CC BY
37
УДК 615.847-577.218
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
П. П. ПОЛЯКОВ 1, А. А. АГУМАВА 2, Л. Р. ГУСАРУК 1, А. С. ЛИПАТОВА 1, О. В. ЦЫМБАЛОВ 1, Н. В. ЗАБОЛОТСКИХ 1, С. П. ВЧЕРАШНЮК 1, С. В. КРАВЧЕНКО 1, А. X. КАДЕ 1
КОРРЕКЦИЯ ТЭС-ТЕРАПИЕЙ СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННЫХ НАРУШЕНИЙ ЭКСПРЕССИИ C-FOS МОНОНУКЛЕАРНЫМИ ЛЕЙКОЦИТАМИ КРЫС
'Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
ул. Седина, д. 4, Краснодар, Россия, 350063. 2ФГБНУ «НИИМедицинской Приматологии», ул. Мира, д. 177, с. Веселое, Сочи, Адлерский район, Россия, 354376.
АННОТАЦИЯ
Цель. В настоящей работе изучена возможность коррекции транскраниальной электростимуляцией (ТЭС-тера-пией) индуцированных комбинированным стрессом нарушений экспрессии гена c-fos мононуклеарными лейкоцитами крови крыс определенной стрессоустойчивости.
Материалы и методы. В качестве модели комбинированного стресса в настоящей работе использовались тест принудительного плавания и ортостатический стресс. Для оценки индивидуальной стрессоустойчивости применялся тест принудительного плавания. Оценка уровня экспрессии гена c-fos мононуклеарными лейкоцитами крови осуществлялась методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Усиление экспрессии генов раннего ответа, в первую очередь гена c-fos, является маркером стресса, а также стресс-ассоциированных и психиатрических заболеваний.
Результаты. Экспрессия c-fos в мононуклеарных лейкоцитах животных группы сравнения превышала показатели интактной группы. Напротив, применение ТЭС-терапии (в основной группе) сопровождалось статистически значимым (p=0,04) снижением медианы относительной экспрессии исследуемого гена (медиана группы сравнения - 1,8; медиана основной группы - 0,6).
Заключение. Полученные результаты отражают стресс-лимитирующий эффект ТЭС-терапии, соотносятся с выводами предыдущих экспериментальных и клинических работ.
Ключевые слова: c-fos, мононуклеарные лейкоциты, тест вынужденного плавания, ортостатический стресс, ТЭС-терапия
Для цитирования: Поляков П.П., Агумава А.А., Гусарук Л.Р и др. Коррекция ТЭС-терапией стресс-индуциро-ванных нарушений экспрессии c-fos мононуклеарными лейкоцитами крыс. Кубанский научный медицинский вестник. 2017; 24(6): 106-109. DOI: 10.25207 / 1608-6228-2017-24-6-106-109
For citation: Polyakov P.P., Agumava A.A., Gusaruk L.R., Lipatova A.S., Tsymbalov O.V., Zabolotskih N.V., Vcherachnyuk S.P., Kravchenko S.V., Kade A.Kh. Cranial electrotherapy stimulation modulates stress-induced c-fos expression in rat peripheral blood mononuclear cells. Kubanskij nauchnyj medicinskij vestnik. 2017; 24(6): 106-109. (In Russ., English abstract). DOI: 10.25207 / 1608-6228-2017-24-6-106-109
P. P. POLYAKOV1, A. A. AGUMAVA 2, L. R. GUSARUK 1, A. S. LIPATOVA 1, O. V. TSYMBALOV1, N. V. ZABOLOTSKIH 1, S. P. VCHERACHNYUK1, S. V. KRAVCHENKO 1, A. KH. KADE1
CRANIAL ELECTROTHERAPY STIMULATION MODULATES STRESS-INDUCED C-FOS EXPRESSION
IN RAT PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS
1Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Sedina str., 4, Krasnodar, Russia, 350063. 2 Research Institute of Medical Primatology, Mira str., 177, s. Veseloe, Sochi, Russia, 354376.
ABSTRACT
Aim. In our article, we studied the possibility of remodeling of stress-induced c-fos expression damages in rat peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) by cranial electrotherapy stimulation (CES-therapy).
Materials and methods. As a model of combined stress, the present study used a forced swimming test and orthostatic stress. For the assessment of individual stress resistance, a forced swimming test was used. Evaluation of the c-fos gene expression level in PBMNC was carried out by real-time polymerase chain reaction. Leukocyte expression of c-fos is a recognized and unique peripheral biomarker of the psychogenic and somatic stress.
