CC BY
46Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 20 (59). 2007. № 3. С. 79-86.
УДК 582.594.2:581.143.6
КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ ОРХИДНЫХ IN VITRO И ЕЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
Теплицкая Л.М., Шейко Е.А., Лобко В.Н.
Получены каллусные культуры из пыльников 5 видов орхидных флоры Крыма. Показана зависимость процесса каллусогенеза от генотипа и фитогормонального состава питательной среды. Цитоморфологический анализ каллусных культур показал их высокий морфогенетический потенциал, в связи с присутствием меристематических очагов, гистогенеза и эмбриогенеза.
Ключевые слови: орхидные, каллусная культура, пыльники in vitro.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важнейших проблем является сохранение биологического разнообразия природных флор, в том числе редких и исчезающих видов, к которым относятся представители семейства Орхидных. Актуальным является разработка методов ускоренного размножения, введения в культуру, репатриация этих видов в природные места обитания, а также создание генетических банков и коллекции, для сохранения и расширения генофонда.
Перспективным направлением в этой области является разработка биологических подходов культивирования in vitro как вегетативных, так и генеративных структур, таких как пыльник, завязь и семязачаток, так как они имеют высокий морфогенетический потенциал и обладают определенной автономностью от материнского растения. Суть такого процесса заключается в переключении программы развития морфогенетически компетентных клеток генеративных структур с обычного гаметофитного пути на иной путь - спорофитный, то есть образования растеши - регенеранта [1,2,3].
Универсальность путей морфогенеза в естественных условиях и культуре in vitro позволяет выбрать модель для экспериментального изучения основных закономерностей и путей морфогенеза. Такой моделью может служить пыльник. Исследования морфогенетического потенциала клеток пыльника in vitro вносят определенный вклад в решение проблемы воспроизведения и размножения цветковых растений. Особенно важное значение приобретают эти исследования для создания высокоэффективных технологий массового получения растений редких, исчезающих, эндемичных видов.
Целью работы была оптимизация условий культивирования пыльников 5 видов орхидных крымской флоры, получение каллу с ной культуры и изучение ее морфогенетического потенциала.
79
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для проведения исследований служили дикорастущие виды орхидных (Orchidaceae) флоры Крыма: Orchis simia Lam. - ятрышник обезьяний, Anacamptis pyramidalis (L.) Rich - анакамптис пирамидальный, Orchis purpurea Huds. - ятрышник пурпурный, Epipactis helleboriné {L.) Crantz - дремлик широколистный, CephaJanthera damasonium (Mill) Bruce - пыльцеголовник крупноцветковый.
Пыльники отбирали из нераскрывшихся бутонов (накануне цветения) и после стерилизации на питательные среды. Культивировали пыльники в колбах на агаризированных питательных средах, дополненных бензиламинопурином (БАП). киношном (2.4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д)). индолилмасляной кислотой (ИМК). Условия культивирования: температура 23 - 25°С. освещенность 2 - 3 тыс. люкс при 10 часовом фотопериоде, относительная влажность воздуха составляла 60 %. Цитологические исследования проводили на временных окрашенных ацетокармином препаратах [4.5] Микроскопические исследования проводили на микроскопах МБИ - 3 (><8. 20. *90). Микрофотографии сделаны при помощи фотонасадки МФНЭ - 1. на фотопленку «Kodak - 200»
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Культивирование растений in vitro для получения каллуса и растений -регенерантов невозможно без получения асептической культуры. В наших исследованиях были опробованы два способа стерилизации. На начальных этапах проведения эксперимента планировалось подобрать такие стериленты и режимы стерилизации, чтобы получить максимальный выход стерильного материала, при минимальной гибели эксплантов от жесткого режима стерилизации. Для соблюдения условий асептики работу по введению эксплантов в изолированну ю культуру выполняли в условиях ламинарного бокса. Поверхностную стерилизацию материала проводили 0,8% Ag( NCh); - (5 минут). 0.8% Ag( NOi): (2 минуты) вместе с 70% этанолом (1 минута), 70% этанолом (1 минута) (табл. 1).
