CC BY
94
УДК 581.1
КУЛЬТУРА IN VITRO И ФИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛЫНИ
ЭСТРАГОН
© 2005 г. А.М. Агларова, З.М. Алиева, А.Г. Юсуфов
The article is about the pharmacological, microbiologic and chemical investigations of Artemisia dracunculus L. The activity of callusogenesis of its different explants was studied.
Полынь эстрагон, или тархун, хорошо известна как пищевое и пряно-ароматическое растение. В России его выращивают на Северном Кавказе, в средней полосе, на Алтае. Для культивирования эстрагона в различных условиях выведены районированные сорта. В нашей стране наиболее распространены сорта эстрагона Грибовский (отечественный) и Французский (западно-европейский) [1].
Медицинское значение эстрагона обусловлено своеобразием и уникальностью химического состава, который обеспечивает широкий спектр биологической активности. В настоящее время обнаружены витаминное, успокаивающее, противосудорожное действие, а также другие биологические свойства эстрагона [2, 3]. В тибетской медицине эстрагон применяется при лечении туберкулеза легких, пневмонии, хронического бронхита [4].
Такое широкое применение эстрагона в народной медицине привлекает внимание многих исследователей.
Цель данной работы - введение эстрагона в культуру in vitro, проведение фитохимического анализа сырья, микробиологических и фармакологических исследований.
Материалы и методы
Материалом для исследования служила обмолоченная трава полыни эстрагон A. dracunculus L, заготовленная на плантациях Дербентской зональной опытной станции ВИР (с. Вавилово) в фазе цветения (август 2002 г.). Свежее сырье высушивали на воздухе при температуре 25-30 °С в тени до воздушно-сухого состояния.
Качественный анализ основных групп веществ проводили в соответствии с Государственной фармакопеей [5].
Содержание биологически активных веществ определяли в пересчете на абсолютно сухое сырье: эфирное масло - в свежем сырье методом паровой перегонки; полисахариды - гравиметрически после экстракции горячей водой и охлаждения этанолом; флавоноиды - фотоколориметрически с использованием в качестве стандарта рутина; витамин С - титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; сумму каротиноидов - фотоколориметрически с использованием в качестве стандарта раствора ди-
хромата калия; кумаринов - спектрофотометрически с использованием в качестве стандарта раствора кумарина; содержание общего азота и сырого протеина -титрометрически после минерализации азотсодержащих веществ до аммиака.
Оценку антимикробной активности проводили на 8 тестах-культурах, фармакологические исследования
- с рекомендациями Государственного фармакологического комитета МЗ РФ [6].
Культивирование эксплантов эстрагона в условиях in vitro проводили по общепринятой методике [7]. Экспланты помещали на питательную среду Мураси-ге-Скуга (МС) с добавлением регуляторов роста -индолилмасляной кислоты (ИМК) и бензиламинопу-рина (БАП) в различных соотношениях. Культивировали при t = 23-25 оС и естественном освещении. За контроль принимали вариант с культивированием эксплантов на среде МС без регуляторов роста (минимальная среда). Учитывали способность эксплантов к выживанию и морфогенезу путем регенерации. Основными параметрами оценки служили: выживаемость (% живых эксплантов от их общего числа по разным срокам учета), рост эксплантов, активность процессов каллусо- и ризогенеза, а также величина биомассы экспланта и каллуса. Интенсивность каллу-сообразования определяли в процентах от общего числа, а мощность - в баллах (1 балл - островки каллуса на раневой поверхности; 2 балла - каллус покрывает раневую поверхность; 3 балла - сильное разрастание каллуса). Опыты повторяли весной и летом. Каждый вариант опыта включал 20-25 повторностей. В табл. 1-3 приведены средние арифметические значения из двух независимых опытов и их стандартные ошибки.
Результаты исследований
Важнейшими классами биологически активных веществ в эстрагоне являются эфирное масло, кума-рины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, витамины. Установлено количественное определение основных групп веществ: полынь эстрагон содержит эфирное масло - 1,5-2 %, флавоноиды -1,4, кумарины
- 1,4, каротиноиды - 14,5, полисахариды - 6-10%, аскорбиновую кислоту - 38 мг% (табл. 1).
