Коррекция системной воспалительной реакции при остром панкреонекрозе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ

НТЕРОЛОГИЯ

ГАСТРО;

experimental gastroenterology

коррекция системной воспалительной реакции при остром панкреонекрозе

Чупахин О. Н.1, Юшков Б. Г.2,3, Ранцев М. А.2, Сарапульцев П. А.2, Данилова И. Г.2,3, Сарапульцев А. П.2, Медведева С. Ю.23, Сидорова Л. П.3

1 Институт органического синтеза имени Постовского УрО РАН, Екатеринбург;

2 ФГБУ РАН Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург;

3 ФГАОУ ВПО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина», Екатеринбург.

Сарапульцев Алексей Петрович

E-mail: [email protected],.

резюме

Цель. Оценки возможности коррекции системной воспалительной реакции при тяжелых формах острого панкреатита путем воздействия соединением L-17 из группы замещенных 5R1, 6И2-1,3,4-тиадиазин-2-аминов. Материалы и методы. Эксперимент проводился на здоровых половозрелых нелинейных белых крысах женского пола. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 15 животных. Моделирование панкреонекроза у крыс производилось по авторской модели (Патент РСТ РФ № 2400820 от 9.01.2008). После формирования экспериментального панкреонекроза через час после окончания операции внутрибрюшинно животным вводилось соединение L-17 в дозе 40 мг/кг. В последующем соединение L-^вводилось в дозе 40 мг/кг с частотой 1 раз в сутки. В контрольную группу вошли 15 животных со средней массой 220 г, которым также была воспроизведена разработанная модель панкреонекроза, но медикаментозное воздействие не оказывалось.

Результаты. Развитие системного воспаления в группе животных с экспериментальным острым панкреатитом подтверждалось появлением достоверных признаков системного воспаления: низким уровнем моноцитов, высоким уровнем IL-1, IL-6, IL-10 и TNF. Использование соединения L-17 при лечении экспериментального панкреонекроза снижает смертность от осложнений панкреонекроза в 2 раза, являясь эффективным методом коррекции системного воспалительного процесса.

Заключение. Механизм влияния соединения L-17 на возникновение и развитие системного воспаления может заключаться в том, что оно уменьшает выраженность экссудативно-деструктивного (гнойного) воспаления и стимулирует развитие продуктивного (пролиферативно-клеточного) воспаления. Ключевые слова: острый панкреатит; системное воспаление; экспериментальный панкреатит.

summary

L-17 compound of the group of substituted 5R1, 6H2-1,3,4-thiadiazine-2-amines was used to treat experimental pancreatonecrosis in rats.

Aim. The aim of the study was to assess the possibility of correction of systemic inflammatory response in severe acute pancreatitis by the compound L-17 from the group of substituted 5R1, 6H2-1 ,3,4-thiadiazine-2-amines. Materials and methods. The trial was carried out on 30 outbred female rats with the average body weight 180-240g. each. For getting statistically reliable results, the groups of 15 animals were formed. The formation of pancreatic necrosis in rats was produced according to the author's model (PCT Patent RF № 2400820 of 01.09.2008). After the formation of experimental pancreatic necrosis the animals were treated intraperitoneally with the compound L-17 at a dose of 40 mg/kg. The control group included 15 animals with an average weight of 220 grams, with experimental pancreatonecrosis.

Results. The development of systemic inflammation in a group of animals with experimental acute pancreatitis was confirmed by the appearance of significant signs of systemic inflammation, low levels of monocytes, high levels of IL-1, IL-6, IL-10 and TNF. The use of compound L-17 in the treatment of experimental pancreatonecrosis reduces mortality from complications of 2, being the effective method of correcting of the systemic inflammation. Conclusion. The mechanism of the influence of compound L-17 on the emergence and the development of systemic inflammation may lie in the fact that it reduces the severity of exudative-destructive (purulent) inflammation and stimulates the development of productive (cell proliferative) inflammation. Keywords: acute pancreatitis; system inflammation; experimental pancreatic necrosis.

