CC BY
96
У ПРОГРАММА РОССИЙСКО-АМЕРИКАНСКОГО НЕПРЕРЫВНОГО ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО НЕФРОЛОГИИ
©Ашоть, 1997 -
© А.Коэн, 1997 УДК 616.61-076.001.81
А. Коэн
КРАТКИЙ ОБЗОР МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОСНОВНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В БИОПТАТАХ ПОЧЕК
А.Н. Cohen
OVERVIEW OF BASIC PATHOLOGIC PROCESSES AND METHODS OF EVALUATION OF RENAL BIOPSY
Медицинский факультет Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, США
Ключевые слова: почки, биопсия, клубочек, методы окрашивания, световая микроскопия, иммуногистохимия, электронная микроскопия.
Key words: kidney, biopsy, glomerulus, histochemical stains, light microscopy, immunohistochem-istry, electron microscopy.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ
Приготовление препаратов почек имеет свои особенности, что обусловлено уникальностью структуры и особенностями патологии почек. Для анализа изменений в клубочках следует применять несколько разных гистохимических методов и делать более тонкие срезы, чем при исследовании других тканей. Результаты окрашивания получаются лучше при использовании спиртового фиксатора Буэна (Dubosq-Brasil).
Чтобы разобраться в структуре и патологии клубочка, необходимо провести избирательное окрашивание компонентов экстрацеллюлярно-го матрикса (базальной мембраны и мезанги-ального матрикса). Окраска гематоксилин-эозином на парафиновых срезах не дает возможности достаточно четко отличить экстрацеллю-лярный матрикс от цитоплазмы клеток. Выделить экстрацеллюлярный материал позволяют следующие методы: ШИК, он же PAS (реакция с Шифф-йодной кислотой или Periodic acid-Schiff, соответственно), PASM (periodic acid-methenamine silver; Jones) — серебрение no Джонсу и трехцветная окраска по Массону (Masson's trichrome) (табл. 1).
По методу ШИК базальные мембраны клу-бочковых капилляров, мезангиальный матрикс и базальные мембраны канальцев окрашиваются в красный цвет (ШИК-положительные), при серебрении по Джонсу те же компоненты окрашиваются в черный цвет, давая четкий контраст между положительно и отрицательно окрашивающи-
мися структурами. Мы предпочитаем трехцветную окраску по Массону с использованием анилинового синего: при помощи этого метода экстрацеллюлярный матрикс клубочка и базальные мембраны канальцев окрашиваются в синий цвет, и их легко отличить от клеток и «ненормального» материала, накапливающегося в патологических условиях. Реакцию с конго красным, окрашивание эластической ткани и другие методы окраски следует применять по показаниям. Толщина срезов для всех красок, кроме конго красного, должна быть не более 2—3 мкм, так как признаки патологии клубочков, особенно это касается клеточности, принято оценивать именно при такой толщине срезов.
Каждый метод окрашивания имеет свои преимущества и недостатки, и при исследовании почечной ткани, особенно биопсий, как правило, применяют все эти методы.
Для диагностики заболеваний клубочков необходимо иммуногистохимическое исследование почечной ткани. Для выявления иммуноглобулинов, комплемента (С), фибрина и других иммунных субстанций в почечной ткани и определения их локализации применяют иммуно-флюоресценцию. При исследовании биопсий-ного, а, при наличии показаний, и другого материала из почечной ткани, мы используем обработанные флюоресцеином антитела к 1§С, 1§А, Ц;М, С1я, СЗ, альбумину, фибрину, каппа и лямбда легким цепям иммуноглобулинов. Положительная флюоресценция в клубочках может быть гранулярной или линейной. При
Том 1 • Ns 4
ПРОГРАММА НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО НЕФРОЛОГИИ
Таблица 1
Характер окрашивания различных структур почек
Структура Метод окрашивания
Гематоксилин—эозин ШИК (РАЗ) РАЭМ (по Джонсу)
Базальные мембраны капилляров клубочков и базальные мембраны канальцев Розово-красные Карминно-красные Черные
Мезангиальный матрикс Розово-красный Карминно-красный Черный
Коллаген интерстициального типа Розово-красный Светло-розовый Серый
Цитоплазма эндотелиальных, мезангиальных, Розовая зернистая Чисто розовая Серо-розовая
гладкомышечных и эпителиальных клеток
Белковый материал (отложения) Розовые или Гомогенные бледно- или Гомогенные розовые
ярко-красные ярко-розовые, или отрицательное окрашивание или отрицательное окрашивание
Фибрин Розовый или Слабо положительное Розовый или
ярко-красный или отрицательное окрашивание отрицательное окрашивание
Ядра Темно-синие Темно-синие Темно-синие
электронной микроскопии эквивалентом гранулярных отложений, независимо от механизма их появления, являются экстрацеллюлярно расположенные массы электронно-плотного материала. Гранулярные отложения можно увидеть и при световой микроскопии при трехцветной окраске по Массону, где они выглядят как ярко фуксинофильные (оранжевые или оранжево-красные) гомогенные структуры (табл. 2). При линейном свечении не всегда есть четкое соответствие со светомикроскопической и ультраструктурной картиной.