Результаты микробиологических исследований показали, что 40 и 70 % настойки оказали антибиоти-
ческий эффект по отношению к Staphylococcus aureus 209-p, St.aureus (Макаров), St.aureus Type, St.Epidermidis Wood-46, Bacillus sub-tilis L2, Bac. Anthracoides-1 (табл. 2).
Результаты фармакологических исследований показали, что полынь эстрагон Artemisia dracunculus L. обладает антигипоксическим, спазмолитическим, анальгетическим, противовоспалительным, гастропротектор-ным, диуретическим, желчегонным, гепатопротекторным, седативным действием. При этом 40, 70 %-е спиртовые настойки в разведении 1:10 проявляли наиболее выраженную по сравнению с водными и другими исследуемыми спиртовыми настойками фармакологическую активность.
В литературе встречаются отдельные сведения о том, что биологической активностью обладают также кал-лусные культуры эстрагона. Так, в работе Kavvadias с соавт. (2000) впервые было обнаружено эндогенное образование бен-зодиазепинов в культуре тканей эстрагона. Исследовалось и обнаружено положительное влияние экстракта культуры тканей, выращенного из клеток A.dracunculus L. на бензодиазепиновые рецепторы головного мозга человека. Из экстракта методом ВЭЖХ были выделены и затем идентифицированы производные бензо-диазепинов - делоразепам и темазепам, содержание которых в клеточной ткани А.dracunculus L. достигает 100 - 200 мг/г.
С учетом высокой биологической активности, возможного медицинского использования эстрагона, а также слабой изученности вопроса культуры in vitro нами поставлена задача оптимизации условий каллусогенеза из разных органов растения. Для этого необходимо было выяснить способность и активность к каллусогенезу у эксплантов семядолей, гипокотилей, листьев, точек роста. При этом использованы разные способы стерилизации растительного материала. Наиболее оптимальным оказалось получение стерильных проростков из семян, обработанных перекисью водорода и высаженных на питательную среду. Проведена оптимизация условий для индукции каллуса, корней, а также образования побегов эксплантами точек роста, которые культивировали на питательной среде МС с добавлением регуляторов ИМК и БАП в различных соотношениях. Активность структур к росту и регенерации зависела от состава среды (табл. 3). Наиболее жизнеспособными в условиях in
Таблица 1
Химический состав полыни эстрагон, интродуцированного в Дагестане
№ Группа веществ Части растения Трава Литер. данные
Стебли Листья Плоды
1 Эфирное масло, % * * * 0,91 0,1 - 0,5
2 Зола общая, % * * * 7,75 -
3 Общий азот, % * * * 2,22 -
4 Сырой протеин, % * * * 13,87 -
5 Водорастворимые полисахариды, % 6,29 18,48 16,28 14,61
6 Флавоноиды, % 0,17 1,8 1,3 1,37 1,2-3,2
7 Аскорбиновая кислота, мг% 38,13 38,00 26,7 до 70
8 Каротиноиды, мг% - 14,50 14,01 10,15 6 - 15
9 Хлорофилл (а+в) мг/л * 1,66 * * -
10 Кумарины, % * * * 1,4 1,0-6,6
Примечание. * - показатель не определялся.
Таблица 2
Оценка результатов микробиологических исследований экстрактов травы Artemisia dracunculus L., мм
№ Опытный образец Тест-культуры
1 2 3 4 5 6 7 8
1 Водный экстракт 9
2 Спиртовый экстракт (экстрагент - 40 % этанол) 11 13 10 11 - - 12 12
3 Спиртовый экстракт (экстрагент - 70% этанол) 10 9 11 12 - - 11 12
Примечание. 10 мм - малая чувствительность; > 10 мм - чувствительность средняя; - не обладают активностью