LO

m

m

Острый панкреатит, или острое воспаление поджелудочной железы, является основным диагнозом среди ургентных пациентов стационаров хирургического профиля, уступая по частоте только острому аппендициту. Причем, по данным современной литературы, число больных с острым панкреатитом не только не уменьшается, а, наоборот, имеется тенденция к его увеличению [1-3]. В настоящее время получены веские доказательства того, что основой патогенеза развития системной воспалительной реакции при панкреонекрозе является запуск цитокинового каскада [4; 5]. Определенным подтверждением этих данных является то, что клиническая симптоматика панкреонекроза включает все облигатные признаки системного воспаления: SIRS, синдромы эндотоксикоза и полиорганной недостаточности [3-6], а поэтому патогенетически обоснованное лечение тяжелых форм острого панкреатита — панкреонекроза должно базироваться на препаратах, влияющих на возникновение и течение системного воспаления.

В Институте органического синтеза УрО РАН синтезировано соединение L-17 из группы замещенных 5R1, R62, 3,4-тиадиазин-2-аминов (Патент РСТ РФ № 2259371 от 27.08.2005), позволяющее корригировать течение системной воспалительной реакции при обширных некротических изменениях в тканях [7]. Для оценки возможности коррекции системной воспалительной реакции при тяжелых формах острого панкреатита — панкреонекрозе с целью снижения уровня летальности нами были выполнены экспериментальные исследования на лабораторных животных с использованием соединения L-17.

материал и методы исследования

Экспериментальная модель панкреонекроза. Моделирование панкреонекроза у крыс производилось по авторской модели (Патент РСТ РФ № 2400820 от 9.01.2008). Каждая крыса после операции находилась в отдельном маркированном лотке. Обезболивание животных с выключением сознания достигалось путем ингаляции воздушно-эфирной смеси масочным способом. Интраоперационная летальность отсутствовала. После моделирования экспериментального панкреонекроза в течение 10 минут животные полностью выходили на уровень предоперационного состояния по поведенческим реакциям. В первые сутки животные получали только питье, а со 2-х суток переводились на обычный режим питания. При оценке поведения животных через 24 часа никаких особенностей поведенческих реакций не выявлялось: животные были активны, без задержки реагировали на светозвуковое раздражение. Симптомов дыхательной недостаточности, нарушения питания и потребления жидкости также не отмечалось.

Экспериментальные животные. Эксперимент проводился на здоровых половозрелых нелинейных белых крысах женского пола. В опытах использовали

животных, прошедших карантинным режим вивария НИИ биологии УрО АН России и не имевших признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Все исследования проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986) и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).

Протокол эксперимента. Для проведения исследования были сформированы две группы по 15 животных с экспериментально вызванным панкрео-некрозом. Рандомизация крыс происходила по возрасту полу и весу случайным образом. Основная группа состояла из 15 животных со средней массой 223 г. После формирования экспериментального панкреонекроза через час после окончания операции внутрибрюшинно животным вводилось соединение L-17 в дозе 40 мг/кг. В последующем соединение L-17 вводилось в дозе 40 мг/кг с частотой 1 раз в сутки. В контрольную группу вошли 15 животных со средней массой 220 г, которым также была воспроизведена разработанная модель панкреонекроза, но медикаментозное воздействие не оказывалось. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Вывод животных из эксперимента осуществлялся на 1, 5 и 7-е сутки под общим обезболиванием.

Методы исследования. Материал, забранный для светооптической микроскопии и последующей морфометрии, фиксировался в нейтральном формалине, микропрепараты из ткани поджелудочной железы окрашивались гематоксилин-эозином. Кровь для биохимического и иммуноферментного анализа забиралась путем пункции сердца в объеме 3 мл с последующим центрифугированием и отделением сыворотки. Исследование проводилось с помощью биохимического анализатора Immunochemistry Systems фирмы Beckman Coulter (США) и автоматического иммуноферментного анализатора модели Personal LAB фирмы Adaltis (Италия).