Results. The use of CES-therapy was followed by a decrease (p=0,04) in the expression of the c-fos gene in PBMNC (0,6 as the median of treatment group vs 1,8 as median of control group).
Conclusion. These results reflect the stress-limiting effect of this treatment method and correlate with the findings of previous experimental and clinical studies.
Keywords: c-fos, mononuclear leukocytes, forced swimming test, orthostatic stress, CES-therapy
Введение
Транскраниальная электростимуляция
(ТЭС-терапия), усиливая продукцию ß-эндорфина, оказывает гомеостатическое антистрессорное влияние на нейроиммуноэндокринную регуляцию. Доказательства антистрессорного потенциала данного метода получены в ряде экспериментальных и клинических работ [1, 2]. При этом практически не проясненным остается вопрос о влиянии ТЭС-терапии на экспрессию так называемых генов стресса (в первую очередь c-fos) мононуклеарны-ми лейкоцитами крови. Между тем, усиление данной экспрессии является уникальным маркером стресса как нейроиммуноэндокринного ответа на требования среды и стресса клеточного [3]. Более того, активация генов немедленного ответа, к которым относится c-fos, представляет собой связующее патогенетическое звено двух этих уровней, являясь одним из ранних этапов процесса изменения фенотипа клетки [4]. В свете сказанного чрезвычайно актуальным представляется вопрос о возможности коррекции ТЭС-терапией стресс-ин-дуцированных нарушений экспрессии c-fos моно-нуклеарными лейкоцитами крови. Особый интерес представляет при этом использование модели комбинированного стресса, как наиболее приближенной к условиям, имеющим место in natura.
Цель исследования: изучить возможности коррекции ТЭС-терапией стресс-индуцированных нарушений экспрессии c-fos в мононуклеарных лейкоцитах крови крыс определенной стрессоу-стойчивости.
Материалы и методы
Объектом исследования являлись 50 нелинейных белых самцов крыс (200-250г). Содержание крыс, постановка экспериментов, представление полученных результатов проводились согласно требованиям приказа №199н МЗ РФ от 01.04.2016г., рекомендациям ARRIVE (Animal Research: Reporting of InVivo Experiments, 2010) и MIQE (Minimum Informationf or Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, 2009).
Время адаптации для животных всех групп составляло 7 дней. Крысы интактной группы не включались в эксперимент. Забор крови (2 мл) производился в первый день после адаптации. Ранжирование остальных крыс по выносливости, работоспособности и стрессоустойчивости осуществлялось в первый день после адаптации при помощи модифицированного НЦБМТ РАМН (Научный центр биомедицинских технологий) теста принудительного плавания (плавательного теста)
по методике, описанной нами ранее [1, 2]. В эксперимент включались среднеустойчивые крысы (время плавания до утомления не отклонялось от среднего более чем на 35%). Учет индивидуальной стрессоустойчивости является ключевым методологическим приемом посвященных стрессу исследований, пренебрежение которым может исказить конечные результаты. Половина средне-устойчивых животных (основная группа, n=20) получала ТЭС-терапию со 2 по 6 день по методике, описанной нами ранее [5]. Другая половина (группа сравнения, n=20) не получала ТЭС-терапию.
После этого моделировался комбинированный стресс (модифицированный тест принудительного плавания на 7 день и ортостатический стресс на 8 день) по методике, описанной нами ранее [1, 2].
Забор крови в объеме 2 мл производился через 2 часа после ортостатического стресса в вакуэты с ЭДТА (концентрация 2,7%). Перед этим животное наркотизировалось телазолом («Zoetis Inc», USA) и ксиланитом («Нита-Фарм», Россия) [5]. Монону-клеарные лейкоциты выделялись градиентным центрифугированием. Для этого кровь (1 мл) разбавлялась 1 мл физиологического раствора и наслаивалась на фиколл-верографиновый градиент плотности (р=1087 кг/м3) в соотношении 1:1, после чего производилось центрифугирование в течение 20 минут при 2000 об/мин. Отбиралось интерфазное кольцо мононуклеаров. Клетки осаждались центрифугированием в течение 5 минут при 2000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости.
