CC BY
62
Кулько А.Б., Федорова Н.И., Жерносенко А.О. КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ МИКОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ МИКОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Кулько А.Б.1, Федорова Н.И.2, Жерносенко А.О.2 УДК: 616.33/.34-002.72.001.893.53
1 Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом, Москва
2 Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва
THE INTERPRETATION CRITERIA FOR LABORATORY STUDY RESULTS IN DIAGNOSIS OF OPPORTUNISTIC BRONCHOPULMONARY MYCOSES OF VARIOUS ETIOLOGY
Kulko A.B., Fedorova N.I., Zhernosenko A.O.
Микозы органов дыхания - крайне сложные для диагностики оппортунистические инфекционные заболевания грибковой этиологии, нередко с сопутствующими аллергическими реакциями. Часть возбудителей пнев-момикозов (Aspergillus flavus и ряд других Aspergillus spp. [7, 8], Fusarium spp. [8] и др.) способны продуцировать микотоксины, оказывающие токсическое действие на человека. Отсутствие характерных клинических признаков и недостаточная специфичность рентгенологических характеристик существенно затрудняют своевременную диагностику микоза легких и его дифференциальную диагностику с бактериальными и вирусными заболеваниями [4, 5]. Задачу постановки диагноза осложняет также этиологическое разнообразие [аспергиллез, зигомикоз (мукороз), кандидоз, криптококкоз, гиалогифомикоз, в том числе фузариоз, феогифомикоз и др.] и многообразие клинических инвазивных и неинвазивных форм бронхолегочного микоза [1, 2, 4, 9]. Необходимым и, как правило, решающим условием верификации микоза легких является лабораторное подтверждение грибковой природы инфекции. Однако диагностическая ценность положительных результатов лабораторных исследований различна, часто вариабельна и определяется рядом показателей: методом исследования, характером материала, видовой принадлежностью выделенного гриба-оппортуниста, его количественным содержанием и повторностью обнаружения. Из-за отсутствия на сегодняшний день единых диагностических критериев, врачи-клиницисты не располагают полной информацией о том, как следует оценивать результат, полученный тем или иным лабораторным методом.
Целью данной работы было обоснование критериев интерпретации результатов микологических и серологических исследований, получаемых при обследовании пациентов с подозрением на пневмомикоз.
Изложенные ниже критерии оценки клинической значимости результатов лабораторной диагностики бронхолегочных микозов основываются на собственных
исследованиях, проведенных в микологической лаборатории ГБУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ и подходах, описанных в ряде руководств по диагностике микозов [1-4, 8-12].
Перечислим клинически значимые методы лабораторной диагностики микозов бронхов и легких, используемые в практике медицинских лабораторий: культуральное исследование; микроскопия диагностического материала [прямое микроскопическое исследование (нативные и окрашенные препараты: окраска по Граму, калькофлюором белым и др.), гистологическое исследование биопсийного материала (окраска препаратов стандартными и специфическими красителями)] и иммунологическая (серологическая) диагностика (обнаружение антигенов и антител в сыворотке крови по стандартным методикам: иммуноферментный анализ, латекс-агглютинация).
Интерпретация результатов микробиологических (микологических) исследований
Основным клинически значимым методом лабораторной диагностики легочного микоза остается культуральное исследование диагностического материала [мокрота, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), тканевые образцы из очагов поражения и др.], с предварительным проведением первичной микроскопии взятого образца [2, 4, 9]. Специальное микологическое исследование, включающее посев и микроскопию, позволяет обнаружить возбудителя микоза в диагностическом материале, оценить его количественное содержание (мокрота, БАЛ), провести видовую идентификацию и определить чувствительность in vitro к противогрибковым препаратам. Вместе с тем, чувствительность метода посева любого диагностического материала ограничена, что может приводить к ложноотрицательным результатам, в частности, в случаях несвоевременной доставки материала в лабораторию или взятии пробы после начала лечения противогрибковыми препаратами.
Кулько А.Б., Федорова Н.И., Жерносенко А.О.
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ МИКОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Рассмотрим подробнее диагностические характеристики различного материала, поступающего в лабораторию на микологическое исследование от больных с подозрением на пневмомикоз [мокрота; материал, полученный при фибробронхоскопии (ФБС) (БАЛ, бронхиальный секрет и др.); содержимое полостных образований легких; содержимое плевральных полостей; образцы легочной ткани].
