CC BY
29
УДК 612.398.145.1:615.711.17] - 092.9 O.A. Лебедько, С.С. Тимошин
КОРРИГИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В СИСТЕМЕ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ НА ФОНЕ ПОВТОРНОЙ БЛОКАДЫ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА, ИНДУЦИРОВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ L-NAME (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск
В патогенезе бронхолегочных заболеваний основная роль принадлежит интегративной нейроиммуно-эндокринной системе, в том числе ее пептидергичес-кой составляющей, контролирующей процессы роста, развития и регенерации органов дыхания [15]. Центральные и периферические механизмы эндогенной пептидергической системы, регулирующие процессы морфофункционального становления органов дыхания млекопитающих, начинают действовать на ранних этапах онтогенеза [12]. В воздухоносных путях эффекты регуляторных пептидов (РП) опосредуются комплексом каскадов внутриклеточной и межклеточной сигнальной трансдукции, регулирующей как кратковременные, так и долговременные биологические эффекты (морфогенетические в том числе). Оксид азота (N0), как и любой другой вид активных кислородных метаболитов (АКМ), участвует в процессах передачи сигнала. Нарушение конститутивного синтеза N0 играет важную роль в развитии брон-хообструктивного синдрома и патологическом ремо-делировании гладкомышечного слоя слизистой воздухоносных путей на ранних этапах онтогенеза.
Цель настоящей работы — исследовать влияние представителей различных семейств РП- атриального натрийуретического пептида (семейство вазоактивных пептидов) и даларгина (семейство опиоидных пептидов) на ДНК-синтетическую активность гладких мио-цитов бронхов, а также биогенез активных кислородных метаболитов в легких и крови новорожденных белых крыс в условиях блокады синтеза азота.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на новорожденных белых крысах. Вещества вводили в/брюшинно, ежедневно со 2 но 6 сут жизни. Крысы 1 группы получали атриальный натрийуретический пептид (1-28) или Н-Ser-Leu- Arg-Arg-Ser-Ser- Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gin-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OII в дозе 3,2x108 М/кг; животные 2 группы — даларгин или D-Ala2-Leu5-Arg6-enkephalin в дозе 1,4x107 М/кг; животные 3 группы — L-NAME или N G- nitro-L-arginine methyl ester ("ICN Biomedicals Inc.") в дозе 9,3x105 М/кг.
Крысам 4 и 5 групп в вышеуказанных дозах вводили L-N AME и через 30 мин — либо атриальный на-
Резюме
Пятикратное введение L-NAME (в/брюшинно, в дозе 9,3x10'5 М/кг ежедневно, с 2 по 6 сут постнатального развития) стимулировало ДНК-синтетическую активность гладких миоцитов в бронхах белых крыс на фоне активации процессов свободнорадикального окисления в легких. Атриальный натрийуретический пептид (вводимый через 30 мин после инъекции L-NAME) в дозе 3,2x108 М/кг отменял эффекты L-NAME, в то время как даларгин (вводимый в аналогичном режиме) в дозе 1,4x107 М/кг ослаблял.
О.A. Lebedko, S.S. Timoshin
CORRECTIVE EFFECTS OF REGULATING PEPTIDES IN RESPIRATORY SYSTEM ORGANS AT REPEATED NITRIC OXIDE SYNTHESIS BLOCKING, WHICH WAS INDUCED BY L-NAME INJECTIONS (IN EXPERIMENT)
Khabarovsk Subsidiary of State Organization Far-Eastern Research Center of Respiratory Pathology and Physiology Siberian Branch Russian Academy of Medical Sciences -Mother And Child Care Institute; Far Eastern State Medical University, Khabarovsk
Summary
Fivefold intraperitoneal administration of L-NAME (9,3x103 M , kg-1, d-1) for 5 days (from 2 to 6 days of postnatal life) stimulated DNA-synthetic activity of bronchial smooth myocytes on background of activation of free radical oxidation in lungs of neonate white rats. Atrial natriuretic peptide (injected in analogical regime, in 30 minutes after injection of L-NAME) in doses 3,2x108 M, kg', d1, abolished effects of L-NAME. Dalargin (injected in analogical regime) in doses 1,4х10"7 M, kg1, d"1, weakened effects of L-NAME.