В статистических исследованиях применен критерий Стьюдента (t), для математической обработки данных при сравнении исследуемых групп использована компьютерная программа SPSS. Уровень значимости различий был принят равнымр < 0,05.

результаты исследования

На первые сутки эксперимента макроморфологи-ческая картина в обеих группах с введением соединения L-17 и без введения препарата не отличалась, имелись признаки выраженного перифокального отека с инфильтрацией тканей поджелудочной железы и окружающей ее клетчатки, геморрагическое пропитывание тканей в проекции паренхимы поджелудочной железы и небольшое количество серозного выпота в свободной брюшной полости.

На пятые сутки эксперимента макроскопическая картина изменений в брюшной полости имела

кардинальные отличия. В группе без введения препарата имелись все признаки прогрессирования панкреонекроза с развитием гнойных осложнений. В брюшной полости выявлялось большое количество мутной серозной жидкости с нитями фибрина, брюшина имела матовую окраску, и на ней имелись очаги стеатонекрозов и фибринозные наложения, а в проекции поджелудочной железы обнаруживался плотный инфильтрат с явлениями абсцедирова-ния. В группе животных, получавших соединение Ь-17, выявлялась картина купированного воспалительного процесса: выпот в брюшной полости отсутствовал, стеатонекрозов и фибринозных наложений не было, а в клетчатке ткани поджелудочной железы наблюдались лишь явления небольшого отека и инфильтрации. Гистоморфологическое исследование соответствовало макроскопическим изменениям. В группе животных без препарата на пятые сутки: очаг некроза был представлен разрушенными ацинарными структурами экзокринной части поджелудочной железы, определялись диффузная инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами и выраженное полнокровие трабекулярных сосудов. В группе животных, получавших соединение Ь-17: очаг некроза был представлен разрушенными аци-нарными структурами экзокринной части поджелудочной железы и частично островкового аппарата. Выявлялись выраженная экссудативная реакция в виде диффузной инфильтрации полиморфноядерными лейкоцитами и полнокровие сосудов.

На седьмые сутки эксперимента в группе животных без введения препарата: зона повреждения начинала замещаться элементами грануляционной ткани, инфильтрированной лимфоцитами и небольшим количеством полиморфноядерных лейкоцитов. В группе, получавшей соединение Ь-17: зона некроза замещена рубцовой тканью, представленной функционально активными фибробластами и волокнистыми структурами. Отмечалась компенсаторная пролиферация протоковых структур.

При анализе лабораторных данных по результатам эксперимента на первые сутки получены следующие изменения в показателях общего анализа крови (приведены в табл. 1). Так, уже на первые сутки выявлялись изменения лейкоцитарной формулы, характерные для острого воспалительного процесса: признаки нейтрофилеза на фоне выраженной лейкопении, также отмечалось значительное (более чем в 5 раз) снижение количества лимфоцитов. При этом выраженная лейкопения свидетельствовала о тяжести процесса, а столь значимое снижение количества лимфоцитов в крови уже на первые сутки объяснялось развитием стресс-индуцированной реакции при развитии острого панкреонекроза [8].

Данные динамики изменения показателей биохимических приведены в табл. 2. Биохимическое исследование, зафиксировавшее повышение амилазы крови до 13935 ± 4613 МЕ/л, АЛТ до 507,00 ± 149,61 МЕ/л, АСТ до 558,3 ± 150,29 МЕ/л, креатинина до 49,20 ± 7,84 мкмоль/л, также свидетельствовало

о тяжести развившегося процесса [1; 3; 8]. Наиболее информативным показателем, отражающим степень выраженности реакции организма на первичное поражение поджелудочной железы, явилась панкреатическая амилаза. В контрольной группе без препарата уровень первичной амилаземии в два раза превышал показатели в группе животных, получавших соединение L-17.