Как видно из данных таблицы 1, наибольшей стерильности при получении асептических эксплантов генеративных органов орхидей изученных видов у далось достичь при использовании двойной стерилизации с 0.8% Ag(N05): и 70% этанолом в течении 2 и 1 минут соответственно. Количество асептических эксплантов при данном методе стерилизации составило от 89,3% у С. damasonium до 100% у О. simia. При этом максимальный процент жизнеспособных эксплантов составил для пыльников у Е. helleborine 4,1%. а наименьший процент жизнеспособных эксплантов у О. purpurea 0,9%. При использовании 0.8% азотнокислого серебра (5 мину т) процент асептических эксплантов был высок (от 98.4 до 70.5% у изученных видов), однако количество жизнеспособных эксплантов составило от 5,4 до 10,5%, что не у довлетворяло нашим требованиям. Оптимальным способом стерилизации пыльников изученных видов орхидных было использование 70% этанола с экспозицией 1 минута. Несмотря на то. что при этом процент асептических эксплантов оказался ниже, чем при использований вышеуказанных приемов (стерильность составила в среднем 67.7% для всех эксплантов). в дальнейшей работе использовалась именно эта стерилизация, так как
80
показатель жизнеспособности эксплантов был высок, и составит от 98.5% (А. pyramidalis), до 62,2% (С. damasonium).
Важным методическим моментом в разработке методов культуры in vitro является подбор питательной среды с оптимальной концентрацией регуляторов роста для индукции каллусогенеза В ходе проведения эксперимента нами были опробованы пять основных питательных сред: Мурасиге-Ску га. Гамборга-Эвелега В5. Нича. Нича и Нич и Потата II. Состав среды был модифицирован дтя индукции каллусогенеза. чтобы в короткие сроки получить первичную каллус ну ю ткань. В качестве основных дедифференцирующих факторов Бутенко. Крутлова рекомендуют использовать природные фитогормоны и их синтетические аналоги: 2.4-Д. ИМК. 6-БАП [6, 7]. Данные регуляторы роста использовались в концентрациях от 0,5 мг/л до 3.0 мг/л.
Таблица 1.
Влияние различных стерилентов и режимов стерилизации на получение асептической культуры и жизнеспособность пыльников орхпдных in vitro
Объект исследования С1 ери. ют ы и режимы стерилизации Количество асептических эксплантов. °о Количество жизнеспособных эксплантов. °о
A.pyramidaiis Анакамптис пирамидальный 0,8% А0Ж)3); 5 мин 97,5 5,5
0,8% ,\Ш\'< Ь> 2 мин, 70% этанол, 1 мин 92,5 12,3
70% этанол, 1 мин 25,0 98,5
О. simia Ятрышник обезьяний 0,8% Л»(\'<>; ); 5 мин 97,0 7,0
0,8% А0Ж>з): 2 мин, 70% этанол, 1 мин 99,9 1,0
70% этанол, 1 мин 77,8 80,6
О. purpurea Ятрышник пурпурный 0,8% А^ЗЩЬ 5 мин 96,8 7,6
0,8% А^Ж)3)2 2 мин, 70% этанол, 1 мин 98,9 0,9
70% этанол, 1 мин 75,1 79,3
Е. heüeborine Дремлик широколистный 0,8% ,\Ш\'< Ь> 5 мин 86,4 7,3
0,8% А0Ж)3); 2 мин, 70% этанол, 1 мин 95,2 4,1
70% этанол, 1 мин 70,0 82,7
С. damasonium Пыльцеголовник крупноцветковый 0,8% А§(ТТОз); 5 мин 70,5 10,5
0,8% Л»(\'<>; ); 2 мин, 70% этанол, 1 мин 89,3 2,9
70% этанол, 1 мин 88,2 65,2
81
Полученные нами данные, однако, позволили сделать вывод о том. что из всех сред наиболее пригодной для культивирования пыльников изучаемых видов является среда Нича и Ним с различными концентрациями регуляторов роста. При культивировании генеративных органов на остальных средах во всех вариантах наших исследований получены отрицательные результаты. Данные по каллусообразованию на ра¡личных вариантах среды Нича и Нич представлены в таблице (табл. 2).
Таблица 2.
