CC BY
43
УДК 5ТТ.152.321+663.11
КУЛЬТИВУВАННЯ БАЗИДІОМІЦЕТІВ — АКТИВНИХ ПРОДУЦЕНТІВ ЦЕЛЮЛОЗОЛІТИЧНИХ ЕНЗИМІВ. ІІІ. ЕНДОГЛЮКАНАЗНА АКТИВНІСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНИХ ФІЛЬТРАТІВ СТОСОВНО ГІДРОКСІЕТИЛЦЕЛЮЛОЗИ
К. Г. Древаль
М. І. Бойко Донецький національний університет
Е-mail: k.dreval@gmail.com
Отримано 06.10.2011
Проведено підбір умов культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолітичних ензимів за факторами рН живильного середовища (значення змінювалися від 3 до 9 рН з інтервалом
1 од) і температури (значення варіювали від 24 “С до 36 “С з інтервалом 2 0С). Визначали активність ен-доглюканази (КФ 3.2.1.4) щодо гідроксіетилцелюлози. Встановлено, що оптимальною початковою кислотністю живильного середовища для штамів К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus та AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa є рН Т, а для штаму Sh-1 Stereum hirsutum — рН 5; оптимальна температура культивування для штамів Д-1 Irpex lacteus та Sh-1 Stereum hirsutum — 30 “С, для А-Дон-02 Irpex lacteus — 32 “С, для AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa — 34 “С, а для штаму К-1 Irpex lacteus — 36 “С. У результаті оптимізації умов культивування значення ендоглюканазної активності зросли в 1,43 раза для штаму К-1 I. lacteus, в 1,79 — для А-Дон-02 I. lacteus, у 2,15 — для Д-1 I. lacteus, у 2,95 — для AnSc-1 D. confragosa f. confragosa та у 8,08 раза для штаму Sh-1 S. hirsutum. Водночас, у результаті підбору умов культивування питома ендоглюканазна активність щодо гідроксіетилцюлози штаму К-1 I. lacteus зросла в 1,42 раза, А-Дон-02 I. lacteus — 2,52 раза, Д-1 I. lacteus — 2,63 раза, штаму Sh-1 S. hirsutum — 5,22 раза та штаму AnSc-1 D. confragosa f. confragosa — у 16,67 раза. Штам J-2An Phellinus pomaceus не виявив ендглюканазної активності у жодному варіанті досліду. Максимальну ендоглюка-назну активність щодо гідроксіетилцелюлози для всіх штамів встановлено на Т-му добу культивування.
Ключові слова: базидіоміцети, ендоглюканаза, гідроксіетилцелюлоза, температура культивування, кислотність середовища, оптимізація, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Phellinus pomaceus.
Сучасна біотехнологія відчуває гостру нестачу активних продуцентів ензимів це-люлозолітичної дії з метою їх використання у процесах промислової утилізації целюло-зовмісних відходів та отримання біопалива [1]. Саме тому останнім часом у світі проводять активні дослідження з пошуку нових продуцентів целюлаз серед бактерій, грибів відділів Zygomycota та Ascomycota [2-4]. Проблема використання базидіоміцетів як джерела целюлаз полягає у недостатній вивченості цієї групи організмів як об’єктів біотехнології. Хоча аналіз та порівняння існуючих даних літератури дають підстави припустити, що базидіоміцети синтезують целюлази повільніше за нижчі гриби та/або бактерії, однак ензими базидіальних грибів активніші порівняно із традиційними продуцентами целюлозолітичних ензимів [5-9].
Поряд із пошуком активних продуцентів ензимів целюлозолітичної дії актуальним є питання дослідження їхніх фізіолого-біо-хімічних особливостей, зокрема визначення оптимальних значень рН середовища та температури культивування, оскільки целюлази з високими значеннями оптимумів рН і температури нещодавно було визнано одним із найважливіших факторів для успішного перебігу деструкції відновлювальної сировини в промисловості [10, 11]. Актуальність визначення оптимального режиму культивування базидіоміцетів визначається також і тим, що попередньо знайдені [5] штами базидіальних грибів уперше досліджують як активні продуценти целюлозолітичних ензимів.
