят от характера и выраженности иммунодефицита [1].
Долгое время криптококкоз считали редким заболеванием. В 1970 году L. Aigello писал, что фактическая частота этой инфекции намного превышает количество регистрируемых случаев, и образно назвал криптококкоз «пробуждающимся гигантом» среди системных микозов (Колуканов И.Е., Чайка Н.А., Колуканов А.И. Рекомендации для врачей. Криптококкоз и СПИД. - Л., 1990). Это предсказание оказалось пророческим. С ростом заболеваемости СПИД резко возросла частота регистрации криптококкоза в мире, который настолько часто осложняет течение СПИДа, что некоторые авторы говорят о существовании «ассоциации» «криптококкоз + СПИД» и делают вывод о целесообразности обследования на СПИД всех больных криптококкозом; в равной мере
■
всех больных СПИД следует проверять на крипто-коккоз (Колуканов И.Е., Чайка Н.А., Колуканов А.И. Рекомендации для врачей. Криптококкоз и СПИД. -Л., 1990).
Данные о частоте криптококкоза в России отсутствуют, в последние годы отмечают рост числа зарегистрированных случаев в Санкт-Петербурге [2].
Возбудителем являются Cryptococcus neoformans (Sanfelice, 1894), относящийся к классу базидиомице-тов, роду Cryptococcus. Этот род включает большое количество видов и вариантов, из которых в 90% случаев возбудителями микоза являются C. neoformans var. neoformans и C. neoformans var. grubii [3]. Наиболее чувствительны к этому микроорганизму - головной мозг и его оболочки, основные клинические формы заболевания - менингит и менингоэнцефа-лит.
Естественная устойчивость здорового человека к криптококкам достаточно высока, поскольку преимущественно страдают этим заболеванием лица с нарушениями иммунной системы, хотя возбудители широко распространены в различных географических зонах.
Однако с введением высоких технологий в медицину растет заболеваемость криптококкозом и среди лиц, не инфицированных ВИЧ (трансплантация органов и тканей, врожденные формы иммунодефицита, длительное применение иммунодепрессантов и кортикостероидов, декомпенсированный сахарный диабет и др.) [4]. При дефекте любого из звеньев иммунного механизма возбудитель продолжает активно размножаться, и в организме накапливается большое количество криптококкового полисахаридного антигена, что приводит к активации Т-супрессоров и подавлению иммунного ответа на всех уровнях (Ко-луканов И.Е., Чайка Н.А., Колуканов А.И. Рекомендации для врачей. Криптококкоз и СПИД. - Л., 1990).
Значительное число случаев остаются нераспознанными и «проходят под маской» других заболеваний.
Из вышесказанного следует, что необходимы настороженность врачей разных специальностей в отношении криптококкоза и проведение грамотного обследования для постановки диагноза. Ранняя диагностика микоза во многих случаях имеет решающее значение для успешной этиотропной терапии.
Цель исследования - установить распространенность криптококкоза у больных ВИЧ-инфекцией с клиническими признаками поражения центральной нервной системы в республике Татарстан.
ПАЦИЕНТЫ, МЕТОДЫ, МАТЕРИАЛЫ
За период - август 2010 - декабрь 2013 гг. обследовано 103 ВИЧ-инфицированных пациента с диагнозами «менингит» и «менингоэнцефалит», находящихся под наблюдением и на лечении в отделении медико-социальной реабилитации в РЦПБ СПИД И
ИЗ МЗ РТ Казани. Все пациенты были подразделены по стадиям ВИЧ-инфекции, возрасту и полу.
Стадии ВИЧ-инфекции определяли по приказу МЗ СЗ РФ от 17 марта 2006 года № 166 [5]. На 2В стадии (острая инфекция с вторичными заболеваниями) были 2 пациента (1,94%), на 3 стадии (субклиническая) - 11 (10,7%); на 4 стадии вторичных заболеваний - 90 (87,4%), из них: на 4А стадии - 8 (7,8%), на 4Б стадии - 35 (34%) и на 4В стадии - 47 (45,6%) человек.
