CC BY
8
3. Парфенов В.А., Головачева В.А. Междисциплинарное ведение пациентов с диабетической невропатией // Эффективная фармакология. Неврология. 2017. № 5 (38). С. 42-49. [Parfenov V.A., Golovacheva V.A. Interdisciplinary management of patients with diabetic neuropathy. Effektivnaya farmakologiya. Nevrologiya. 2017; 5 (38): 42-49 (In Russ.)]
4. Абдурахманов И.У, Умурзаков Ш.Э., Жамило-ва Г.К. и др. COVID-19 и коморбидная патология (обзор литературы) // Научное наследие. 2021. №. 68. С. 56-64. [Abdurakhmanov I.U., Umurzakov Sh.E., Zhamilova G.K. et al. COVID-19 and comorbid pathology (literature review). The Scientific Heritage. 2021; 68: 56-64. (In Russ.)]
5. Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета. Часть II. Хирургический, стреп-тозотоциновый и дитизоновый диабет // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2013. № 4 (44). С. 5-10. [Mozheyko L.A. Experimental models for the study of diabetes mellitus part II. Surgical, streptozotocin and ditisone diabetes. Journal of the Grodno State Medical University. 2013; 4 (44): 5-10. (In Russ.)]
6. Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета. Часть I. Аллоксановый диабет // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2013. № 3 (43). С. 26-29. [Mozheyko L.A. Experimental models for the study of diabetes mellitus part I. Alloxan diabetes Journal of the Grodno State Medical University. 2013; 3 (43). 26-29. (In Russ.)]
7. Вдовина Г.П., Голдобина Г.В., Бурлуцкая А.А. и др. Скрининговое изучение противодиабетической активности
водного извлечения из мха «цетрария исландская» на модели стероидного сахарного диабета // Вестник новых медицинских технологий. 2021. №3. С. 50-53. [Vdovina G.P., Goldobina G.V, Burlutskaya A.A. et al. Screening study of antidiabetic activity of water extraction from the moss cetraria islandica on the model of steroid diabetes mellitus. Journal of New Medical Technologies. 2021; 3. 50-53. (In Russ.)] DOI: 10.24412/1609-2163-2021-3-50-5.
8. Уланова Т.В., Инчина В.И., Шокина С.В. и др. Сравнение гипогликемической активности никотината 3-гидроксипиридина и его липосомальной формы на фоне индуцированных дексаметазоном метаболических нарушений // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 2. [Ulanova T.V., Inchina V.I., Shokina S.V. et al. Comparison of hypoglycemic activity of nicotinate 3-hydroxypyridine and its liposomal form at dexamethasone induced metabolic disorders. Modern problems of Science and Education. 2017; 2. (In Russ.)] Доступно по: URL: https://science-education.ru/ru/ article/view?id=26316. Ссылка активна на 25.10.2022.
9. Гомоляко И.В., Бальцева Л.Б., Черенько С.А., Морозенко Л.П. Способ моделирования сахарного диабета: а. с. 1629916 СССР: МКИ 5 G 09 B 23/28 / (СССР). № 4467466/14; заявл. 27.07.88; опубл. 23.02.91., Бюл. № 7. 3 с. [Gomolyako I.V., Baltseva L.B., Cheren'ko S.A., Morozenko L.P. Sposob modelirovaniya sakharnogo diabeta: а. с. 1629916 the USSR Cl. 5 G 09 B 23.28. (USSR). № 4467466/14; declared 27.07.88; published 23.02.91 bulletin № 7. p. 3 (In Russ.)]
10. Gfeller D., Michielin O., Zoite V. Shaping the interaction landscape of bioactive molecules. Bioinformatics. 2013; 29(23):3073-3079.
УДК 616-001.35-547.99 DOI 10.24412/2220-7880-2023-1-55-62
КОРРЕКЦИЯ СИСТЕМНОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ КОМПРЕССИОННОЙ ТРАВМЕ МЯГКИХ ТКАНЕЙ У КРЫС ЛОКАЛЬНЫМ ВВЕДЕНИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
'Шулепов А.В., 'Шперлинг Н.В., 'Юркевич Ю.В., 2Шперлинг М.И., Минаева Л.В.
'ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Министерства обороны Российской Федерации, г. Санкт-Петербург, Россия (195043, ул. Лесопарковая, 4), e-mail: gniiivm_2@mail.ru
2ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6, лит. Ж)
Цель исследования - оценить динамику уровня провоспалительных и противовоспалительных цитоки-нов в крови животных при продолжительной компрессии конечности после локального введения гиалу-роновой кислоты (ГК). Эксперименты выполнены на 66 крысах-самцах линии Вистар, разделенных на группы: основную (n=28), сравнения (n=28), интактную (n=10). Животные основной и группы сравнения подвергались продолжительной компрессии мягких тканей бедра (7 ч). Через 3 ч после компрессии животным основной группы локально вводили 1,75%-ный раствор ГК, группы сравнения - 0,9%-ный раствор натрия хлорида. Через 3, 7, 14, 28 сут. после компрессии изучали динамику индекса отека/атрофии, уровень в крови миоглобина, калия, провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-6) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов. Локальное применение ГК приводило к уменьшению отека мягких тканей бедра в раннем посттравматическом периоде и незначительной атрофии мышц в восстановительном периоде. Через 3-7 сут. после применения ГК в крови у крыс снижался уровень: миоглобина - на 20-31,5% (p<0,05), калия - на 33,4% (p<0,05), ИЛ-10 - на 40-43% (p<0,05), ИЛ-6 - на 21-40% (p<0,05), ФНО-а - на 31-36% (p<0,05) по сравнению с показателями у животных в группе сравнения. К 14-м сут. продукция ИЛ-10 в основной группе снижалась на 33% (p<0,05), а ИЛ-6 и ФНО-а - в 1,4-1,5 раза (p<0,05) относительно предыдущих данных. На 28-е сут. эксперимента уровни ИЛ-10, ФНО-а и ИЛ-6 оставались без динамики. Введение ГК повышало в крови уровня ИЛ-10 (в 2,8-2,9 раза, p<0,05) по сравнению с его уровнем у интактных животных, преимущественно на 14-28-е сут. При экспериментальной компрессионной травме локальное введение ГК в область сдавления уменьшает локальный отек, выраженность системной воспалительной реакции, стимулирует раннюю активацию системного противовоспалительного ответа.
Ключевые слова: синдром длительного сдавливания, компрессионная травма, гиалуроновая кислота, скелетная мышца, рабдомиолиз, цитокины, системная воспалительная реакция.
CORRECTION OF THE SYSTEMIC INFLAMMATORY REACTION IN COMPRESSION INJURY OF SOFT TISSUES IN RATS BY LOCAL INTRODUCTION OF HYALURONIC ACID
'Shulepov A.V., 'Shperling N.V., 'Yurkevich Yu.V, 2Shperling M.I., 2Minaeva L.V
'State Scientific Research Test Institute of the military medicine of the Russian Federation Defense Ministry, Saint-
Petersburg, Russia (195043, Saint-Petersburg, Lesoparkovaya St., 4), e-mail: gniiivm_2@mail.ru
2Military Medical Academy named after S.M. Kirov, Saint-Petersburg, Russia (194044, Saint-Petersburg, Lebedev St., 6 Zh)
The aim of the study was to evaluate the dynamics of the level of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in the blood of animals during prolonged limb compression after a local injection of hyaluronic acid (HA). Experiments were performed on 66 male Wistar rats divided into groups: main (n=28), comparison (n=28), intact (n=10). Animals of the main and comparison groups were subjected to prolonged compression of the soft tissues of the thigh (7 h). 3 hours after compression, the animals of the main group were injected locally with 1.75% HA solution, the comparison group - 0.9% sodium chloride solution. 3, 7, 14, 28 days after compression, the dynamics of the edema/atrophy index, blood levels of myoglobin, potassium, pro-inflammatory (TNF-a, IL-ip, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokines were studied. Local application of HA led to a decrease in edema of the soft tissues of the thigh in the early post-traumatic period and slight muscle atrophy in the recovery period. 3-7 days after the application of HA in the blood of rats, the level decreased; myoglobin -by 20-31.5% (p<0.05), potassium - by 33.4% (p<0.05), IL-ip - by 40-43% (p<0.05), IL -6 - by 21-40% (p<0.05), TNF-a - by 31-36% (p<0.05) compared with the indices in animals in the comparison group. By day 14, the production of IL-1P in the main group decreased by 33% (p<0.05), and IL-6 and TNF-a - by 1.4-1.5 times (p<0.05) relative to the previous data. On the 28th day of the experiment, the levels of IL-1P, TNF-a, and IL-6 remained unchanged. The introduction of HA increased the level of IL-10 in the blood (by 2.8-2.9 times, p<0.05) compared with its level in intact animals, mainly on days 14-28. In experimental compression injury, local administration of HA to the area of compression reduces local edema, the severity of the systemic inflammatory response, and stimulates early activation of the systemic anti-inflammatory response.