трийуретический пептид (4 группа), либо даларгин (5 группа).
Животным 6 группы инъецировали изотонический раствор ЫаС1. Крыс декапитировали через 24 ч после заключительного воздействия. Процессы синтеза ДНК исследовали методом радиоавтографии. За
1 час до эвтаназии крысам в/брюшинно вводили ЗН-
SSfMMMi
Таблица 2
Таблица 1
Влияние АНН и даларгина на синтез ДНК в гладких миоцитах бронхов новорожденных белых крыс (М±т)
Показатель ИМЯ, %
Контроль 0,526±0,034
L-NAME 0,854±0,071*
АНП 0,255+0,024*
L-NAME+AHH 0,504±0,045
Даларгин 0,550+0,048
L-NAM Е+даларгин 0,665+0,039*, **
Примечание. * — р<0,05 но отношению к îpynne контроля, ** р<0,05 по отношению к группе "L-NAME".
Влияние АНН и даларгина на показатели спонтанной и Ре2+-индуцированной хемилюминесценции гомогенатов легких (Л) и сыворотки крови (К) новорожденных белых крыс (М±ш)
Показатель Ssp, отн.ед. h, отн.ед. Sind, отн.ед.
Контроль Л 6,27±0,20 0,086±0,002 44,48+1,75
К 19,42±0,50 0,125+0,007 99,32+4,25
L-NAME л 15,14+0,63* 0,145+0,005* 85,49±2,37*
к 28,83+1,31* 0,268±0,0012* 184,89+3,79*
АНП л 6,50+0,22 0,080±0,005 58,2612,56*
к 19,78±0,78 0,114±0,008 125,90+2,95*
L-NAME + АНП л 6,94±0,25 0,092±0,005 55,60±2,71*
к 20,27+0,75 0,142±0,010 132,70+3,96*
Даларгин л 5,13+0,12* 0,082±0,004 35,25±1,16*
к 14,40±0,45* 0,117+0,010 73,03+2,50*
L-NAME +даларгин л 9,48±0,35*** 0,109+0,003*** 56,62+1,53*-**
к 22,72±0,60*** 0,152+0,012*'** 122,16±3,18*'**
Примечания. * — р<0,05 по отношению к группе контроля; ** — р<0,05 по отношению к группе "L-NAME".
тимидин (молярная активность -1570 ТБк/М) в дозе 1 мкКи/г. Радиоавтографы готовили по стандартной методике. Подсчитывали количество клеток, находящихся в S-периоде (индекс меченых ядер — ИМЯ,%) в гладких миоцитах бронхов.
Для интегральной оценки процессов биогенеза АКМ в легочных гомогенатах и сыворотке крови использовали метод хемилюминесценции (ХМЛ). Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50В "PERKIN ELMER". Сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы "Finlab". Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХМЛ исследовали по методу Ю. А. Владимирова и др. [2]. Определяли: светосумму за 1 мин спонтанной ХМЛ (S sp), величина которой коррелирует с интенсивностью процессинга АКМ; максимум быстрой вспышки (h) индуцированной ХМЛ, свидетельствующей о содержании гидроперекисей липидов, светосумму (S ind) за 4 мин после "быстрой" вспышки, отражающую скорость образования перекисных радикалов. Кинетику ХМЛ, инициированную Н202 в присутствии люминола [1, 11], анализировали по трем параметрам: максимуму первой вспышки (HI), указывающему на интенсивность радикалообразования в реакциях, подобной реакции Фентона; максимуму второй вспышки (Н2), свидетельствующему об активности антирадикальной защиты; временному интервалу вспышек между H1 и Н2, продолжительность которого зависит от состояния антиоксидантной системы. Показатели ХМЛ рассчитывали на 1 мг липидов, выражали в относительных единицах. Концентрацию общих липидов определяли фосфованилиновым методом с помощью тест-наборов "LACIIEMA". Полученные данные были статистически обработаны с использованием t-критерия Стыодента.