Мокрота - основной и наиболее доступный для исследования диагностический материал при подозрении на пневмомикоз. Исследования мокроты менее специфичны и информативны в сравнении с БАЛ, так как мокрота в значительно большей степени подвержена контаминации микробиотой верхних дыхательных путей. Интерпретация результата исследования мокроты зависит от видовой принадлежности и количественного содержания гриба, выделенного при посеве. Однако доступность материала позволяет проводить повторные количественные куль-туральные исследования для диагностики и контроля лечения грибковой инфекции. Выделение условно-патогенного гриба из мокроты - критерий колонизации нижних дыхательных путей данным видом гриба; для более достоверного подтверждения колонизации целесообразно повторное обнаружение гриба в образце мокроты. Важно учитывать, что положительные результаты посева мокроты могут свидетельствовать не только о колонизации, но и о вероятном развитии у пациента грибковой инфекции легких.
К признакам «вероятного» легочного микоза относят следующие результаты культурального исследования мокроты:
• выделение плесневого (мицелиального) гриба
- в норме мокрота не должна содержать плесневых грибов (Aspergillus spp., грибы родов Acremonium, Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Curvularia, Fusarum, Mucor, Paecilomyces, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis и др.). Особого внимания заслуживают случаи обнаружения грибов рода Aspergillus, наиболее вероятных возбудителей вторичных бронхолегочных микозов [4] . К группе основных возбудителей аспер-гиллеза относят A. fumigatus (главный возбудитель всех форм заболевания), A. flavus (второй по частоте возбудитель), A. niger, A. terreus; к редким возбудителям
- A. glaucus, A. nidulans, A. sydowii, A. ustus, A. versicolor и ряд других Aspergillus spp. [7, 8, 12]. Вызывать развитие легочных инфекций способны также Aureobasidium pullulans, Bipolaris spp., Curvularia lunata,Fusarium spp., Paecilomyces spp., Rhizopus arrhizus и некоторые другие плесневые грибы, причем список их пополняется [2, 8, 12];
• выделение дрожжевого гриба из рода Candida в количестве > 1 X 103 КОЕ/мл - данный результат интерпретируют также как критерий массивной колонизации нижних дыхательных путей грибами Candida. В случае увеличения содержания грибов Candida spp. в пробах мокроты в динамике риск развития у пациента
бронхолегочного кандидоза возрастает. Наиболее распространенные возбудители кандидоза - C. albicans (главный возбудитель всех форм заболевания), C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis и C. tropicalis; более редкие возбудители - C. dubliniensis, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae и другие болезнетворные Candida spp. [1, 3, 12];
• выделение дрожжевых грибов, не относящихся к роду Candida. Особого внимания заслуживают случаи обнаружения Cryptococcus neoformans (возбудитель криптококкоза), особенно у ВИЧ-инфицированных пациентов. Вызывать глубокие микозы способны также дрожжи Geotrichum candidum, Saprochaete capitata (syn. Geotrichum capitatum), Rhodotorula spp., Trichosporon spp. и некоторые другие дрожжевые грибы данной группы [2, 8, 12].
Пробы БАЛ - основной диагностический материал, высокоспецифичный при диагностике различных клинических форм бронхолегочного микоза [1, 2, 9]. Выделение любого оппортунистического гриба при посеве данного материала расценивается как признак «вероятного» легочного микоза, но не является диагностическим критерием развития инфекции [9-11]. Таким образом, выделение условно-патогенного гриба из материала, полученного при ФБС - важный признак «вероятного» легочного микоза, особенно у иммунокомпрометирован-ных пациентов с высоким риском инвазивных микозов [4]) и наиболее значимым критерий колонизации грибом нижних дыхательных путей.
Обнаружение клеток и клеточных структур грибов в образцах мокроты и БАЛ методом прямой микроскопии не имеет решающего диагностического значения при верификации пневмомикоза [5]. Положительные результаты данного исследования позволяют выявить присутствие гриба в материале до получения результатов посева, определить морфологию гриба в организме больного (дрожжевая - мицелиальная форма), важны для подтверждения и окончательной интерпретации результатов посева (обнаружение в мазке клеток и клеточных структур, характерных для вида, выделенного при посеве). При микроскопическом исследовании отмечают среднее количество элементов грибов в поле зрения препарата («единичные клетки/ клеточные структуры», «умеренно», «значительно», «обильно»), а также морфологию вегетативных и репродуктивных структур: дрожжевые клетки, почкующиеся дрожжевые клетки, фрагменты псевдомицелия, фрагменты истинного мицелия - гифы (отмечают характер септированности гиф), споры (конидии), структуры конидиального спороношения. Перечислим характерные морфологические элементы групп грибов: дрожжевые грибы - дрожжевые клетки, почкующиеся дрожжевые клетки, фрагменты псевдомицелия; плесневые грибы - гифы мицелия, споры (конидии), структуры спо-роношения (конидиальные головки Aspergillus spp. и др.).
