CC BY
57
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ,2015 УДК 616.832-001-078.33
Конюченко Е.А.1, Ульянов В.Ю.1, Дроздова Г.А.2, Норкин И.А.1
КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ А-ДЕФЕНЗИНОВ НЕЙТРОФИЛОВ 1-3 И ЦИТОКИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ В ОСТРОМ И РАННЕМ ПЕРИОДАХ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СПИННОГО МОЗГА
1ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России, 410002, г. Саратов; 2ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», 117198, г. Москва, Россия
Методом иммуноферментного анализа в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга изучено содержание человеческих а-дефензинов нейтрофилов 1-3, про- и противовоспалительных цитокинов в крови у 40 пациентов с осложненными повреждениями шейного отдела позвоночника. На основании проведенного сопоставительного анализа выявлены новые корреляции, характеризующие системный воспалительный ответ в посттравматическом периоде.
К л ю ч е в ы е с л о в а: спинной мозг; травматическая болезнь; а-дефензины нейтрофилов 1—3; цитокин;, иммунофер-ментный анализ.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 (7): 53-55. Koniutchenko E.A.1, Ulianov VYu.1, Drozdova G.A.2, Norkin I.A.1
THE CORRELATION ANALYSIS OF CONTENT OF A-DEFENSINS OF NEUTROPHILS 1-3 AND CYTOKINES IN BLOOD PLASMA OF PATIENTS IN ACUTE AND EARLY PERIODS OF TRAUMATIC DISEASE OF SPINAL CORD
1The Saratov research institute of traumatology and orthopedics of Minzdrav of Russia, 410002 Saratov, Russia; 2 The peoples' friendship university of Russia, 117198 Moscow, Russia
The technique of enzyme-linked immunosorbent assay was implemented to analyze in acute and early period of traumatic disease of .spinal cord the content of human а-defensins of neutrophils 1-3 and pro- and anti-inflammatory cytokines in blood of 40 patients with complicated damages of cervical spine. The implemented comparative analysis established new correlations, characterizing systemic inflammatory response during post-traumatic period.
Keywords: spinal cord; traumatic disease; а-defensins of neutrophils 1-3; enzyme-linked immunosorbent assay
Citation: KlinicheskayaLaboratornayaDiagnostika. 2015; 60 (7): 53-55. (in Russ.)
Первичное повреждение вещества спинного мозга характеризуется каскадом патофизиологических реакций, происходящих на клеточном и молекулярном уровне (эксайтотоксичность, нейровоспаление, активация нейроглии, апоптоз) [1, 2]. Этому предшествует миграция из системного кровотока под влиянием хемоаттрактантов полиморфно-ядерных лейкоцитов и инфильтрация ими паренхимы спинного мозга [3]. В ответ на массивную травму под влиянием различных провоспалительных цитокинов и хемокинов, в большом количестве синтезирующихся моноцитами, происходит индуцированная ТЫ-зависимая и ТЫ-независимая продукция а-дефензинов нейтрофилов НЫР (1-3) [4, 5]. Последние, в свою очередь, вызывают дозозави-симое высвобождение провоспалительных цитокинов и ней-трофилактивирующего белка-78 из эпителиальных клеток, что приводит к дополнительному рекрутингу нейтрофилов в очаг повреждения [6]. НЫ (1-3) выделяются нейтрофилами в фагосомы, а натуральными киллерами - в экстрацеллюляр-ное пространство, обеспечивая иммунные и воспалительные механизмы действия многих катионных антимикробных пептидов [7, 8].
НЫР (1-3) активно оказывают и противовоспалительное действие, ингибируя активность индуцированных моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Так, НЫР (1-3) блокирует высвобождение И-1р, И-6 и И-10 моноцитами при сохранении индуцированной продукции ФНОа [9, 10].
Для корреспонденции: Конюченко Елена Анатольевна, [email protected]
For correspondence: Koniutchenko E.A., koiuchenko1983@ mail.ru
Существуют многочисленные сведения о роли человеческих HNP (1-3) в патогенезе различных заболеваний [11, 12], однако отсутствуют сведения об их роли в развитии системного воспалительного ответа при травматической болезни спинного мозга.
Цель: на основании сопоставительного анализа содержания в плазме крови HNP (1-3), про- и противовоспалительных цитокинов выявить отдельные корреляции, характеризующие системный воспалительный ответ в посттравматическом периоде у пациентов с осложненными повреждениями шейного отдела позвоночника.