Першим ензимом, який атакує нативну целюлозу, є ендоглюканаза (КФ 3.2.1.4) [12,13], тому здатність перспективних штамів-проду-
центів целюлаз до надсинтезу цього ензиму є вкрай важливою. Eндоглюканази з різних джерел відрізняються за своїм складом та властивостями, зокрема за специфічністю дії [11, 14-16]. Оскільки на ендоглюканазну активність істотно впливає структура замісника в молекулі целюлози [1Т], а також його заряд [18] та беручи до уваги те, що до гідролізу розчинних похідних целюлози можуть робити внесок не істинно целюлозолітичні ензими [13, 14], для повноцінного оцінювання активності ендоглюканази потрібно проводити дослідження щодо кількох субстратів. Паралельно із загальноприйнятим субстратом для визначення ендоглюканазної активності — Na-карбокси-метилцелюлози — відповідно до даних літератури та рекомендацій IUPAC [19-21] слід здійснювати дослідження також і щодо гідроксіетилцелюлози (гаЦ), яка легше піддається гідролізу через природу замісника.
Метою роботи було визначення оптимальних значень температури та рН живильного середовища для культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолітичних ензимів для підвищення синтезу позаклітинної ендоглюканази, здатної до гідролізу гідроксіетилцелюлози.
Матеріали і методи
Визначали вплив початкової кислотності живильного середовища та температури культивування на здатність базидіоміцетів до синтезу ендоглюканази у складі целюлозолітич-ного комплексу. Об’єктами досліджень були 6 штамів вищих базидіальних грибів, що їх на попередньому етапі скринінгу [5] відібрали як активні продуценти целюлаз: К-1, А-Дон-
02 та Д-1 Irpex lacteus (Fr.) Fr.; Sh-1 Stereum hirsutum (Willd.) Pers.; AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (Bolton) J. Schrot. та J-2An Phellinus pomaceus (Pers.) Maire.
Для дослідження ендоглюканазної активності ^А) штами культивували на рідкому середовищі Чапека такого складу (г/л): NaNO3 — 2, K2HPO4 — 1, MgSO4 •ТЩО — 0,5, KCl — 0,5, FeSO4 -Ш20 — 0,01 [22]. Як єдине джерело вуглецю до середовища додавали фільтрувальний папір Whatman №1 у кількості 8 г/л. Початкове рН живильного середовища доводили до значень від 3 до 9 з кроком 1 рН за допомогою 10%-х розчинів HCl або NaOH на аналізаторі іонів АІ-123 (Україна). Штами культивували упродовж 14 діб за температури від 24 до 36 “С з інтервалом
2 “С в термостатах ТС-80 та ТС-80-М2 (Росія).
EА ензимів у складі целюлозолітичного комплексу культуральних фільтратів (КФ)
базидіоміцетів визначали щодо 1%-го розчину ГЕЦ (Sigma, Німеччина). Склад реакційних сумішей при визначенні ензиматичної активності та умови проведення реакцій відповідали рекомендаціям IUPAC [20] і загальноприйнятим методикам [13, 14]. Обчислюючи результати, за одиницю активності (од) приймали таку кількість ензиму, яка утворювала 1 мкМ редукуючих цукрів протягом 1 хв за стандартних умов (рН = 4,8; t = 40 °С). Питому активність (од/мг протеїну) знаходили за відношенням загальної активності культурального фільтрату (од/мл) до вмісту протеїнів у ньому (мг протеїну/мл). Редукуючі цукри визначали методом Шомодьї-Нельсона (калібрувальний графік будували за глюкозою) [13, 23], вміст протеїну в КФ — спектрофотометричним методом на спектрофотометрі СФ-46 (Росія) [24].
Усі дослідження проводили у трикратній повторюваності. Статистичну обробку здійснювали методами дисперсійного аналізу, порівняння середніх — методом Дункана [25].