1. Staphilococcus aureus 209-p
2. St. aureus (Макаров)
3. St. aureus Type
4. St. epidermidis Wood-46
5. Escherechia coli 675
6. Shigella flexneri 266
7. Bacillus subtilis L2
8. Bac. anthracoides -1.
vitro оказались изолированные точки роста, наименее - экспланты гипокотилей. Последние, несмотря на высокую способность к формированию каллуса (он развивался на 100 % эксплантов), быстро отмирали. Так, их выживаемость на 10 сут составила 10 %, тогда как листьев и точек роста - 70 ^ 100 %. Особенностью всех типов эксплантов эстрагона являлся очень медленный темп образования каллуса. При этом наблюдались заметные различия между эксплантами. Так, закладка каллуса на эксплантах листьев 2-3-месячных растений наблюдалась через 25 - 30 сут после помещения на питательную среду. У эксплантов семядолей и гипокотилей, взятых с 15-дневных проростков,
каллус закладывался быстрее (на 10 - 14 сут). Каллусообразование на эксплантах листьев со-
Таблица 3
Состояние эксплантов разных органов эстрагона in vitro
ставило 33 % при содержании в среде 0,5 мг/л ИМК и 2,5 мг/л БАП и 29 % - при обратном соотношении фитогормонов. Невысокой оказалась частота ризогенеза, корни образовывались Варианты Выживаемость на 30 сут, % Образование каллуса, % Прирост эксплантов Масса экспланта с каллусом
% Баллы
лишь у 15 % эксплантов семядолей. Образова- ЭС 10 ± 5 0 44±5 1,0 ± 0,5 7 ± 1
ние побегов в культуре in vitro наблюдали толь- ЭЛ 75 ± 5 0 33±4 1,0 ± 0,5 8 ± 1
ко на изолированных точках роста. ЭГ 10 ± 5 0 35±7 1,0 ± 0,5 6 ± 1
Таким образом, разные экспланты эстрагона ТР 20 ± 5 0 58±5 1,0 ± 0,5 7 ± 2
различаются по активности каллусо- и ризоге-
неза. Каллусная ткань эстрагона характеризует- ЭС 70 ± 5 57 ± 5 100 2,2 ± 0,2 15 ± 1
ся очень медленным ростом. Наиболее актив- ЭЛ 100± 0 33 ± 3 100 2,0 ± 0,5 13 ± 1
ными в этом отношении оказались экспланты, ЭГ 50 ± 5 100 ± 0 100 3,0 ± 0,5 12 ± 2
взятые с органов проростков, особенно гипоко- ТР 60 ± 10 100 ± 0 100 2,0 ± 0,4 16 ± 5
тилей, что делает перспективными опыты в
этом направлении. Однако для извлечения био- ЭС 60 ± 6 80 ± 5 100 2,1 ± 0,1 12 ± 1
логически активных веществ в целях их меди- ЭЛ 100 ± 0 29 ± 3 100 2,7 ± 0,3 11 ± 2
цинского испытания и использования необхо- ЭГ 50 ± 6 100 ± 0 100 3,0 ± 0,3 10 ± 1
дим дальнейший поиск условий для регуляции ТР 50 ± 5 80 ±10 100 2,8 ± 0,4 14 ± 2
роста каллуснои ткани эстрагона, что и входит в последующие наши задачи.
Литература
1. Муханова Ю.И. и др. Зеленые и пряные овощные культуры. М., 1976.
2. Дикорастущие полезные растения России : Справочник / Под ред. А. Л. Буденцева, Е.Е. Лесиовской. СПб., 2001.
3. Гончарова Т.А. Энциклопедия лекарственных растений. Лечение травами. М., 1997.
4. Машанов В.И., Покровский А.А. Пряно-ароматические растения. М., 1991.
5. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2: Общие
Дагестанский научный центр РАН, Дагестанский государственный университет
Примечание. Обозначение вариантов:
1 - среда МС - контроль,
2 - МС + ИМК (0,5 мг/л) + БАП (2,5 мг/л),
3 - МС + ИМК (2,5 мг/л) + БАП (0,5 мг/л)
методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. М., 1989.
6. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. М., 1990.
7. Калинин Ф.Л. и др. Методы культуры изолированных тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.
28 февраля 2005 г