Материалы и методы. Основную группу составили 40 пациентов обоего пола (средний возраст 29±7,5 года) с осложненными травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника, находившихся на лечении в клинике нейрохирургии ФГБУ «Саратовский НИИ травматологии и ортопедии» Минздрава России в период с 2011 по 2013 г. Контрольную группу составили 40 условно здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.
Критериями включения в исследование больных основной группы были: степень повреждения спинного мозга, соответствующая классам А, В, С (по шкале Frankel, 1970); сроки наблюдения, соответствующие острому (1-4-е сутки) и раннему (до 30-х суток) посттравматическим периодам (по классификации А.В. Лившица, 1990).
Материалом для исследования была периферическая кровь, полученная натощак в утренние часы при пункции локтевой вены в объеме 5 мл. Для определения концентрации HNP (1-3) образцы крови хранили на льду при температуре 4оС. Гепаринизированную плазму отделяли не позднее чем через 20 мин после взятия образца крови центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 мин дважды, до полного
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 7, 2015
отделения лейкоцитов. Для определения содержания цитоки-нов кровь оставляли для свертывания при комнатной температуре, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения сыворотки.
Количественное содержание HNP (1-3), провоспали-тельных (TNFa, П-1р, IL-6) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов в сыворотке крови пациентов изучали методом иммуноферментного анализа с помощью наборов для определения человеческих а-дефензинов (ELISAkit, HyCult biotechnology, Нидерланды) и цитокинов в плазме крови ("Вектор-Бест", Россия) в соответствии с инструкциями к их применению.
Исследования HNP (1-3) и цитокинов (TNFa, IL-1p, IL-4, IL-6, IL-10) в плазме крови в основной группе осуществляли на 1-4, 7, 14, 21 и 30-е сутки с момента получения травмы, в контрольной группе - однократно.
статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета программ IBMSPSS 20 Statistics. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большая часть наших данных не соответствовала закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовали непараметрические критерии (U-критерий Манна - Уитни). Сопоставительный анализ статистически значимых показателей проводили путем определения коэффициента корреляции рангов Спирмена (R), причем значение R < 0,3 свидетельствовало о слабой связи изученных признаков, значения R > 0,3 и < 0,7 - о средней связи и > 0,7 - о высокой связи. Рассчитывали показатель достоверности (р), который считали статистически значимым прир < 0,05.
Результаты и обсуждение. Анализ корреляций содержания HNP (1-3) и провоспалительных цитокинов на 1-4-е сутки с момента травмы показал наличие положительной сильной связи с TNFa (p < 0,05) и средней силы - с IL-6 (p < 0,05). На 7-е сутки исследования фиксировали ослабление корреляционной связи с TNFa (p < 0,05) до средней и сохранение связи средней силы с IL-6 (p < 0,05). На 14-е сутки исследования корреляционный анализ показал сохранение положительных средней силы связей содержания HNP (1-3) с TNFa, IL-1 р и IL-6 (p < 0,05). На 21-е сутки с момента травмы отмечались положительные связи: средней силы с TNFa (p < 0,05), слабой силы с IL-6 (p < 0,05). На 30-е сутки исследования отмечалось отсутствие каких-либо значимых корреляционных взаимосвязей между содержанием HNP (1-3) и провоспалительных цитокинов (см. таблицу).
Анализ корреляций содержания HNP (1-3) и уровней противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов выявил статистически значимые средние отрицательные корреляционные связи с концентрацией IL-4 на 1-4 и 7-е сутки травматической болезни спинного мозга (p < 0,05). На 14-е сутки травматической болезни отмечалось появление положительных статистически достоверных связей слабой силы HNP (1-3) с концентрациями IL-4 и IL-10 (p < 0,05). На 21-е сутки исследования фиксировали наличие отрицательной связи слабой силы HNP (1-3) с уровнем IL-4 (p < 0,05). На 30-е сутки исследования статистически значимых корреляций содержания HNP (1-3) с IL-4 и IL-10 зафиксировано не было (см. таблицу).
Анализ доступной литературы свидетельствует о важной роли катионных антимикробных пептидов в механизмах неспецифической защиты при различных заболеваниях человека, таких как острые респираторные вирусные инфекции, острые бактериальные воспалительные заболевания респираторного тракта, мочеполовой системы. Приводятся сведения о механизмах антимикробного действия дефензинов ней-трофилов, об индукции ими синтеза отдельных цитокинов, взаимодействии с системами коагуляционного гемостаза и комплемента. Практически отсутствуют данные о роли взаимодействия дефензинов нейтрофилов человека и цитокинов в развитии системного воспалительного ответа в условиях травматической болезни спинного мозга. Это делает актуальными результаты проведенного нами исследования.