Результати та обговорення
Результати дослідження загальної ЕА КФ базидіоміцетів щодо ГЕЦ на 7-му та 14-ту добу культивування подано на рис. 1 і 2 відповідно.
З рис. 1, а видно, що на 7-му добу проведення досліду КФ штаму К-1 I. lacteus виявляв високу активність у діапазоні температур 30-34 °С за культивування на живильному середовищі з рН 4-7. Високе значення ЕА стосовно ГЕЦ у цього штаму встановлено за температури 34 °С на середовищі з рН 5, коли й зафіксовано максимум активності на 7-му добу культивування. Однак воно достовірно не відрізнялось від значення активності цього штаму щодо ГЕЦ, встановленого на 14-ту добу культивування (рис. 2, а). Таким чином, у результаті оптимізації умов культивування штаму К-1 I. lacteus значення ЕА КФ стосовно ГЕЦ збільшено в 1,43 раза.
Для штаму А-Дон-02 I. lacteus на 7-му добу культивування встановлено 2 зони високої ЕА КФ щодо ГЕЦ, які спостерігали на середовищах з рН 3-8 за температур 24 °С та 28-36 °С (рис. 1, б). На 14-ту добу культивування інтервал оптимальних значень рН живильного середовища звужувався до рН 4 для першої та рН 7 для другої зони (рис. 2, б). Абсолютне максимальне значення активності ензиму КФ цього штаму встановлено на 7-му добу експерименту зі зростанням на середовищі з рН 7 та за температури 32 °С. При цьому одержане значення активності
Рис. 1. Ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 і Д-1 Irpex lacteus (а, б та в відповідно); Sh-1 Stere um hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 7-му добу експерименту (тут і далі: у вставках наведено інтервали ендоглюканазної активності)
pH, од
Рис. 2. Ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 та Д-1 Irpex lacteus (а, б і в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 14-ту добу експерименту
в
ензиму перевищувало ГЕЦ-активність КФ штаму А-Дон-02 I. lacteus, визначену за не-оптимізованих умов, у 1,79 раза.
Як випливає з рис. 1, в, на 7-му добу культивування штаму Д-1 I. lacteus активність КФ щодо ГЕЦ є високою за культивування на живильних середовищах з рН 6-8 та температури
в межах 28-34 °С. На 14-ту добу експерименту діапазон максимальної активності залишався у тих самих температурних межах, але збільшувався за рахунок розширення меж значень рН живильних середовищ від 4 до 8 (рис. 2, в). Максимум ГЕЦ-активності штаму Д-1 I. Ш^є^ встановлено на середовищі
зрН 7 за температури 30 °С. Оптимізоване значення ЕА КФ цієї культури щодо ГЕЦ перевищувало неоптимізоване у 2,15 раза.
У культури 8Ь-1 5. hirsutum визначено один характерний чіткий максимум активності КФ щодо ГЕЦ на 7-му добу (рис. 1, г) та два піки на 14-ту добу експерименту (рис. 2, г), утім, ці три значення достовірно між собою не відрізняються. На 14-ту добу культивування ЕА КФ цього штаму дещо зсувалась у бік більш високих значень кислотності (рН 3 і 4) та розділялась за оптимальною температурою (30 і 34 °С). При цьому максимальна ГЕЦ-ак-тивність КФ штаму вЬ-1 5. Ы^Шит перевищувала неоптимізоване значення ЕА у 8,08 раза.
Залежність ЕА щодо ГЕЦ КФ штаму Аи8с-1 Б. confragosa ^ confragosa на 7-му добу культивування характеризується певною зональністю з мінімальною ГЕЦ-активністю за температур 26 та 30 °С (рис. 1, д), яка зникає на 14-ту добу експерименту (рис. 2, д), що можна пояснити пристосуванням синтетичного апарату культури до умов експерименту. На 7-му добу вирощування штаму значення ЕА вищі за встановлені на 14-ту добу культивування, максимальну ГЕЦ-активність визначено за культивування при температурі 34 °С на живильному середовищі з рН 7. Оптимізоване значення ЕА щодо ГЕЦ КФ штаму Ап8с-1 Б. confragosa ^ confragosa у 2,95 раза перевищувало значення за неоптимізованих умов.