Мужчины составили 70% (72 чел.), женщины -30% (31 чел.), максимальный возраст - 60 лет, минимальный - 20 лет. Среди обследованных преобладали пациенты в возрастной категории от 20 до 40 лет (84,5%), старше 40 лет - 15,5% (16 чел.).
Исследовали 118 образцов: ликвор - 45 проб и сыворотки крови - 73 пробы. Забор и доставку материала осуществляли согласно общим требованиям [6].
Для выделения и идентификации возбудителей использовали общеупотребительные микробиологические методы исследования, направленные на получение чистых культур, изучение их биологических характеристик.
Культуральное исследование. Ликвор засевали на бульонные и плотные питательные среды для выявления роста любых, в том числе - требовательных, микробов: кровяной агар (5% бараньей крови), шоколадный агар, Сабуро агар, мясо-пептонный бульон (БиоРад, Франция), хромогенную среду для выделения грибов (Оксоид, Англия). Инкубировали посевы при 37 °С в течение 3 суток, затем чашки с отсутствием роста выдерживали до 10 суток при комнатной температуре. В течение 10 суток проводили наблюдение за средами обогащения.
Идентификацию выделенных грибов до вида выполняли с помощью тест-системы Auxacolor 2 (БиоРад, Франция).
Чувствительность к антимикотикам определяли с помощью тест-систем Fungitest (БиоРад, Франция), Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems LTD, Англия).
Микроскопическое исследование: осуществляли микроскопию нативного препарата ликвора с определением цитоза. В тушевом препарате ликвора выявляли капсульные дрожжевые формы. Окраску по Граму ликвора проводили для определения грам+ и грам- форм бактерий.
Иммунологическое исследование: антиген крип-тококка в ликворе и сыворотке определяли методом латекс-агглютинации в тест-системе Pasrorex Cryptoplus (БиоРад, Франция).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования из 103 ВИЧ-инфицированных больных антиген криптокок-ка выявили у 13 человек, что составило 12,6%. Данные по пациентам с положительным результатом на антиген криптококка приведены в таблице 1.
Таблица 1
сведения об обследованных лицах и данные результатов их исследования на криптококк
Пациент Год рождения ДДН* лет Стадия ВИЧ АРВТ *** Биоматериал
Пол Сыв-ка (Ag) Ликвор (Ag) посев микроскопия
1 М 1979 13 IVB - + + C. neof. капсула
2 М 1977 <0,5 IVB + + 0 0 0
3 М 1981 <0,5 IVB + 0 + C. neof. капсула
4 М 1962 <0,5 IVB + + 0 0 0
5 М 1982 <0,5 IVB + + 0 0 0
6 М 1978 11 III - + 0 0 0
7 М 1978 2 № + + 0 0 0
8 М 1973 <0,5 IVB + + + C. neof. капсула
+ п/з** +п/з -//- капсула
+ п/з +п/з -//- капсула
9 М 1971 <0,5 № - + + C. neof. капсула
+ п/з +п/з -//- капсула
10 М 1980 2 IVB + 0 + C. neof. капсула
11 М 1960 2 III + 0 + C. neof. капсула
12 М 1975 3 III - 0 + C. neof. капсула
13 Ж 1974 3 IVB + 0 + C. neof. капсула
0 +п/з C. neof. капсула
* - длительность диспансерного наблюдения (год)
0 - материал не поступал
** - повторный забор
*** - антиретровирусная терапия
По данным из научной литературы, показатели специфичности и чувствительности стандартных тестов для обнаружения антигена Cryptococcus зрр. в сыворотке больных превышает 90% [1, 4].
С конца 2012 г. в лабораторию чаще передают сыворотку от ВИЧ-инфицированных лиц для исследования на криптококкоз. Исследование сыворотки на антиген криптококка является своеобразным скри-нинговым методом в диагностике, так как не всегда удается провести пункцию спинного мозга для получения ликвора от этой категории пациентов. Поэтому при подозрении на криптококкоз любой локализации всем больным ВИЧ-инфекцией показано определение антигена Cryptococcus зрр. в сыворотке.