Экспрессия гена c-fos оценивалась методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Выделение РНК из мононуклеарных лейкоцитов осуществлялось методом гуанидинти-оцианат-фенол-хлороформной экстракции с использованием коммерческого набора ExtractRNA («Евроген», Россия). Концентрацию РНК измеряли при помощи спектрофотометра Picodrop Pico200 («PicodropLtd», UK). Целостность выделенной РНК изучалась при помощи электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием. Для обратной транскрипции на матрице полученной РНК использовался коммерческий набор Реверта-L (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) по инструкции производителя. Определение уровня мРНК гена интереса - c-fos, и референтного гена - ß-актина проводилось с использованием наборов TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA) c-fos:Rn02396759_m1, beta-actin: Rn00667869_m1 (краситель - FAM, гаситель - BHQ).
А. ^^^ ß-актин c-fos LJ • ß-актин ' / c-fos : 1 / i 2 / / Zl = Z2 /
Cycle 26 30 35 40 45 50 Cycle
Рис. 1. Примеры флюоресцентных кривых амплификации кДНК генов р-актина и c-fos. А. - экспрессия c-fos была ниже экспрессии гена р-актина во всех случаях. В. - равный угол наклона флюоресцентных кривых амплификации кДНК генов р-актина и c-fos.
Fig. 1. Examples of PCR amplification curves. A. - c-fos expression was lower than the expression of p-actin gene in all cases. B - equal inclination angle of PCR amplification curves.
Амплификационная смесь, общим объемом 25 мкл, содержащая 1xTaqMan Gene Expression MasterMix («Applied Biosystems», USA), IxTaqMan Gene Expression Assays и 5 мкл кДНК, помещалась в прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени Rotor-Gene Q («Qiagen», Germany). Режим включал в себя прогревание смеси при 50°С в течение 2 минут (для активации урацил-^гликози-лазы), 10-минутного прогрева при 95°С (активация полимеразы) с последующими 60 циклами: 12 сек денатурации при 95°С, 30 сек отжига праймеров при 56°С и 20 сек элонгации при 72°С. Описанный состав реакционной смеси и режим амплификации были подобраны в ходе предварительной оптимизации. Расчет относительной экспрессии гена c-fos осуществлялся методом 2-ллст.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась посредством программы Statistica («StatSoft Inc», USA). Для оценки нормальности распределения полученных значений использовался критерий Шапиро-Уилка. Так как распределение отличалось от нормального, данные представлялись как Me(Q1-Q3), где Me -медиана, Q1-Q3 -нижний (25%) и верхний (75%) квартили. Сравнение двух независимых групп осуществлялось при помощи непараметрического U-критерий Манна-Уитни. В качестве критического принимался уровень значимости нулевой гипотезы, равный 0,05.
Результаты и обсуждение
Экспрессия c-fos в исследуемых клетках была ниже экспрессии гена ß-актина во всех случаях (рис. 1А). Эффективность амплификации кДНК гена интереса и референтного гена была равной (необходимое условие использования метода Livak (рис. 1В)). Экспрессия c-fos в мононукле-арных лейкоцитах животных группы сравнения
превышала показатели интактной группы (1,8(1,3-2,8)). Эти результаты отражают индуцированную комбинированным стрессом чрезмерную активацию c-fos. Применение ТЭС-терапии сопровождалось статистически значимым (р=0,04) снижением медианы относительной экспрессии исследуемого гена (0,6(0,09-1)) (рис. 2).
Рис. 2. Уровень экспрессии c-fos в мононуклеарных лейкоцитах животных групп сравнения и основной относительно интактной группы.
* p=0,04 - по сравнению с основной группой.
Fig. 2 Relative expression levels of c-fos in the treatment and control groups.
* p=0,04 - vs. treatment group.
Экспрессия св мононуклеарных лейкоцитах при стрессе имеет характерную динамику. Вне воздействия каких-либо стрессоров (к примеру, у здоровых добровольцев) обнаруживается незначительный ее уровень. В условиях стресса количество мРНК данного гена быстро увеличивается и затем через 4-5 часов снижается вплоть до нерегистри-
руемого уровня, что объясняется стресс-индуци-руемым угнетением пролиферации лимфоцитов и многочисленными ограничивающими транскрипцию механизмами отрицательной обратной связи [6]. Благодаря данным свойствам, усиление экспрессии c-fos рассматривается в современной литературе как перспективный биомаркер стресса, отражающий к тому же интенсивность клеточного стресса и провоспалительный статус [4]. В последнее время предпринимаются попытки использовать этот инструмент для оценки выраженности стресс-ассоциированных и психиатрических заболеваний, лекарственных и наркотических аддикций, а также эффективности терапевтических стратегий. К недавним успехам данного направления следует отнести результаты исследования Teyssier (2013), касающиеся способности транскраниальной магнитной стимуляции угнетать экспрессию c-fos моно-нуклеарными лейкоцитами пациентов, страдающих большим депрессивным расстройством [4].