В первые сутки течения панкреонекроза у животных без введения препарата был отмечен всплеск концентрации большинства интерлейкинов как воспалительного, так и противовоспалительного пулов, значительно превышающего аналогичные показатели в группе животных на фоне введения соединения L-17 (табл. 3). Только концентрация TNF-a в группе животных, получавших соединение L-17, значительно превышала аналогичную у животных без введения препарата. Статистическая достоверность в сравниваемых группах была значимой (р < 0,05).

Летальность. Самым ярким показателем эффективности действия соединения L-17 явился уровень летальности. На 7-е сутки в группе животных без лечения летальность достигла 60%, а в группе с соединением L-17 летальность составила всего 30%. Основной причиной летальности было прогрессирование полиорганной недостаточности на фоне панкреонекроза и перитонита.

обсуждение полученных

результатов

Развитие системного воспаления в группе животных с экспериментальным острым панкреатитом подтверждается появлением достоверных признаков системного воспаления: низким уровнем моноцитов, совпадающим с пиком системной воспалительной реакции [9], высоким уровнем IL-1, IL-6, IL-10 и TNF. Цитокин IL-6, имеющий наивысшую ценность в дифференциации сепсиса и неинфекционного SIRS с чувствительностью выше 80% и специфичностью выше 70% [5; 9-11], в первые сутки закономерно имеет средние значения, так как формирование гнойных осложнений начинается в период 5-7-е сутки. Использованное для лечения острого панкреатита соединение L-17 благотворно воздействовало на все эти проявления системного воспаления и, более того, даже предотвратило развитие гнойных осложнений на седьмые сутки эксперимента. Учитывая данные гистоморфологического исследования, механизм влияния соединения L-17 на возникновение и развитие системного воспаления может заключаться в том, что оно уменьшает выраженность экссуда-тивно-деструктивного (гнойного) воспаления, движущей силой которого являются обладающие выраженным флогогенным потенциалом нейтрофилы, продуцирующие большое количество провоспали-тельных интерлейкинов, и стимулирует развитие

Б >

о О 2

О Я

< s oü Я й

QJ о

hjg

5 -

Я ^

о ь

о &

S

и га

L

IS

га х

л

<

га

I-

х ш 2 s a ш с и

V

m

m

Таблица 1

ОБЩИЙ АНАЛИЗ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ПЕРВЫЕ СУТКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальные группы Показатели анализа крови

лейкоциты гранулоциты лимфоциты моноциты тромбоциты

Нормальные значения 3,12 ± 1,49 0,46 ± 0,31 2,5 ± 1,21 0,06 ± 0,03 929±133

Группа, без соединения Ь-17 2,2 ± 1,02 1,72 ± 0,78 0,43 ± 0,25 0,08 ± 0,04 689,20 ± 29,28

Группа, получавшая соединение Ь-17 4,64 ± 3,29 3,48 ± 2,92 0,99 ± 0,78 0,16 ± 0,13 829,80 ± 72,48

* Статистическая достоверность в сравниваемых группах была значимой (р < 0,05). ** Нормальные показатели приведены по [12].

Таблица 2

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ПЕРВЫЕ СУТКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальные группы Креатинин, мкмоль/л АЛАТ, Ме/л АСАТ, Ме/л Амилаза, Ме/л

Нормальные значения 0,4 ± 0,1 25 ± 9 102 ± 31 2268

Группа, без соединения Ь-17 49,20 ± 7,84 507,00 ± 89,61 558,3 ± 62,29 13935±2613

Группа, получавшая соединение Ь-17 30,50 ± 6,93 337,70 ± 66,19 474,3 ± 46,92 6164±208

* Статистическая достоверность в сравниваемых группах была значимой (р <0,05). ** Нормальные показатели приведены по [17].