Из обследованных 103 пациентов антиген крип-тококка выявили у 13 (12,6%), из них у 3 (23%) - на 3 стадии заболевания, у 2 (15,4%) - на 4Б стадии и у 8 (61%) - на 4В стадии, при этом подавляющее большинство составили мужчины - 12 человек (92,3%). 5 пациентов (38,5%) были в возрасте старше 40 лет. 10 больных (80%) находились под диспансерным наблюдением с диагнозом «ВИЧ-инфекция» сравнительно недавно (менее 3-х лет), причем более 50% из них были поставлены на диспансерный учет в середине 2013 г. (полгода назад).
Достоверный диагноз криптококкоза может быть поставлен только на основании данных, полученных при обследовании больных микологическими и им-
мунологическими методами.
При поступлении ликвора на микробиологическое исследование первично выполняли микроскопию нативного препарата. Чаще наблюдали цитоз в виде лейкоцитов и единичных эритроцитов. В ряде препаратов, где цитоз отсутствовал, мы обнаружили дрожжевые почкующиеся клетки с одной почкой. Количество клеток в поле зрения варьировало - от единичных до 5-8, образования цепочек не было. При наличии дрожжевых клеток, при микроскопии в капле туши была хорошо видна капсула в виде светлого ободка вокруг дрожжевой клетки. Толщина капсулы во всех образцах была небольшой - меньше диаметра самой клетки гриба. При обнаружении капсулы в тушевом препарате считали вероятным наличие криптококка. Все пробы ликвора, в которых выявили дрожжевые клетки, были положительными и в реакции латекс-агглютинации на наличие антигена C. neoformans.
Культуральное исследование всех поступивших в лабораторию проб ликвора проводили на выявление бактериального и грибкового роста. Однако во всех случаях, где имел место рост культуры, нами получен рост только криптококка. Высевы со сред обогащения также не давали бактериального роста. На среде Сабуро мы наблюдали появление колоний беловатого цвета, чаще - на 3-5 сутки, иногда - на 7 сутки. На агаре Сабуро криптококки образовывали колонии практически одинакового размера и пастообразной консистенции. На хромогенной среде размер и цвет колоний различался: размер - от мелких до крупных, цвет - от бежевого до различных оттенков коричневого.
При идентификации выросших культур во всех случаях был выделен C. neoformans. Типирования вариантов криптококка методом ПЦР не проводили.
В 12 пробах ликвора был выделен Cryptococcus neoformans. В этих же 12 образцах мы обнаружили дрожжевые клетки в нативном препарате и капсулу при микроскопии в капле туши.
Все выделенные штаммы гриба были протестированы на чувствительность к антимикотикам (таблица 2).
Таблица 2
чувствительность к антимикотикам выделенных штаммов c. neoformans
Антимикотик S(чувствительный) I (умеренно чувств.) R (устойчивый)
Амфотерицин В 8 (100%) 0 0
Итраконазол 8 (100°%) 0 0
Миконазол 7 (87,5%) 1 (12,5%) 0
Флуконазол 7 (87,5%) 1 (12,5%) 0
Флюроцитозин 5 (62,5%) 3 (37,5%) 0
Кетоконазол 7 (87,5%) 1 (12,5%) 0
При изучении резистентности к антимико-тикам штаммов грибов, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся на диспансерном наблюдении в «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ», отмечали сохранение чувствительности к флу-коназолу у 7 пациентов из восьми, в одном случае -умеренную чувствительность к флуконазолу.
По данным из научной литературы, первичная резистентность C. neoformans к азоловым антими-котикам встречается редко [1], однако возможно появление вторичной резистентности при длительной антифунгальной терапии. Поэтому клиницистам нужно помнить, что у таких ВИЧ-инфицированных пациентов необходимо повторно забирать именно ликвор с целью получения роста штамма с обязательной оценкой его чувствительности к антифун-гальным препаратам.