ЕА КФ культури J-2An Р. pomaceus стосовно розчинів ГЕЦ за умов дії різних значень рН і температури не виявлено в усіх варіантах досліду (рис. 1, е та 2, е). Зважаючи на нормальний ріст штаму в культурі на картопляно-глюкозному середовищі, на середовищі Чапека з додаванням глюкози як джерела вуглецю (8 г/л) та накопичення в КФ екзогенних протеїнів у цьому разі, наявність ЕА у штаму J-2An P.рomaceus на попередньому етапі досліджень можна розглядати як артефакт, адже дані не відтворено за повторного проведення експерименту. Окрім того, втрату здатності цього штаму до розкладання целюлози взагалі та синтезу ендоглюканаз зокрема можна пояснити перебудовою ензиматичного апарату гриба, яка відбулася після введення його в культуру.
Паралельно з дослідженням загальної ЕА щодо ГЕЦ КФ досліджуваних базидіоміцетів розраховували також показники питомої ЕА. Результати розрахунків наведено на рис. 3 (7-ма доба культивування) і 4 (14-та доба експерименту). Значення питомої ЕА вищі за значення загальної активності, що свідчить про незначне накопичення протеїнів у КФ досліджуваних штамів. За умов дії різних гра-
дацій зазначених чинників питома ЕА штамів змінювалась відмінно від загальної ГЕЦ-активності, що вказує не неоднорідність накопичення протеїнів у КФ базидіоміцетів.
Для штаму К-1 I. Іа^еш як на 7-му (рис. 3, а), так і на 14-ту (рис. 4, а) добу культивування встановлено, що максимальна питома активність КФ щодо ГЕЦ припадає на близькі до граничних значень температури та рН. Абсолютний максимум питомої ГЕЦ-активності КФ цього штаму встановлено на 7-му добу культивування за температури 36 °С на живильному середовищі з рН 7. Оптимізоване значення питомої ЕА штаму К-1 I. Іа^еш перевищує неоптимізоване значення в 1,42 раза.
Питома ЕА штаму А-Дон-02 I. Іа^еш на 7-му добу культивування (рис. 3, б) відзначалась більш високими значеннями порівняно з питомою ГЕЦ-активністю цього штаму на 14-ту добу експерименту (рис. 4, б). Максимум питомої ЕА КФ штаму А-Дон-02 I. Іа^еш встановлено під час культивування за тих самих умов, що й у досліді із загальною ендоглюканазною активністю КФ цього штаму щодо ГЕЦ. За наведених умов дії фізико-хімічних чинників питома ГЕЦ-ак-тивність цієї культури в 2,52 раза перевищувала показник КФ штаму А-Дон-02 I. Іас-teus, встановлений в експерименті за неоптимізованих умов культивування.
З рис. 3, в видно, що високу питому ЕА щодо ГЕЦ у культури Д-1 I. Іа^еш виявляли на живильних середовищах з рН 8 під час культивування в межах температур 24-28 °С та на живильних середовищах з рН 7 за температур 30 °С і 34-36 °С, тобто зі зростанням температури культивування оптимальне значення початкового рН живильного середовища зсувається у більш кислий бік. На 14-ту добу культивування (рис. 4, в) така закономірність відсутня. Встановлено, що оптимальними умовами для синтезу штамом Д-1
I. Іа^еш позаклітинної ендоглюканази, здатної до гідролізу ГЕЦ, є рН 7 і температура 30 °С. Максимум питомої активності визначено на 7-му добу експерименту. Значення питомої ЕА, встановлене за оптимізованих умов, перевищує неоптимізоване у 2,63 раза.