Влияние фптогормонов модифицированной питательной среды Нпча и Нич на частоту каллусообразования в культуре пыльников орхпдных in vitro
Виды Концентрация фптогормонов в среде, мг/л Частота каллусогенеза. ' %
2.4-Д ИМК 6-БАП
О. simia 1.5 - 2.0 30,1 ± 1,2
A. pyramidalis 1,5 - 2.0 25,4 ± 0.9
С. damasonium 1.5 - 2.0 28.3 ± 0.7
О. simia - 2.5 3.0 27.4 ± 1.1
A. pyramidalis - 2.5 3,0 20.2 ± 0,6
С. damasonium - 2.5 3.0 33,4 ± 1.8
О. simia - - 0.5 1.5 ± 0.5
A. pyramidalis - - 0.5 0.9 ± 0,2
С. damasonium - - 0.5 1.7 ±0,6
Е. helleborine - - 0.5 2.0 ± 0.4
О. simia - 2.5 2.0 3.2 ±0,6
A. pyramidalis - 2,5 2.0 2,7 ±0,4
С. damasonium - 2.5 2.0 3,0 ± 0,3
Е. helleborine - 2,5 2.0 2.5 ± 0,6
О. simia - - - 1.0 ±0,4
A. pyramidalis - - - 1.4 ±0,7
С. damasonium - - - 2,9 ± 0.8
При концентрации 2,4-Д 1.5 мг/л и 6-БАП 2,0 мг/л максимальная частота каллусообразования для пыльников О. simia составила 30,1 %, для С. damasonium показатель каллусогенеза составил 28.3 %, а для пыльников А. pyramidalis - 25.4 %.
При использовании концентрации ИМК 2.5 мг/л и 6-БАП 3,0 мг/л для С. damasonium количество образующих каллус пыльников составило 33.4 %. подобная зависимость прослеживается при высадке на данную модификацию среды пыльников О. simia - 27А % каллусообразующих эксплантов Для данного варианта среды минимальный процент каллусообразования составил 20.2 % для пыльников А. pyramidalis.
Как видно из данных таблицы 2. при использовании только 6-БАП в концентрации 0.5 мг/л процент каллусообразования составил 0.9 - 2.0 % у
82
исследованных видов. При использовании среды Нича и Нич с концентрациями ИМК 2,5 мг/л и 6-БАП 2.0 мг/л, процент каллусогенеза составил от 2,5 до 3,2 % у изученных видов. При использовании безгормональной среды количество пролиферирующих эксплантов составило от 1,0 до 2,9 %.
Таким образом, из полученных данных следует, что для получения каллусных культур из пыльников изученных видов необходимо использовать среду Нича и Нич, дополненную 2.4-Д 1,5 мг/л и 6-БАП 2,0 мг/л. или эту же среду, модифицированну ю ИМК 2,5 мг/л и 6-БАП 3,0 мг/л.
В результате проведенных исследований по подбору оптимальных условии культивирования была получена каллусная культура из пыльников пяти видов орхидных (рис. 1). Цитологический анализ этих культур показал ряд специфических особенностей. К ним относятся: 1) значительная структурная гетерогенность клеток, наличие различных типов образований, различающихся по морфологии: 2) связь морфологических признаков отдельных образований с их морфологическими потенциями.
Рис. 1. Каллусная культура из пыльников Anacamptis pyramidalis (L.) Rieh
В каллусе также были обнаружены мелкие клетки, локализованные группами, с кру пными ядрами, образующие мсрнстсматичсскнн очаг (рис. 2).
Появление меристематических очагов означало, что в каллусной ткани начались процессы вторичной дифференциации. Деление клеток меристематических очагов могло приводить к образованию лигнифицированных проводящих элементов сосудов и трахеид (рис. 3). Их образование аналогично ксилемогенезу у интактного растения и включает в себя стадии: рост клеток, вакуолезацию. отложение вторичной оболочки в условиях in vitro.
Другой путь морфогенеза в меристематических очагах - это спонтанный эмбриоидогенез. Каллусная клетка, ставшая на путь эмбриоидогенеза. относительно обособляется от окружающих клеток, ограничиваясь плотной оболочкой, увеличивается, сильно окрашивается. Обособившаяся клетка претерпевает строго направленные деления. В результате заложения ориентированных клеточных перегородок возникает четырехклеточная структура (тетрада), все клетки которой
83
располагаются линейно (рис. 4). В дальнейшем формировании эмбриоида принимают участие как апикальные, так и базальные клетки, появляется многоклеточный эмбриоид (рис. 5).
Рис. 2. Меристематические очаги в каллусной культуре Orchis simia Lam. (ув х 40, окраска ацетокармином).
Рис. 3. Начало гистогенеза в каллусной культуре Сер1ш1ап!Ьега Лтшвоппап (АЛП) Огисг. (ув х 90, окраска ацетокармином).