Выявленные на 1-4-е сутки с момента получения травмы положительные корреляции содержания НЫР (1-3) и ТЫРа, П-6 свидетельствуют, по нашему мнению, об инициации продукции в очаге повреждения нейтрофильными лейкоцитами НЫР (1-3). Это соответствует данным литературы [4, 6, 8] о механизмах цитокин-опосредованной индукции миграции нейтрофильных лейкоцитов в очаг повреждения и их последующей дегрануляции с высвобождением НЫР (1-3). Некоторое ослабление положительных корреляций на 7-21-е сутки посттравматического периода, на наш взгляд, может быть связано с реализацией иммунно-воспалительного механизма системного ответа, характеризующегося повышением активности моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Согласно данным [5], для ингибирования активности описанных клеток требуется активное участие НЫР (1-3), цитокинов, хемокинов. Именно поэтому происходит обусловленное усиленным потреблением снижение концентраций НЫР (1-3), ТЫРа, П-1р, П-6.
Выявленные на 1-4-е сутки с момента получения травмы отрицательные корреляции содержания НЫР (1-3) и П-4 свидетельствуют, по нашему мнению, об относительной недостаточности противовоспалительных механизмов в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга, обусловленной активной миграцией нейтрофильных лейкоцитов в очаг повреждения и потенцированием провоспалительных механизмов. Появление положительных корреляций НЫР (1-3) и П-4 на 14-е сутки после травмы свидетельствует об усилении продукции противовоспалительных цитокинов, более выраженной по сравнению с конституциональным уровнем и обусловленной действием патоген-ассоциированных молекулярных структур. Купирование инфекционного воспаления в последующие сроки наблюдения характеризовалось появлением отрицательных корреляций НЫР (1-3) и П-4, что свидетельствует о восстановлении баланса про- и противовоспалительных медиаторов. Полученные нами данные соответствуют данным литературы [2, 3] о взаимодействии медиаторов воспаления в разные сроки посттравматического периода [5, 6].
Выводы. 1. Системный воспалительный ответ в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга сопровождается изменением содержания НЫР (1-3), провоспалительных (ТЫРа, 1Ь-1р, П-6) и противовоспалительных (П-4, П-10) цитокинов.
2. Провоспалительные механизмы системного ответа при травматической болезни спинного мозга в остром и раннем периодах характеризуются появлением положительных кор-
Корреляции содержания НПР (1-3), провоспалительных (ШГа, И-1р, 6) и противовоспалительных (1Ь-4, 1Ь-10) цитокинов в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга (п = 40)
Содержание в сыворотке крови цитокинов, пг/мл Содержание в плазме крови HNP (1-3), пг/мл
Сроки наблюдения, сут
1-4-е 7-е 14-е 21-е 30-е
TNFa R 0,711 0,355 0,451 0,313 0,071
p < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05
IL-10 R 0,032 0,075 0,432 0,032 0,071
p > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
IL-6 R 0,511 0,432 0,515 0,217 0,033
p < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05
IL-4 R -0,287 -0,398 0,214 -0,275 -0,039
p < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05
IL-10 R -0,043 -0,038 0,275 -0,063 -0,012
p > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
реляций содержания HNP (1-3) и TNFa, IL-1p, IL-6 на 1-4-е и 21-е сутки.
3. Противовоспалительные механизмы системного ответа при травматической болезни спинного мозга в остром и раннем периодах характеризуются относительной недостаточностью, что проявляется отрицательными корреляциями содержания HNP (1-3) и IL-4 на 1-4, 7-е и 21-е сутки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белашкин И.И., Кочетков А.В. Клинико-патоморфологические особенности современного течения позвоночно-спинальной травмы. Вестник восстановительной медицины. 2011; 4: 27-30.
2. Ульянов В.Ю., Норкин И.А., Щуковский В.В., Пучиньян Д.М., Конюченко Е.А. Характеристика цитокинового профиля в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2011; 3: 114-22.
3. Ульянов В.Ю., Норкин И.А., Дроздова Г.А., Конюченко Е.А. Результаты применения интеллектуальной медицинской системы мониторинга процессов ремоделирования нервной ткани в посттравматическом периоде. Риски и осложнения в современной травматологии и ортопедии: Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти про-фессораА.Н. Горячева. Омск; 2015.