Результаты настоящей работы согласуются с выводами предшествующих исследований, демонстрирующих антистрессорные эффекты ТЭС-терапии, в частности, способность данного лечебного метода предупреждать и подавлять гиперактивацию важнейших стресс-респонсивных центров мозга - кортиколиберин-продуцирующих нейронов гипоталамуса и префронтальной коры [1, 2]. Показанное в данной работе значительное снижение экспрессии c-fos в мононуклеарных лейкоцитах животных основной группы отражает системный благоприятный характер действия ТЭС-терапии.
Заключение
В настоящей работе продемонстрирована возможность коррекции ТЭС-терапией стресс-инду-цированных нарушений экспрессии c-fos монону-клеарными лейкоцитами крыс. Это закладывает теоретический фундамент для дальнейших экспериментальных и клинических исследований с использованием c-fos в качестве инструмента более тонкого изучения антистрессорных механизмов действия ТЭС-терапии.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Каде А.Х., Поляков П.П., Липатова А.С. и др. Характер экспрессии c-fos нейронами медиальной префронтальной
коры в условиях комбинированного стресса и влияния ТЭС-те-рапии. Современные проблемы науки и образования. 2017; 5. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26877. DOI: 10.17513/spno.26877. [Kade A.Kh., Polyakov P.P., Lipatova A.S., Sotnichenko A.S., Kuevda E.V., Gubareva E.A. Stress-induced c-fos expression in medial prefrontal cortex and influence of tes-therapy. Sovremennye problemy nauki i obrazovanija. 2017; 5. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26877. (In Russ., English abstract). DOI: 10.17513/spno.26877].
2. Поляков П.П., Липатова А.С., Сотниченко А.С., Куевда Е.В., Гаспарян К.К., Губарева Е.А., Каде А.Х. Влияние ТЭС-те-рапии на характер стресс-индуцированной экспрессии c-fos нейронами паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Уральский медицинский журнал. 2017; 5: 121-126. [Polyakov P.P., Lipatova A.S., Sotnichenko A.S., Kuevda E.V., Gasparyan K.K., Gubareva E.A. Kade A.Kh. Influence of TES-therapy on the character of stress-induced expression of c-fos in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Ural'skij medicinskij zhurnal. 2017; 5: 121126. (In Russ., English abstract)].
3. Teyssier J.R., Trojak B., Chauvet-Gelinier J.C., Bonin B. Low frequency transcranial magnetic stimulation downregulates expression of stress genes in blood leucocytes: Preliminary evidence. J. Psychiatr. Res. 2013; 47(7): 935-936. DOI: 10.1016/j. jpsychires.2013.03.002.
4. Поляков П.П., Липатова А.С., Каде А.Х. Механизмы активации и функционирования некоторых генов раннего ответа. Медицинский вестник Юга России. 2016; 4: 4-11. DOI: 10.21886/2219-8075-2016-4-4-11. [Polyakov P.P., Lipatova A.S., Kade A.Kh. Mechanisms of immediate-early genes activation. Medical Herald of the South of Russia. 2016; 4: 4-11. (In Russ., English abstract). DOI: 10.21886/2219-8075-2016-4-4-11].
5. Липатова А.С., Поляков П.П., Каде А.Х. и др. Модификация методики ТЭС-терапии для ее применения у мелких лабораторных грызунов. Современные проблемы науки и образования. 2015; 5. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/ view?id=22696. [Lipatova A.S., Polyakov P.P., Kade A.Kh., Zanin S.A., Trofimenko A.I., Malysheva T.V. Modification of the procedure TES-therapy for its use in small laboratory rodents. Sovremennye problemy nauki i obrazovanija. 2015; 5. URL: https://www. science-education.ru/ru/article/view?id=22696. (In Russ., English abstract)].
6. Gladkevich A., Kauffman H.F., Korf J. Lymphocytes as a neural probe: potential for studying psychiatric disorders. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2004; 28(3): 559-576. DOI: 10.1016/j.pnpbp.2004.01.009.
Поступила /Received 30.10.2017 Принята в печать/Accepted 28.11.2017
Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов / The authors declare no conflict of interest
Контактная информация: Поляков Павел Павлович; тел.: 8 (861) 262-40-31; e-mail: [email protected]; Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, д. 4.
Corresponding author: Pavel P. Polyakov; tel.: 8 (861) 262-40-31; e-mail: [email protected]; Sedina street, 4, Krasnodar, Russia, 350063.