Результаты исследования
L-NAM Е является представителем группы производных L-аргинина с заместителями в аминогруппе гуанидинового фрагмента аминокислоты и считается преимущественным ингибитором конститутивных NOS. Так, по данным R. Boer et al. [6], в исследованиях которых были протестированы различные ингибиторы NOS-активности по аффинитету и селективности к известным на сегодняшний день изоэнзимам
NOS, L-NAME продемонстрировал способность селективно ингибировать конститутивные изоформы NOS (eNOS и nNOS).
При воздействии L-NAME наблюдалось увеличение ДНК-синтетической активности гладких миоци-тов бронхов: ИМЯ гладких миоцитов повышался в 1,6 раза (табл. 1). Анализ ХМЛ-показателей (табл. 2, 3) продемонстрировал, что L-NAME интенсифицировал генерацию АКМ: в легких и крови величина S sp возросла в 2,4 и 1,5 раза соответственно. Значительный вклад в этот процесс вносят: гидроперекиси липидов (h увеличилась в 1,7 в легких, в крови — в 2,1 раза), ускорение образования перекисных радикалов (S ind возросла в легких и крови в 1,9 и 1,8 раза соответственно), накопление гидроксил-радикалов (Н1 увеличилась в 5,3 раза в легких, в крови — в 2,5 раза). Выявленные нарушения свободнорадикального статуса обусловлены ослаблением антиоксидантной и антирадикальной защит — в легких и крови t снизилось в 1,6 и 1,6 раза соответственно, Н2 возросло в 1,7 и 2,8 раза соответственно.
Таким образом, последствием воздействия L-NAME было развитие оксидативного стресса как на органном уровне (в легких), так и на уровне организма в целом. Увеличение при этом ДНК-синтетической активности гладких миоцитов отражает типичную реакцию гладкомышечной ткани респираторного тракта на оксидативный стресс.
Атриальный натрийуретический пептид (1-28) (или АНП) является представителем семейства ва-зоактивных пептидов. На ранних этапах онтогенеза АНП активно синтезируется эпителием респираторного тракта, и, как и оксид азота, АНП обладает выраженным релаксирующим эффектом в отношении базального и стимулированного тонуса воздухоносных путей [13]. Введение АНП на базовом фоне активности NO-синтетических процессов снижало количество ДНК-синтезирующих ядер гладких миоци-
Таблица 3
Влияние АНП и даларгина на показатели Н202-индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции гомогенатов легких (Л) и сыворотки крови (К) новорожденных белых крыс (М±ш)
Показатель HI, отн.ед. t, мин Н2, отн.ед.
Контроль Л 0,138±0,007 0,84+0,04 0,473±0,023
К 0,375±0,012 0,73±0,03 1,126+0,040
L-NAME Л 0,742±0,005* 0,52+0,02* 0,794±0,048*
к 0,920±0,027* 0,45±0,03* 3,170+0,063*
АНП л 0,144±0,005 0,96±0,06 0,350±0,018*
к 0,400+0,016 0,80±0,05 0,773±0,038*
L-NAME I АНП л 0,155±0,008 0,75±0,03 0,522±0,034
к 0,367±0,015 0,75+0,06 1,220+0,047
Даларгин л 0,129±0,004 0,99±0,03* 0,338±0,028*
к 0,352±0,013 1,05+0,04* 0,517+0,023*
L-NAME + даларгин л 0,178±0,005*** 0,69±0,04* ** 0,636+0,012* **
к 0,480±0,015* ** 0,61 ±0,02* ** 1,329±0,042***
Примечания. * — р<0,05 по отношению к группе контроля: ** — р<0,05 по отношению к группе "L-NAME".
тов, о чем свидетельствует падение величины ИМЯ более чем в 2 раза (табл. 1). При этом анализ показателей ХМЛ выявил, что воздействие повышает уровни S ind (в легких — в 1,31 раза и в крови — в 1,26 раза) и снижает Н2 (в легких — в 1,35 раза, в крови — в 1,45 раза) (табл. 2, 3). Полученные нами данные об ингибирующем влиянии АНП на ДНК-синтетическую активность гладких миоцитов респираторного тракта новорожденных белых крыс подтверждаются результатами экспериментов in vitro — на культуре гладких миоцитов воздухоносных путей человека [7].