Питома ЕА штаму вЬ-1 5. Ні^иШт як на 7-му (рис. 3, г), так і на 14-ту (рис. 4, г) добу експерименту характеризувалась низькими значеннями порівняно з іншими досліджуваними культурами грибів. Максимальне значення питомої ГЕЦ-активності, встановлене у процесі культивування на живильному середовищі з рН 5 та за температури 30 °С, перевищувало величину активності ензиму, отриману за неоптимізованих умов, у 5,22 раза.
28 t, C
рН, од
8
рН, од
t, C
t, C
рН, од
t, C
t, C
д
рН, од
Рис. 3. Питома ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 та Д-1 Irpex lacteus (а, б і в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 7-му добу експерименту
(тут і далі: П^А — питома ендоглюканазна активність)
рН, од
t, C
t, C
: рН, од
t, C
д е
Рис. 4. Питома ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 та Д-1 Irpex lacteus (а, б і в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 14-ту добу експерименту
в
в
Для штаму AnSc-1 D. confragosa f. con-fragosa встановлено аналогічну залежність питомої ендоглюканазної активності щодо гаЦ порівняно із загальною ендоглюканаз-ною активністю КФ цього штаму (рис. 3, д та
4, д). Максимальне значення питомої EА цього штаму встановлено за аналогічних умов до загальної ГОЦ-активності; оптимізоване значення в 16,6Т раза перевищувало значення активності за неоптимізованих умов.
На рис. 3, е і 4, е показано, що для культури J-2An P. pomaceus не встановлено питомої EА стосовно розчинів ^Ц за умов дії різних значень рН і температури в усіх варіантах досліду.
ЛІТЕРАТУРА
1. Shapiro T. H. America’s Energy Future: Technology and Transformation. — Washington: The National Academies Press, 2009. — 650 p.
2. Осадчая А. И., Сафронова Л. А., Авдеева Л. В. и др. Скрининг штаммов бактерий с высокой целлюлазной активностью // Мікробіол. журн. — 2009. — Т. Т1, № 5. — С. 41-48.
3. zhang Y.-H. P., Himmel M. E., Mielenz J. R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies // Biotechnol. Adv. — 2006. — N 24. — P. 452-481.
4. Жданова Н. М., Олішевська С. В., Василевсь-ка А. І. та ін. Скринінг штамів мікроміцетів, що здатні рости та руйнувати целюлозовміс-ний субстрат // Мікробіол. біотехнол. — 2008. — № 3. — С. 58-64.
5. Древаль К. Г., Бойко М. І. Нові продуценти целюлозолітичних ензимів серед вищих базидіальних грибів // Біотехнологія. — 2011. — Т. 4, № 1. — С. 8Т-92.
6. Михайлова Р. В. Мацерирующие ферменты мицелиальных грибов в биотехнологии. — Мн.: Бел. наука, 200Т. — 40Т с.
Т. Baldrian P. Enzymes of saprotrophic basidio-mycetes // Ecol. Saprotr. Basdiom. — 2008. — V. 28. — Р. 19-41.
8. Baldrian P., Valaskova V. Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi. // FEMS Microbiol. Rev. — 2008. — N 32. — P. 501-521.
9. Zhang Y.-H. P., Himmel M. E., Mielenz J. R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies // Biotechnol. Adv. — 2006. — N 24. — P. 452-481.
10. Gregg D. J., Boussaid A., Saddler J. N. Techno-economic evaluation of generic wood-to-ethanol process: effect of increased cellulose yields and enzyme recycle // Biores. Technol. — 1998. — N 63 (1). — P. Т-12.
11. Szijatro N., Siika-aho M., Tenkanen M. et al. Hydrolysis of amorphous and crystalline cellulose by heterologously produced cellulases of Melanocarpus albomyces // J. Biotechnol. — 2008. — N 136. — P. 140-14Т.