У 3 из 13 ВИЧ-инфицированных лиц ликвор и сыворотку забирали неоднократно в течение исследуемого периода. У тринадцатого больного, после первичного выделения криптококка и проведенного лечения, в последующем все исследованные пробы были отрицательными.
У восьмого пациента, после повторного взятия ликвора на фоне проводимого лечения флуконазо-лом, снова отмечали рост C. neoformans. Но выявить чувствительность к антимикотикам не удалось на Фунгитесте, поэтому использовали метод серийных разведений (Sensititre) с определением МПК. Получили умеренную устойчивость к флуконазолу (МПК - 16 мкг/мл) и чувствительность к ворикона-золу (МПК - 0,25 мкг/мл). По результатам анализа, терапию флуконазолом заменили на вориконазол. Согласно контрольным исследованиям, гриб продолжал персистировать в организме больного, причем пациент получал антиретровирусную терапию (АРВТ) с 2009 года, и при этом, на фоне снижения вирусной нагрузки, уровень СД4 клеток оставался низким (<0,03-109/л).
На сегодняшний день основные стратегические проблемы лечения ВИЧ-инфекции так или иначе оказываются связанными с появлением резистентности вируса к АРВТ. На фоне снижения эффекта АРВТ у пациентов возможно присоединение тяжелых оппортунистических заболеваний, к которым относят криптококкоз.
Так, из 13 обследованных нами пациентов, у которых был выделен C. neoformans, 9 получали АРВТ.
Вероятность связи развития у них криптококкоза с резистентностью вируса к АРВТ весьма высока. Возможно, стоит рассмотреть вопрос ранней профилактики криптококкового менингита у ВИЧ-инфицированных пациентов, независимо от стадии заболевания, с назначением флуконазола.
выводы
1. Встречаемость криптококкоза у ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими признаками поражения центральной нервной системы в республике Татарстан составила 12,6%.
2. Основная часть ВИЧ-инфицированных пациентов (76,4%) с диагнозом «внелегочный криптокок-коз» - преимущественно мужчины (92,3%) в возрасте от 30 до 40 лет (77%) - находились на стадии вторичных заболеваний.
3. Во всех положительных пробах ликвора C. neoformans обнаружили иммунологическими и микологическими методами.
4. Все выделенные штаммы C. neoformans имели капсулу небольших размеров.
5. Все выделенные штаммы C. neoformans были чувствительны к флуконазолу до начала антимико-тической терапии.
6. При длительном применении флуконазола необходим мониторинг за уровнем чувствительности возбудителя к этому препарату.
7. Поздние выявление ВИЧ-инфекции и постановка на диспансерное наблюдение приводят к развитию тяжелых оппортунистических заболеваний, в частности - криптококкоза.
8. Необходим скрининг сыворотки ВИЧ-инфицированных больных для выявления антигена криптококка.
9. Диагноз «криптококкоз» можно ставить при наличии положительного результата на антиген криптококка в двух порциях сыворотки, взятых в разное время, либо при наличии положительного результата на антиген в ликворе и сыворотке крови одного больного.
цитированная литература
1. Аравийский Р.А, Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. - СПб.: СПМАПО, 2004. - 185 с.
2. Хостелиди С.Н., Сорокина М.М., Борзова Ю.В. и др. Криптококкоз легких у пациентки без ВИЧ-инфекции. Описание случая и обзор литературы // Проблемы медицинской микологии. - 2013 - Т. 15, №2. - С. 18-24.
3. Васильева Н.В., Богомолова Т.С., Выборнова И.В., Босак И.А. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза. Мат-лы IX съезда Всеросс. научно-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - Т. 2. - С. 221.
4. Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение. 2-ое изд. - М., 2008. - С. 335.
5. Покровский В.В. ВИЧ-инфекция и СПИД. Клинические рекомендации. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 192 с.
6. Зубков М.Н. Сбор, транспортировка биологического материала и трактовка результатов микробиологических исследований. Лабораторная диагностика. - 2004. - Т. 6, №2. - С. 143-154.
Поступила в редакцию журнала 17.02.2014
Рецензент: Т. С. Богомолова