AHI1, вводимый на фоне воздействия L-NAME, предотвратил увеличение количества гладких миоцитов, находящихся в S-периоде клеточного цикла: ИМЯ не отличался от аналогичного показателя в контроле (табл. 1). В этих условиях AHI1 нивелировал эффекты L-NAME и в отношении большинства исследуемых XMJI-показателей (табл. 2, 3). Исключение составляла лишь величина S ind: скорость генерации перекисных радикалов достоверно превышала контрольные уровни в легких в 1,25 раза, в крови — в 1,34 раза. При введении АНГ1 баланс между окисляющими и восстанавливающими компонентами сво-боднорадикального статуса легких и крови сохранялся на базальном уровне и на фоне предварительного воздействия L-NAME.
Об уникальной роли АНГ1 в поддержании физиологического уровня продукции N0 и предупреждении цитотоксического эффекта самого N0 и его метаболитов свидетельствует ряд данных [9, 10]. Надо полагать, что и в нашем эксперименте корригирующий эффект АНП в условиях применения L-NAME в определенной степени обусловлен вовлечением пептида в регуляцию биогенеза NO, способствующую оптимизации уровня продукции этой сигнальной АКМ-молекулы и ее метаболитов. Следует отметить,
что АНП эффективно использовался в качестве кар-диопротектора при ишемии миокарда, причем защитное действие имело выраженный МО-зависимый характер [14].
Таким образом, при введении АНП наблюдалась нивелировка последствий воздействия Ь-МАМЕ на синтез ДНК в гладких миоцитах и на биогенез АКМ в легких и крови.
Преимущественный агонист 5-рецепторов - далар-гин является синтетическим аналогом лей-энкефали-на. В отличие от АНП, введение даларгина на фоне базальной продукции оксида азота не влияло на количество ДНК-синтезирующих гладких миоцитов: ИМЯ был стабилен относительно контроля (табл. 1). При этом даларгин продемонстрировал выраженные антиоксидантные антирадикальные свойства. ХМЛ-анализ выявил (табл. 2,3) угнетение процессов образования АКМ в легких и крови, о чем свидетельствует статистически значимое снижение Б яр в 1,22 и 1,35 раза соответственно. Параллельные однонаправленные изменения величин, характеризующих скорость образования перекисных радикалов, активность ан-тиоксидантной и антирадикальной систем, также выявлены на двух уровнях — органном и организма в целом. В сравнении с контрольными значениями, зарегистрированы достоверные изменения в легких и крови, соответственно: Б — снижение в 1,26 и 1,36 раза, I — увеличение в 1,18 и 1,44 раза, Н2 — снижение в 1,40 и 2,18 раза.
Введение даларгина на фоне воздействия Ь-МАМЕ привело к тому, что хотя численность гладких миоцитов, находящихся в Б-периоде клеточного цикла, превышала базальный уровень (ИМЯ было выше, чем в контроле в 1,3 раза), но выраженность изменений этого показателя была достоверно ниже в сравнении с группой "Е-ЫАМЕ" (табл. 1). Анализ ХМЛ-кинетики продемонстрировал (табл. 2,3), что на фоне воздействия Ы^АМЕ даларгин обладает выраженным ингибирующим эффектом в отношении процессов свободнорадикального окисления и стимулирующим — в отношении систем антиокси-дантной и антирадикальной защиты. Хотя ни один из исследуемых ХМЛ-показателей легких и крови не достиг контрольного уровня, но все они значительно приблизились к нему, достоверно изменившись в сравнении с показателями группы животных, получавших Ь-ИАМЕ без коррекции. Свойство 6-агонистов, даларгина в том числе, повышать устойчивость других тканей, в частности миокарда, к ок-сидативному стрессу продемонстрировано в работах Л.Н. Маслова, Т.Ю. Реброва и др. [4, 5]. Интересно, что, по мнению Ю.Б. Лишманова и соавт. [3], высказанному в отношении возможных механизмов кар-диопротекторпого действия даларгина при холодо-вом стрессе:"... эффекты синтетического энкефали-на (даларгина) лишь имитируют эволюционно выработанную физиологическую функцию эндогенных опиоидных пептидов, направленную на ограничение чрезмерной стресс-реакции и предупреждение возникновения "болезней адаптации". Данные литературы свидетельствуют о способности 5-агонистов модулировать продукцию N0 [8]. Учитывая этот факт, а также установленные нами свойства далар-
гина активно участвовать в процессах биогенеза АКМ, уместно предположить, что, как и при применении АНП, NO-эффект имеет место и в этом случае.