Таблица 3

ПОКАЗАТЕЛИ ЦИТОКИНЕМИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ПЕРВЫЕ СУТКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальные группы ТЫР, pg/ml 1Ь-1Ь, pg/ml 1Ь-6, pg/ml 1Ь-10, pg/ml

Группа, без соединения Ь-17 41,68 ± 14,3 240,26 ± 96,31 78,17 ± 15,38 118,31 ± 61,07

Группа, получавшая соединение Ь-17 125,77 ± 32,66 52,02 ± 6,91 50,34 ± 8,31 44,68 ± 6,16

продуктивного (пролиферативно-клеточного) воспаления, в котором преобладающим клеточным элементом являются мононуклеары, выделяющие не только провоспалительные, но и противовоспалительные интерлейкины.

выводы

1. Использование соединения Ь-17 при лечении экспериментального панкреонекроза

предотвращает развитие лимфо- и моноцитопении, уменьшает выраженность цитокинемии, снижает уровень амилазы и печеночных ферментов в первые сутки заболевания.

2. Использование соединения Ь-17 при лечении экспериментального панкреонекроза снижает смертность от осложнений панкреонекроза в 2 раза.

3. Соединение Ь-17 является эффективным методом коррекции системного воспалительного процесса.

со т

литература

1. Атанов Ю. П. Гнойный панкреатит // Хирургия. — 1997. — № 8. —

С.20-24.

2. Нестеренко Ю. А., Лаптев В. В., Михайлусов С. В. Диагностика и лечение острого панкреатита. — М.: Бином, 2004. — 304 с.

3. Banks P. A. Pancreatitis. — New York and London, 1979. — 208 c.

4. Denham W, Fink G., Yang I. et al. Small molecule inhibition of tumor necrosis factor gene processing during acute pancreatitis prevents cytokine cascade progression and attenuates pancreatitis severity // Am. Surg. — 1997. — Vol. 63. — P. 1045-1049.

5. Norman J. G., Fink G. W., Denham W. et al. Tissue-specific cytokin production during experimental acute pancreatitis. A probable mechanism for distant organ dysfunction // Dig. Dis. Sci. — 1997. — Vol. 42, № 8. — P. 1783-1789.

6. Толстой А. Д. Парапанкреатит/А. Д. Толстой, В. П. Панов,

В. Б. Краснорогов, Р. В. Вашетко, А. В. Скородумов. — СПб.: Ясный свет, 2003. — 256 с.

7. SarapultsevP., Chupakhin O., Sarapultsev A. et al. New insights in to the treatment of myocardial infarction // Int. J. Exp. Pathol. — 2012. — Vol. 93, № 1. — P. 18-23.

8. Гольцев К. А., Бабинец О. М., Кожина О. Ю. и др. Влияние криоконсервированного лейкоконцентрата кордовой крови человека на выраженность эндогенной интоксикации при остром гнойном перитоните // Проблемы криобиологии. — 2011. — № 2. — С. 179-190.

9. Tschaikowsky K., Hedwlg-GeissingM., Schiele A. et al. Is low monocyte HLA-DR expression helpful to predict outcome in severe sepsis? // Crit. Care Med. — 2002. — Vol. 30. — P. 1015-1023.

10. Du B., Pan J., Chen D. Li Y. Serum procalcitonin and inter-leukin-6 levels may help to differentiate systemic inflammatory response of infectious and non-infectious origin // Chin. Med. J. (Engl). — 2003. — Vol. 116, № 4. — P. 538-542.

11. Liu X. L., Du B., Pan J. Q. et al. Role of procalcitonin in the differentiation and surveillance of systemic inflammatory response syndrome // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. — 2005. — Vol. 27. — P. 48-52.

12. GiknisM. L. A., Clifford C. B. Clinical laboratory parameters for Crl // WI (Han). March 2008. Charles River Laboratories. URL: http://info.criver.com/flex_content_area/documents/rm_rm_r_ Wistar_Han_clin_lab_parameters_08.pdf. Consulted 26-8-2009.

Б >

ст

о

о

С jy < ё Q0

Я -

QJ о

Us

; s

я ^

О b

о &

S

и га i_ is га х

л

<

га h X

ш 2 s а ш с и

v

m

О

о m