При диагностике и лечении больных с деструктивными полостными образованиями в легких (каверны,
Кулько А.Б., Федорова Н.И., Жерносенко А.О. КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ МИКОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
туберкулемы, аспергиллемы, кисты) на микологическое исследование поступают высокоспецифичные материалы из легочных полостей (резекционный материал, пунк-ционный биоптат, аспираты, смывы). Выделение гриба из содержимого полостного образования легких имеет диагностическое значение при верификации микоза, локализованного в легочной полости (аспергиллема и др.) и сочетанных инфекций данной локализации [5, 7]. В случае обнаружения болезнетворного гриба в легочной полости целесообразно исследовать у пациента доступный диагностический материал для дифференциальной диагностики вероятного инвазивного микоза легких.
От больных с заболеваниями плевры на микологическое исследование поступает высокоспецифичный материал (аспираты, экссудаты, мазки) из патологических плевральных полостей неясной этиологии. Выделение гриба-оппортуниста из данного материала имеет диагностическое значение при выявлении грибковой или смешанной этиологии заболевания у больных с патологией плевры [5, 7].
Результаты прямой микроскопии материала из полостных образований легких и плевры являются одним из показателей активности гриба в деструктивной полости. Наибольшую значимость имеет обнаружение клеток и клеточных структур, характерных для вида, выделенного при посеве.
Образцы легочной ткани - наиболее ценный диагностический материал для верификации инвазивных форм легочного микоза. Обнаружение дрожжевого или плесневого гриба в биоптате легочной ткани, в норме стерильной, методом посева и/или микроскопически имеет диагностическое значение, подтверждающее наличие инвазивного микоза легких [2, 4, 9-11].
Отметим, что для интерпретации результатов тестирования чувствительности дрожжевых и плесневых грибов к противогрибковым препаратам используют следующие категории чувствительности: 1) S - чувствительные к препарату штаммы, 2) I - штаммы с промежуточной чувствительностью (не интерпретируются как чувствительные или устойчивые) или SDD - чувствитель-ные-дозозависимые штаммы, 3) R - устойчивые [2, 6]. В случае выделения возбудителя микоза с зависимостью от дозы препарата чувствительностью (SDD) для успешной терапии следует подбирать дозу антимикотика, превышающую среднюю терапевтическую.
Интерпретация результатов серологических исследований
Стандартизованные серологические тесты для выявления антигенов возбудителя и антител к ним разработаны только для диагностики аспергиллеза, кандидоза и криптококкоза и обладают разными диагностическими характеристиками. Клиническая значимость была доказана для методов выявления антигенов Aspergillus spp. и антител к Aspergillus spp., а также для тестов, определяющих антиген грибов Cryptococcus spp. Выявление анти-
генемии относят к признакам «вероятного» инвазивного микоза [2, 4, 10, 11].
Обнаружение в сыворотке крови циркулирующих галактоманнановых антигенов грибов Aspergillus - эффективный метод ранней диагностики инвазивного аспергиллеза. С учетом вероятности развития ложнопо-ложительных и ложноотрицательных реакций, диагностическая значимость выявления антигена Aspergillus spp. возрастает при повторном обнаружении галактоманнана и подтверждении положительного результата иммунологического исследования методом посева. При дифференциальной диагностике аспергиллемы и аллергического бронхолегочного аспергиллеза (неинвазивные формы аспергиллеза легких) диагностическую ценность приобретает определение специфических антител к грибам Aspergillus [2, 9].
Важным методом лабораторной диагностики глубоких микозов, вызванных Cryptococcus neoformans, является тест на обнаружение полисахаридного антигена капсулы гриба в сыворотке крови (диагностика криптококкоза легких) и спинномозговой жидкости (СМЖ) (диагностика криптококкового менингита). Наиболее высокая клиническая корреляция с положительной реакцией на криптококковый антиген (СМЖ) отмечена у больных СПИДом. У иммунокомпетентных больных чувствительность метода (сыворотка крови, СМЖ) снижена. Для окончательной постановки диагноза криптококкоз, в том числе и у иммунокомпрометированных пациентов, необходимо проведение дополнительных культуральных и микроскопических исследований [2, 4].