Нарушение развития эмбриоидов чаще всего выражается в неправильной ориентации клеточных перегородок при первых делениях относительно оси полярности. Это характерно как для апикальных клеток, так и для клеток, образующих подвесок. Часто базальная клетка делится раньше апикальной или не делится вообще. Во многих случаях наблюдается нарушение симметрии клеточных
84
делений и их асинхронность. Клеточные перегородит закладываются хаотично, во всех направлениях. Наблюдается также нарушение соотношения размеров клеток, образующих эмбриоид. Кроме того, восьмиклеточный подвесок, характерный для зародыша, обычно сильно редуцирован. Несмотря на большое количество нарушений в ходе эмбриоидогенеза. часть эмбриоидов развивается аналогично зиготическому зародышу, проходя те же стадии: предзародышевую стадию, глобулярную, торпедовидную. Таким образом, соматические эмбриоиды. полученные в культуре пыльников, могут быть использованы как исходный материал для размножения орхидей.
Рис. 4. Четырехклеточный эмбриоид в каллусной культуре Orchis simia Lam. (ув х 90, окраска ацетокармином).
Рис. 5. Многоклеточный эмбриоид в каллусной культуре Orchis simia Lam. (ув х 90, окраска ацетокармином).
85
ВЫВОДЫ
1. Определены оптимальные стериленты и режимы стерилизации для получения каллу сноп культуры из пыльников 5 видов орхидных крымской флоры.
2. Подобраны биологически активные вещества, питательная среда и условия культивирования пыльников орхидных in vitro.
3. Впервые полу чены каллус ные культу ры из пыльников орхидных в условиях in vitro и показано влияние биологически активных веществ на частоту каллусообразования.
4. Дана цитоморфологическая характеристика каллусных культур и показан их высокий морфогенетический потенциал, в связи с наличием меристематических очагов и соматических эмбриоидов.
Список литературы
1. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепции. Т.1: Генеративные органы цветка Ред. Т.Б.Батыгина. - С-Пб.: Мир и семья. 1994. - С. 120 121
2. Круглова H.H.. Батыгина Т.Б.. Титова Г.Е.. Сельдимирова O.A. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы. - Уфа. 2005. - 230 с.
3. Vasil I.. Nitch С. Experimental production of haploids and their uses / Ztschr. Pflanzenphysiol - 1975. -Bd. 76.-S. 191-212.
4. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос. 1988. - 170 с.
5. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. - М.: Мир. 1965. - 378 с.
6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964.-272 с.
7. Круглова H.H., Батыгина Т.Б. Методические рекомендиции по использованию морфогенетического потенциала пыльника в биотехнологических исследованиях яровой пшеницы. - Уфа: ИБ УНЦ РАН. 2002.-22 с.
Теппииька Л.А!.. Шешо Е.А., Лобко В.AL. Культура пиляыв орзцдния in vitro та Ti морфогенетичний потенщал Вчеш записки Тавршського нацюнального университету ím. B.I. Вернадського. Сер1я „Бюлопя, х1м1я". - 2007. - Т. 20 (59). -№ 3. - С. 79-86.
Отримано калуеш культури з пиляюв 5 вид1в обхвдних флори Криму. Показана залежшеть процесу калусогенезу ввд генотипу та ф1тогормонального складу поживного середовища. Цитоморфолопчний анал1з калусних культур показав 1хшй внеокпй морфогенетичний потенщал. в зв.язку з ирисутшстю меристематичних осередыв. гистогенезу та ембрюгенезу.
Кточот слова: обхщш, калусна к> льтура, пиляки in vitro.
Teplitskm'a L.AL, Scheiko ЕЛ., Lobko J'.Л'. The culture of anther of Orchids in vitro and its morphogenetic potencial Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta
mi. V. I. Vernadskogo. Series «Biology, chemistry». - 2007. - V.20 (59). -13. -P.79-86. "
Callus cultures from anther of 5 species of Crimean flora were gotten. It was shown the dependence of callusgenesis processis from genotype and phytohormonal composition of nutrition! medium. Cytomorphological analysis of callus cultures showed their high morphogenetic potencial in connection with the presence of meristematic places of hystogenesis and embrvogenesis.
Keywords: orchids, callus culture, anther in vitro.
Поступила в редакцию 12.07.2007 г.
86