Таким образом, АНП нивелировал, а даларгин ослаблял последствия блокады синтеза оксида азота. В настоящее время молекулярные структуры пептидной природы считаются одной из самых перспективных основ для создания нового поколения лекарственных средств. Выявленные в данном эксперименте свойства АНП и даларгина ингибировать проли-феративный ответ гладких миоцитов и купировать развитие оксидативного стресса могут быть использованы при разработке новых методов профилактики и коррекции гиперреактивности и патологического ремоделирования воздухоносных путей на ранних этапах онтогенеза.
Литература
1. Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е,, Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: Мет. рек. СПб., 2000.
2. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // ВИНИТИ АН СССР: Итоги науки и техники. Сер. биофизика. М., 1991. Т. 29.147 с.
3. Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Маслов Л.Н. // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. Вып. 3. С. 227-231.
4. Маслов Л.Н., Реброва Т.Ю. // Эксперим. и клин, фармакология. 2000. Т. 63, №3. С. 24-28.
5. Реброва Т.Ю., Маслов Л.Н., Лишманов Ф.Н. и др. // Рос. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2001. Т. 87. №5. С. 628-641.
6. Boer R., Ulrich W.R, Klein Т. et al. // Mol. Pharmacol. 2000. Vol. 58, №5. P. 1026-1034.
7. Hamad A.M., Jonson S.R., Knox A.J. // Am. J. Physiol. 1999. Vol.277, №5. P. L910-918.
8. Khavandgar S., Homayoun H., Dehpour A. // Neurosci Lett. 2002. Vol. 329, №2. P. 237-240.
9. Kiemer A.K., Vollmar A.M. //J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, №22. P. 13444-13451.
10. Kiemer A.K., Vollmar A.M. // Immunol. Cell Biol. 2001. Vol. 79, №1. P. 11-17.
11. Kuzmenko A. I. //West. Med. J. 1999. Vol. 71, №4. P. 63-66.
12. LiuJ., Dong C„ Cazin L. et al. // Brain Res. Dev. Brain. Res. 2001. Vol. 126, № 2. P. 211-215.
13. Mikawa K., Kume H., Takagi K. // Arzneimittel-forschung. 1998. Vol. 48, № 9. P. 914-918.
14. Okawa H., Horimoto H., Mieno S. et al. //J. Cardiol. 2002. Vol 39, № 6. P. 299-304.
15. Warburton D„ Schwarz M., Tefft D. et al. // Mech. Dev. 2000. Vol. 92, № 1. P. 55-81.
□ □□
/ Иг м
/ ^¡рж
г ^¡К
УДК 612.215-092.19.001.6 К.С. Голохваст, С.С. Целуйко
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ЦЕОЛИТОВ ВАНГИНСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ ПРИ ИНГАЛЯЦИОННОМ ПУТИ ВВЕДЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО ОХЛАЖДЕНИЯ
Амурская государственная медицинская академия, г. Благовещенск
Природные цеолиты — минералы, относящиеся к группе каркасных алюмосиликатов, в последние десятилетия находят все большее применение в медицинской практике, что объясняется широким спектром фармакологического воздействия и, в первую очередь, их высокой ионообменной и адсорбционной способностью. Благодаря этим свойствам цеолиты оказывают выраженное антитоксическое и гепатопротек-адрное действие, участвуют в нормализации обмена,
стимулируют регенераторные процессы в организме, а также имеют иммуномодулирующий эффект, в частности, стимулируя клеточный иммунный ответ [2, 3,6, 8, 9-11]. Однако практически все работы, посвященные воздействию цеолитов на организм человека или животного, касаются их перорального введения.
Цель настоящей работы заключалась в оценке влияния природных цеолитов Вангинского месторождения Амурской области на состояние клеточ-