4. Абатуров А.Е. Катионные антимикробные пептиды системы неспецифической защиты респираторного тракта: дефензины и ка-телицидины. Дефензины-молекулы, переживающие ренессанс. Здоровье ребенка. 2012; 2.
5. Будихина А.С., Пинегин Б.В. Дифензины - мультифункциональ-ные катионные пептиды человека. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008; 2: 31-40.
6. Lehrer R.I., Lu W. a-Defensins in human innate immunity. Immunol Rev. 2012; 245 (1): 84-112.
7. Auvynet C., Rosenstein Y. Multifunctional host defense peptides: antimicrobial peptides, the smallyet big players in innateand adaptive immunity. TheFEBS JOURNAL. 2009; 276 (22): 6497-508.
8. Vant Hof W., Veermann E.C., Helmerhost E.J., Nieuw Amerongen A.V. Antimicrobial peptides: properties and applicability. J. Bio-chem. 2001; 382: 597-619.
9. Мусселиус С. Г. Синдром эндогенной интоксикации при неотложных состояниях. М.: БИНОМ; 2008.
10. Козлов В.К. Дисфункция иммунной системы в патогенезе сепсиса. Общая реаниматология. 2005; 4: 65-76.
11. Устьянцева И.М., Хохлова О.И. Роль нейтрофилов в развитии полиорганной недостаточности при сепсисе. Политравма. 2008; 2: 71-4.
12. Sakamoto N., Mukae H., Fujii T., et.al. Differential effects of alfa-and beta defensing on cytokine production by cultured human bron-
chial epithelial cells. Am. J. Phisiol. Lung CellMol. Phisiol. 2005; 288 (3): 508-13.
REFERENCES
1. Belashkin I.I., Kochetkov A.V. Clinico-pathological features of contemporary course of the vertebral-spinal trauma. Vestnik vosstanovitel'noy meditsiny. 2011; 4: 27-30. (in Russian)
2. Ul'yanov V.Yu., Norkin I.A., Shchukovskiy V.V., Puchin'yan D.M., Konyuchenko E.A. Characterization of cytokine profile in acute and early periods of traumatic disease of the spinal cord. Proceedings of the higher educational institutions. Volga region. Medical sciences. 2011; 3: 114-22. (in Russian)
3. Ul'yanov V.Yu., Norkin I.A., Drozdova G.A., Konyuchenko E.A. The results of the application of intellectual health monitoring system for the remodeling of nerve tissue in the posttraumatic period. Risks and complications of modern traumatology and orthopedics: Book of Abstracts of All-Russian scientific- practical conference dedicated to the memory of Professor A.N. Goryachev. Omsk; 2015. (in Russian)
4. Abaturov A.E. Cationic antimicrobial peptides of nonspecific protection respiratornogo tract: defensins and cathelicidins. Defensins molecules undergoing a renaissance. Zdorov'e rebenka. 2012; 2. (in Russian)
5. Budikhina A.S., Pinegin B.V. Difenziny - multifunctional cationic peptides person. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya. 2008; 2: 31-40. (in Russian)
6. Lehrer R.I., Lu W. a-Defensins in human innate immunity. Immunol. Rev. 2012; 245 (1): 84-112.
7. Auvynet C., Rosenstein Y. Multifunctional host defense peptides: antimicrobial peptides, the smallyet big players in innateand adap-tiveimmunity. The FEBS JOURNAL. 2009; 276 (22): 6497-508.
8. Vant Hof W., Veermann E.C., Helmerhost E. J., Nieuw Amerongen A. V. Antimicrobial peptides: properties and applicability. J. Bio-chem. 2001; 382: 597-619.
9. Musselius S.G. Syndrome of endogenous intoxication in case of emergency. Moscow: BINOM; 2008. (in Russian)
10. Kozlov V.K. Disfunction of immune systems in the pathogenesis of sepsis. Obshchaya reanimatologiya. 2005; 4: 65-76. (in Russian)
11. Ust'yantseva I.M., Khokhlova O.I. The role of neutrophils in the development of multiple organ failure in sepsis. Politravma. 2008; 2: 71-4. (in Russian)
12. Sakamoto N., Mukae H., Fujii T., et.al. Differential effects of alfa-and beta defensing on cytokine production by cultured human bronchial epithelial cells. Am. J. Phisiol. Lung Cell Mol. Phisiol. 2005; 288 (3): 508-13.
Поступила 05.02.15 Received 05.02.15