Диагностическое значение выявления в сыворотке крови антигена Candida spp. не вполне определено и вариабельно, что затрудняет интерпретацию Candida анти-генемии при дифференциальной диагностике инвазивного кандидоза, в том числе кандидозной пневмонии. Тесты на определение антител не представляют интерес для клинического применения [2, 4].
Заключение
К результатам лабораторных исследований, подтверждающим диагноз инвазивного микоза легких, относят выделение любого условно-патогенного дрожжевого или плесневого гриба из посева образца легочной ткани и обнаружение в биоптате клеток (клеточных структур) грибов при микроскопическом исследовании. Диагностическое значение имеет также результат выделения культуры гриба из содержимого легочной или плевральной полости: легочный микоз, локализованный в полости.
Выделение гриба-оппортуниста из респираторных биосубстратов (БАЛ и бронхиальный секрет, полученные при ФБС; мокрота) интерпретируют как признак «вероятного» пневмомикоза, но не расценивают как диагностический критерий развития легочной инфекции. Наиболее пристального внимания врачей-клиницистов заслуживают результаты обнаружения в данном материале грибов из группы возбудителей пневмомикозов
Кулько А.Б., Федорова Н.И., Жерносенко А.О.
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ МИКОЗОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
у иммунокомпрометированных пациентов с высоким риском развития инвазивных микозов. При интерпретации результатов культурального исследования следует учитывать, что в сравнении с мокротой, исследования материалов, полученных при ФБС, значительно более специфичны. Информативность микологического исследования мокроты при диагностике пневмомикоза возрастает при двух- и трехкратном заборе материала.
Серологические методы позволяют проводить предварительную экспресс-диагностику инвазивного аспергиллеза и криптококкоза легких; для корректной интерпретации результатов тестирования антигенемии необходимо проанализировать данные культуральных и микроскопических исследований диагностического материала на пневмомикоз.
7. Кулько А.Б. Атлас условно-патогенных грибов рода Aspergillus - возбудителей бронхолегочных инфекций. - М.: МНПЦБТ. - 2012. - 160 с.
8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. (Sutton D., Fothergill A., Rinaldi M.) Определитель патогенных и условно патогенных грибов: Пер. с англ.
- М.: Издательство Мир. - 2001. - 468 с.
9. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей.
- М.: Изд-во Бином, 2008. - 480 с.
10. Ascioglu S., Rex J.H., de Pauw B.et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus// Clin. Infect. Dis.
- 2002. - Vol. 34. - P. 7-14.
De Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P. et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46(12). - P. 1813-1821. Hoog de G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J.Atlas of clinical fungi. Electronic Version 3.1 - CBS: Reus, 2011.
11
12
Литература
1. Атлас грибковых заболеваний. Под ред. К.А. Кауфман, Д.Л. Манделла (Kauff-mann C.A., Mandell G.L.). Пер. с англ. под ред. Ю.В.Сергеева. - М.: ГЭОТАР-Ме-диа. - 2010. - 240 с.
2. Диагностика и лечение микозов. Под ред. Д. Р. Хоспентала, М. Дж. Ри-налди (D.R. Hospenthal, M.G. Rinaldi). Пер. с англ. под ред. Ю.В.Сергеева.
- М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 448 с.
3. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А., Чилина Г.А. Candida. Кан-дидозы. Лабораторная диагностика. Под редакцией з.д.н. РФ проф. Елинова Н.П. - СПб.: Коста, 2010. - 224 с.
4. Климко Н.Н.Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008. - 336 с.
5. Кулько А. Б., Дорожкова И.Р., Исаева Е.Л., Кузьмин Д.Е. Методические подходы к проведению микологических исследований во фтизиатрической практике // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - №6. - С. 56-59.
6. Кулько А.Б., Федорова Н.И. Активность in vitro противогрибковых препаратов в отношении дрожжевых грибов - возбудителей оппортунистических микозов // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И.Пирогова.
- 2015. - Т. 10. - № 4. - С. 62-64.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Кулько Александр Борисович 107014, г. Москва, ул. Стромынка д.10. e-mail: [email protected]