Для исследования почечной ткани применяют также электронную микроскопию. При диагностике заболеваний клубочков этот метод позволяет уточнить расположение депозитов и обнаружить очень мелкие депозиты, а также выявить повреждение структуры клеток. Имму-нофлюоресценция и электронная микроскопия могут быть полезны также для диагностики изменений канальцев, интерстиция и сосудов.
ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
СТРУКТУРЫ ПОЧЕК
Клубочки
Термины для описания выраженности изменений в клубочках представлены ниже.
В препарате Очаговые Изменены не все клубочки изменения во изменения (обычно менее 50% от многих клубочках общего числа клубочков)
Диффузные Изменены все или почти изменения все клубочки
Изменения в Сегмен- Изменена часть клубочка одном клубочке тарные
изменения
Глобальные Изменен весь клубочек изменения
Таблица 2 Гранулярные иммунные отложения в клубочке
Метод Вид
Иммунофлюо- Гранулярные отложения в мезан-
ресценция гии и вдоль петель капилляров
Электронная Экстрацеллюлярные электронно-
микроскопия плотные отложения
Световая микроскопия Ярко фуксинофильные отложения
Гиперклеточность. Гиперклеточность может быть вызвана как увеличением числа собственных клеток клубочка (мезангиальных и эндоте-лиальных), так и накоплением лейкоцитов в просветах клубочковых капилляров, под эндо-телиальными клетками или в мезангии. Хотя это не совсем корректно, при увеличение числа клеток в сосудистом клубочке (tuft) обычно говорят о пролиферативном гломерулонефрите. Скопление клеток в мочевом пространстве называется полулунием.
Увеличение экстрацеллюлярного матрикса означает расширение мезангиального матрикса или утолщение базальной мембраны. Расширение матрикса может быть диффузным — примерно в одинаковой степени во всех дольках — или же в виде узелков. Утолщение базальной мембраны лучше оценивать при электронной микроскопии.
Склероз означает увеличение количества экстрацеллюлярного матрикса с облитерацией просветов клубочковых капилляров, когда весь клубочек или его часть выглядят как плотная масса. Развитие склероза в клубочке может быть связано как с накоплением коллагена в мочевом пространстве и облитерацией последнего, так и с увеличением экстрацеллюлярного матрикса в сосудистом клубочке. Термин «гло-
ПРОГРАММА НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО НЕФРОЛОГИИ
Нефрология • 1997
мерулосклероз» подразумевает, что клубочек склерозирован полностью. Термином «сегментарный гломерулосклероз» обозначают совершенно другой патологический процесс, кроме того, он входит в название одного из заболеваний клубочков. При сегментарном гломеруло-склерозе (или сегментарном склерозе) изменена только часть капиллярных петель — просветы капилляров облитерированы за счет увеличения экстрацеллюлярного матрикса и/или за счет инсудативных изменений (больших преципитатов белков плазмы).
