CC BY
82
УДК 636.39:611.013
Криорезистентность эмбрионов коз в зависимости от стадии развития
А.-М.М. Айбазов, д.с.-х.н, проф., Т.В. Мамонтова, к.с.-х.н. ГНУ СНИИЖК Россельхозакадемии
Одним из эффективных биотехнологических приемов, направленных на сохранение генофонда высокоценных животных, является метод криоконсервации гамет. Технология замораживания спермиев различных животных достаточно хорошо разработана и успешно применяется в науке и практике животноводства, в том числе и в международных экспериментах, созданы криобанки спермы [1,2,3]. Что касается криоконсервации эмбрионов, то этот метод не нашел широкого применения в нашей стране из-за низкой приживляемости дефростированных зигот. В то же время преимущество криохранилища (банка) эмбрионов перед банком половых клеток заключается в том, что эмбрион представляет собой полноценную биологическую особь, которую достаточно пересадить самкам-реципиентам, чтобы родилось потомство.
За рубежом криоконсервация эмбрионов применяется уже несколько десятилетий (в основном в скотоводстве), однако до сих пор еще нельзя однозначно трактовать ее как эффективную биотехнологию, слишком вариабельны результаты и велик процент брака [4]. В нашей стране предпринимались попытки криоконсервировать эмбрионы крупного рогатого скота, однако не нашли широкого применения
Что же касается замораживания эмбрионов у коз, то впервые такие попытки были предприняты нами в 2011 г. При работе с определенным видом животных вдобавок к общепринятым методам криоконсервации зародышей появляется необходимость разрабатывать целый пакет репродуктивных технологий, наиболее подходящий именно для этого вида.
Методика экспериментов. Исследования проводили на опытной станции ГНУ СНИИЖК Россельхозакадемии. В половой сезон были отобраны козы - доноры. У них индуцировали полиовуляцию по оригинальной схеме: для синхронизации полового цикла в качестве пролонгаторов лютеиновой фазы использовали ушные импланты «Крестар» (действующее вещество норгестамет); для ее прерывания и стимуляции оогенеза - «Фоллигон» в дозе 500 ед. и «Оваген» в общей дозе 8 мл. Синхронность овулирования созревших фолликулов обеспечивали применением «Хорулона» - 300 ед.
В качестве среды для культивирования использовали собственную среду для криоконсервации эмбрионов коз [5]. Отмывку оттаянных ооцитов/эмбрионов после криопротектора и их дальнейшее культивирование осуществляли в той же среде.
Для замораживания отбирали оплодотворенные ооциты, эмбрионы на стадии 2-х, 4-х и более бластомер, а также эмбрионы, достигшие стадии морулы. После эквилибрации гаметы помещали в пайеты (соломинки) для замораживания спермы. Соломинки после фасовки в них гамет запаивали ультразвуком, используя для этого линию по криоконсервации 1МУ (Франция). Оттаивание пайет проводили в водяной бане при 40°С.
В эксперименте определяли устойчивость эмбрионов к криоконсервации в зависимости от их стадии развития.
Результаты исследований. В основу оценки качества эмбрионов коз была положена общепринятая классификация эмбрионов по качеству:
1-й день развития. Оценивается наличие признаков оплодотворения и качество зигот. Наличие в яйцеклетке 2-х пронуклеусов (Р^ и 2-х полярных тел (РВ) указывает на нормальное развитие процесса оплодотворения. Отмечают: размер и симметричность пронуклеусов, число, количество, равность и распределение нуклеолей, включения цитоплазмы;
2-й день развития. На 2-е сутки после слияние генетического материала сперматозоида и яйцеклетки происходит первое дробление. Отмечают: степень фрагментации, форму и относительные размеры бластомеров.
Тип А - эмбрион отличного качества без ануклеарных (безъядерных) фрагментов (4А);
Тип В - эмбрион хорошего качества с содержанием ануклеарных фрагментов до 20% (4В);
Тип С - эмбрион удовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов от 21 до 50% (4С);
Тип D - эмбрион неудовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов более 50%
3-й день развития. Эмбрион состоит из 6-8 бластомеров.
4-й день развития. Эмбрион состоит из 10-14 бластомеров, межклеточные контакты уплотняются и поверхность эмбриона сглаживается (процесс компактизации) - стадия морулы.
В процессе экспериментов были установлены следующие видовые особенности в морфологии эмбрионов коз:
- яйцеклетка и ранний эмбрион покрыты обильным слоем внутриклеточного жира. Для объективной оценки и работы с клетками необходимо их обязательное центрифугирование.
-мужской и женский пронуклеусы в оплодотворенной яйцеклетке козы одного размера, ядрышки при световой микроскопии, как правило, не различимы.
Результаты криоконсервации эмбрионов коз представлены в таблице.
Таблица 1- Результаты криоконсервации эмбрионов разного возраста
Время культивирования после дефростации Стадия развития и выживаемость эмбрионов коз
оплодотв. ооциты (п=5) 2-х бласт. эмбрионы (п=4) 4-х бласт. эмбрион ы (п=4) 6-8 бласт. эмбрионы (п=2) морулы (п=3)
Восстановление формы и размера, шт./% 5/100 3/75 3/75 0/0 2/66,6
Через 24 ч., шт./% 5/100 3/75 2/50 - 1/33,3
Через 48 ч., шт./% 3/60 2/50 2/50 - 1/33,3
Из таблицы видно, что восстановление формы и размера происходило у 100% ооцитов, в то время как все 6-8-бластомерные зародыши погибли. Через 48 часов культивирования лишь 60% ооцитов и 50% 2-4-бластомерных эмбрионов остались жизнеспособными.
В эксперименте отмечен интересный факт, требующий своего объяснения, - эмбрионы на стадии морулы снова приобретали способность переносить глубокое замораживание.
Таким образом, в результате экспериментов были установлены дополнительные критерии оценки качества и витабельности эмбрионов коз, доказана принципиальная возможность обратимого анабиоза гамет коз после криоконсервации при сверхнизких температурах (-196°С) и определены оптимальные параметры режима криоконсервации. Наилучшая устойчивость к криоконсервации была отмечена у ооцитов и 2-4-бластомерных эмбрионов, а также у морул. Для того чтобы удостовериться в жизнеспособности эмбрионов, рекомендуем культивирование эмбриона/оплодотворенной яйцеклетки в инкубаторе в 5% СО2 в течение 1 суток при 39оС. Если эмбрион продолжает развитие, он считается пригодным для криоконсервации.