Таким чином, у результаті проведеної роботи встановлено, що для отримання найбільшого виходу позаклітинних ендоглюка-наз, здатних до гідролізу ГОЦ, штам К-1 I. lacteus слід культивувати на живильному середовищі з рН Т за температури 36 “С; А-Дон-02 I. lacteus — рН Т, 32 “С; Д-1 I. lacteus — рН Т, 30 “С; Sh-1 S. hirsutum — рН 5, 30 “С, а штам AnSc-1 D. confragosa f. confragosa — на середовищі з рН Т за температури 34 “С.
Роботу виконано за спонсорської підтримки громадської організації «Развитие» (Росія).
12. Ферментные системы высших базидиоми-цетов / Под ред. Даниляк Н. И., Семичаев-ский В. Д., Дудченко Л. Г. и др. — К.: Наук. думка, 1989. — 280 с.
13. СиницынА. П., Черноглазое В. М., ГусаковА. В. Методы изучения и свойства целлюлозолити-ческих ферментов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнол. — 1993. — Т. 25. — 152 с.
14. СиницынА. П., Гусаков А. В., Черноглазое В. М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учеб. пособие. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с.
15. Claeyssens M, van Tilbeurgh H, Kamerling J. P. et al. Studies of the cellulolytic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei QM 4914. Substrate specificity and transfer activity of endoglucanase I // Biochem. J. —
1990. — N 270. — P. 251-256.
16. Niku-Paavola M.-L., LappalainenA.,Enari T.-M. et al. A new appraisal of the endoglucanases of the fungus Trichoderma reesei // Ibid. — 1985. — N 231. — P. 75-81
17. Goyal A., Ghosh B, Eveleigh D. Characteris-tisc of fungal cellulases // Biores. Technol. —
1991. — V. 36, N 1. — P. 37-50.
18. Keilich G, Bailey P. J., Afting E. G. et al. Cellulase (P-1,4-glucan 4-glucanohydrolase) from the wood-degrading fungus Polyporus schweinitzii Fr. Part II. Characterization. // Biochim. Biophys. Acta — Enzymology. — 1969. — V. 185, N 2. — P. 392-401.
19. El Ahwany A. M. D., Mohamed E. A. H. Enzymatic hydrolysis of pseudoplastic paint thickener (hydroxyethylcellulose) by a local isolate of Aspergillus niger // Afr. J. Biotech-nol. — 2008. — V. 7 (20). — P. 3765-3770.
20. Ghose T. K. Measurement of cellulase activity // Pure Appl. Chem. — 1987. — V. 59, N 2. — P. 257-268.
21. Mullings R. Measurement of saccharification by cellulases // Enz. Microb. Technol. — 1985. — V. 7, N 12. — P. 586-591.
22. Билай В. И. Методы экспериментальной микологии. — К.: Наук. думка, 1973. — 243 с.
23. Nelson N. A photometric adaptation of the Shomogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. — 1944. — V. 153, N 2. — P. 375-379.
24. Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с англ. — М.: Мир, 1989. — 623 с.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАЗИДИОМИЦЕТОВ — АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛО-ЗОЛИТИЧЕСКИХ ЭНЗИМОВ.
ІН. ЭНДОГЛЮКАНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ФИЛЬТРАТОВ ОТНОСИТЕЛЬНО ГИДРОКСИЭТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЫ
К. Г. Древаль, М. И. Бойко
Донецкий национальный университет
Е-mail: k.dreval@gmail.com
Проведен подбор условий культивирования базидиомицетов — активных продуцентов цел-люлозолитических энзимов по показателям рН питательной среды (значения изменялись от 3 до 9 рН с интервалом 1 ед) и температуры (значения варьировали от 24 “С до 36 “С с интервалом 2 “С). Определяли активность эндоглюканазы (КФ
3.2.1.4) относительно гидроксиэтилцеллюлозы. Установлено, что оптимальной начальной кислотностью питательной среды для штаммов К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus и AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa является рН Т, а для штамма Sh-1 Stereum hirsutum — рН 5; оптимальная температура культивирования для штаммов Д-1 Irpex lacteus и Sh-1 Stereum hirsutum — 30 “С, для А-Дон-02 Irpex lacteus — 32 “С, для AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa — 34 “С, а для штамма К-1 Irpex lacteus — 36 “С. В результате оптимизации условий культивирования значения эндоглюканазной активности возросли в 1,43 раза для штамма К-1 I. lacteus, в 1Д9 раза для А-Дон-02 I. lacteus, в 2,15 раза для Д-1 I. lacteus, в
2,95 раза для AnSc-1 D. confragosa f. confragosa и в 8,08 раза для штамма Sh-1 S. hirsutum. В то же время в результате подбора условий культивирования удельная эндоглюканазная активность относительно гидроксиэтилцеллюлозы штамма К-1 I. lacteus возросла в 1,42 раза, А-Дон-02 I. lacteus — 2,52 раза, Д-1 I. lacteus — в 2,63 раза, Sh-1
S. hirsutum — в 5,22 раза и штамма AnSc-1 D. confragosa f. confragosа — в 16,6Т раза. Штамм J-2An Phellinus pomaceus не проявил эндоглюканазной активности ни в одном варианте опыта. Максимальная эндоглюканазная активность по отношению к гидроксиэтилцеллюлозе для всех штаммов установлена на Т-е сут культивирования.
Ключевые слова: базидиомицеты, эндоглюка-наза, гидроксиэтилцеллюлоза, температура культивирования, кислотность среды, оптимизация, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Phellinus pomaceus.
25. Приседський Ю. Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів: Навч. посібник. — Донецьк: Кассиопея, 1999. — 210 с.
CULTIVATION OF BASIDIOMYCETES — ACTIVE PRODUCERS OF CELLULOLYTIC ENZYMES.
HI. ENDOGLUCANASE ACTIVITY OF CULTURAL LIQUIDS TOWARDS HYDROXYETHYLCELLULOSE
К. G. Dreval, M. I. Boyko Donetsk National University Е-mail: k.dreval@gmail.com
Selection of the cultivation conditions of basidiomycetes — active producers of cellulolytic enzymes was conducted along nutrient medium initial acidity (factor was changed between 3 and 9 pH with step of 1 pH) and cultivation temperature (factor was changed between 24 and 36 “C with step of 2 “C) to increase their endoglucanase (EC
3.2.1.4) production. In the selection process endoglucanase activity was determined using hydroxyethylcellulose as a substrate. It was determined, that optimal initial acidity of the nutrient medium for strains К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lac-teus and AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. con-fragosa is Т pH, and for strain Sh-1 Stereum hirsu-tum — 5 рН; optimal cultivation temperature is 30 “С for strains Д-1 Irpex lacteus and Sh-1 Stereum hirsutum, 32 “С for strain А-Дон-02 Irpex lacteus, 34 “С for strain AnSc-1 Daeda-leopsis confragosa f. confragosa and 36 “С for strain К-1 Irpex lacteus. As a result of optimization of culture conditions the values of endoglu-canase activity increased at 1,43 times for strain К-1 I. lacteus, at 1Д9 times for strain А-Дон-02 I. lacteus, at 2,15 times for strain Д-1 I. lacteus, at
2,95 times for strain AnSc-1 D. confragosa f. confragosa and at 8,08 times for strain Sh-1 S. hirsu-tum. At the same time, as the result of selection of culture conditions, specific endoglucanase activity of strain К-1 I. lacteus was increased in 1,42 times, А-Дон-02 I. lacteus — in 2,52 times, Д-1 I. lacteus — in 2,63 times, Sh-1 S. hirsutum — in 5,22 times and AnSc-1 D. confragosa f. confrago-sа — іп16,6Т times. Culture J-2An Phellinus pomaceus haven’t shown any endoglucanase activity towards hydroxyethylcellulose in any experiment. Maximal endoglucanase activity of enzymes in cultural liquids of all strains was established on the day of cultivation.
Key words: basidiomycetes, endoglucanase, hydroxyethylcellulose, cultivation temperature, acidity of nutrient medium, optimization, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis con-fragosa f. confragosa, Phellinus pomaceus.