Полулуние — это скопление клеток и экстрацеллюлярного материала в мочевом пространстве. Полулуния возникают в результате тяжелого повреждения стенок клубочковых капилляров с нарушением их целостности и «проливанием» фибрина из поврежденных капилляров в мочевое пространство. Это приводит к пролиферации клеток париетального и, возможно, висцерального эпителия и накоплению моноцитов и других клеток крови в мочевом пространстве. Клеточный состав полулуний может быть различным в зависимости от типа заболевания и от того, повреждена базальная мембрана капсулы клубочка или нет. Полулуния обычно подвергаются организации. Если полулуние состоит из клеток и коллагена, оно называется фиброзно-кпеточным, если представлено только коллагеном в мочевом пространстве — фиброзным. При организации полулуний петли клубочковых капилляров часто спадаются и деформируются.
Миграция на периферию и интерпозиция ме-зангия. При некоторых заболеваниях мезанги-альные клетки и часто матрикс мигрируют из центральной части сосудистого клубочка на периферию по ходу капиллярных петель между эндотелием и базальной мембраной. При этом стенка клубочкового капилляра выглядит утолщенной и двухслойной. По ходу петли капилляра видны два слоя экстрацеллюлярного матрикса с одинаковыми тинкториальными свойствами: базальная мембрана и полоска ме-зангиального матрикса, расположенная между эндотелиальными клетками и мигрировавшими мезангиальными клетками (интерпозиция мезангия). Такой двухслойный или двухконтур-ный вид могут иметь, в зависимости от характера заболевания, отдельные петли или все капилляры клубочка.
Изменения клеток висцерального эпителия оцениваются при электронно-микроскопическом исследовании. При потере белка через стенку клубочковых капилляров меняется форма клеток; ножковые отростки сокращаются и разбухают, становятся неразличимыми —
сплошная масса цитоплазмы покрывает базаль-ные мембраны клубочковых капилляров. Это — утрата или слияние ножковых отростков. Хотя ножковые отростки, принадлежащие расположенным рядом разным клеткам, и выглядят слившимися, в действительности клетки не сливаются, что доказано при сканирующей электронной микроскопии.
Канальцы
Атрофия канальцев приводит к неравномерному утолщению и сморщиванию базальных мембран канальцев еще до уменьшения размеров канальцев, поэтому утолщенные и сморщенные базальные мембраны, как правило, расцениваются как признак атрофии канальцев.
Цилиндры. Цилиндры в канальцах состоят преимущественно из белка Тамм—Хорсфал-ла — мукопротеина, продуцируемого клетками толстой восходящей части петли Генле. И в физиологических, и в патологических условиях этот белок может оседать в просветах канальцев с образованием цилиндров в дистальных отделах нефрона. Он может попадать в мочу в виде гиалиновых цилиндров. Белок Тамм— Хорсфалла лучше виден на срезах, окрашенных по методу ШИК (PAS), где он дает резко положительную реакцию. При патологии белок Тамм—Хорсфалла можно обнаружить в нетипичных местах (проксимальные отделы нефрона, интерстиций, сосуды).
Интерстиций
Острые процессы в интерстиции определяются наличием отека — на срезах, окрашенных по методу ШИК (PAS) или PASM, канальцы выглядят нормальными, но они как бы раздвинуты. «Нормальные» канальцы идентифицируют по неизмененной базальной мембране. Хронические процессы в интерстиции характеризуются фиброзом и сопровождаются атрофией канальцев. Острый или хронический процесс в интерстиции не определяется по типу клеток воспаления (сегментно-ядерные лейкоциты или лимфоциты).
Артерии и артериолы
Изменения артерий и артериол за несколькими исключениями (тромботическая микроан-гиопатия, склеродерма) не являются специфичными для почек.
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК
Иммунные. Многие клубочковые, а также некоторые тубулоинтерстициальные и сосуди-
Том 1 • № 4
ПРОГРАММА НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО НЕФРОЛОГИИ
стые повреждения являются иммуноопосредо-ванными. Это может быть результатом как антительных, так и клеточных реакций. При заболеваниях у человека конкретная причина или антигенный стимул для иммунной реакции в большинстве случаев неизвестны.
Большинство гломерулопатий развиваются в результате антительно опосредованного повреждения: как вследствие взаимодействия антитела с антигеном — компонентом клубочка, так и в результате соединения антитела с каким-либо антигеном in situ или в кровотоке с последующим отложением иммунных комплексов в клубочке.
Антигены в циркулирующих иммунных комплексах могут быть эндогенного или экзогенного происхождения. Эндогенные антигены возникают при таких заболеваниях, как системная красная волчанка (СКВ), и ими могут стать компоненты ядра — ДНК, гистоны и т.п. Экзогенные — это обычно антигены различных микроорганизмов — продукты бактерий, антигены вирусов гепатита В и С, антиген малярии и т.п. Циркулирующие иммунные комплексы улавливаются или откладываются в клубочках — в ме-зангии или субэндотелиально на петлях капилляров, реже — субэпителиально. Точно определить локализацию депозитов можно только при электронной микроскопии. Для части заболеваний характерны отложения преимущественно с одной стороны базальной мембраны, в то время как при других заболеваниях бывают отложения более, чем одной локализации. Если откладываются иммунные комплексы, то происходит фиксация комплемента, а затем инфильтрация лейкоцитами. Клетки белой крови накапливаются в просветах капилляров и инфильтрируют мезан-гий. Собственные мезангиальные клетки могут делиться и мигрировать на периферию. Лейкоциты, видимо, частично отвечают за удаление отложившихся иммунных комплексов. Названия многих заболеваний клубочков, диагностические критерии, а также прогноз и лечение зависят от правильной идентификации и определения локализации иммунных комплексов.
Другой механизм антительно опосредованного повреждения связан с образованием иммунных комплексов in situ, что бывает принципиально в двух ситуациях:
I) антитело может быть направлено против компонента клубочка, например, участка базальной мембраны, или против какого-либо компонента клетки, например, висцерального эпителия;
. 2) антиген может поступить из кровотока и осесть в клубочке, с ним связывается антитело, и это приводит к местному формированию иммунного комплекса.
Антитела, направленные против компонентов базальной мембраны, при заболеваниях у человека называются антителами к гломеруляр-ной базальной мембране (анти ГБМ-антитела) и при флюоресценции дают линейное свечение. Осевшие антигены у человека и антигены эпителиальных клеток у экспериментальных животных, соединяясь с антителами in situ, дают гранулярное свечение, как и при отложении циркулирующих иммунных комплексов. Как правило, это гранулы одного размера, чаще на петлях капилляров; при этом при электронной микроскопии выявляются субэпителиальные электронно-плотные депозиты. Мезангиальные или субэндотелиальные депозиты встречаются при образовании иммунных комплексов in situ чрезвычайно редко.
Клеточно опосредованный иммунный ответ при заболеваниях почек у людей встречается при остром лекарственном интерстициальном нефрите.
Неиммунные. Есть несколько основных механизмов повреждения клубочков.
Повреждение клеток висцерального эnumeJluя клубочков: при широком спектре воздействий происходит набухание клеток; отдельные ножко-вые отростки нельзя дифференцировать, происходит их «слияние». Далее повреждение приводит к вакуолизации, накоплению белка в лизосо-мах (белковые капли в результате реабсорбции) и отделению клеток от базальной мембраны.
При значительном уменьшении числа функционирующих нефронов возникает гипертрофия оставшихся нефронов. Это установлено на экспериментальных моделях и считается, что такие же изменения развиваются при заболеваниях почек у человека. Гипертрофия клубочков сопровождается повышением давления в клу-бочковых капиллярах, повышением системного артериального давления, возрастанием клубоч-ковой фильтрации. Сначала это носит приспособительный характер, а впоследствии приводит к развитию сегментарного склероза клубочков. Вероятно, что именно так происходит прогрес-сирование многих заболеваний почек независимо от исходного поражения.
Механизм повреждения канальцев и интер-стиция. Как было сказано выше, в некоторых случаях поражение интсрстиция может быть иммуноопосредованным. Однако, в отличие от клубочков, поражение интерстиция чаше развивается при воздействии токсинов, обструкции мочевыводяших путей и ишемии почки.
Перевод с английского И. Б. Варшавской