Keywords: crush syndrome, compression injury, hyaluronic acid, skeletal muscle, rhabdomyolysis, cytokines, systemic inflammatory response syndrome.
Введение
При длительном сдавлении большой массы мягких тканей развиваются опасные для жизни пост-ишемические патологические изменения, в основе которых лежит обусловленный реперфузией цитолиз, мембраногенный отек, выброс в кровоток токсических продуктов [1]. Не менее значимыми в патогенезе продолжительного статического компрессионного воздействия являются ответные реакции иммунной системы организма. Локальное повреждение мягких тканей при продолжительной компрессии нередко приводит к развитию раннего системного воспалительного ответа (SIRS - systemic inflammatory response syndrome), ведущим механизмом которого признается неконтролируемое распространение в крови провоспалитель-ных или сигнальных цитокинов [2, 3]. Первоначально SIRS запускается поступлением цитокинов из очага повреждения [4]. В последующем генерализованный воспалительный ответ может самоподдерживаться в отсутствие первоначально запустивших его стимулов
[5]. Уменьшение деструкции тканей и выраженности локального воспалительного ответа является одним из перспективных подходов восстановительного лечения
[6]. В последнее время наиболее широко в хирургии повреждений стали использовать протективные и регенеративные свойства гидрогелей на основе гиалуро-новой кислоты [7]. Гиалуроновая кислота составляет основное вещество внеклеточного матрикса, образует высокогидрофильную среду, участвует в регуляции коллагенообразования, проявляет различные иммунологические свойства в зависимости от молекулярного размера [8]. Высокомолекулярная гиалуроновая кислота (выше 1000 кДа) тормозит высвобождение про-воспалительных цитокинов, ослабляет течение воспаления, обеспечивает защиту тканей от повреждения
и их регенерацию [9]. Есть основания полагать, что высокомолекулярная гиалуроновая кислота при локальном применении в область повреждения мягких тканей может снизить выраженность системного воспалительного ответа.
Цель исследования - оценить динамику уровня провоспалительных и противовоспалительных цито-кинов в крови животных при продолжительной компрессии мягких тканей конечности после локального введения в область сдавления геля высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на 66 беспородных крысах-самцах линии Вистар возрастом 3,5-4,0 мес. и массой 320±20 г, полученных из питомника «Раппо-лово» (Ленинградская область, Россия). Исследование одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ (протокол № 13 от 22.06.2020). Экспериментальные животные проходили 14-дневный карантин со свободным доступом к пище, воде. Непосредственно перед исследованием все крысы были разделены на 3 группы: основную (п=28), группу сравнения (п=28) и интактную (п=10). После предварительной наркотизации внутримышечным введением смеси зо-летила и ксилазина (по 10 мг/кг массы животного каждого препарата) крысы основной и группы сравнения были подвергнуты механической компрессии мягких тканей одного бедра с помощью металлических тисков [10]. Продолжительность компрессии составляла 7 ч, сила сдавления - 10-12 кг/см2. Противоположная тазовая конечность сдавлению не подвергалась. Через 3 ч после устранения компрессии животным основной группы локально в область повреждения в толщу мышц веерным способом вводили 1,75%-ный раствор гиалу-
роновой кислоты в объеме 2,0 мл/кг, который готовили путем разбавления препарата Гиалифт 3,5 (Испания) водой для инъекций в соотношении 1:1; животным группы сравнения - локально вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида в аналогичном объеме. Препарат Гиалифт 3,5 содержит несшитую нестабилизированную гиалуроновую кислоту, имеющую преимущественно высокую молекулярную массу.
Исследования проводили через 3, 7, 14 и 28 сут. после прекращения компрессии конечности, что соответствовало переходным срокам фаз воспаления (ранний период, 3-7 сут.), пролиферации (промежуточный период, 14 сут.) и регенерации (восстановительный период, 28 сут.). Для оценки развития отека поврежденной тазовой конечности проводили определение длины окружности бедра на уровне его средней трети [11]. Значения выражали индексом отека/атрофии, который представлял собой отношение длины окружности средней трети травмированного бедра к длине окружности бедра неповрежденной контралатеральной конечности.
В качестве показателя рабдомиолиза исследовали содержание миоглобина и калия в сыворотке крови. Содержание миоглобина (нг/мл) измеряли методом твердофазного ИФА с применением двух типов моноклональных антител (АО «Вектор-Бест», Россия) на автоматическом анализаторе ChemWell 2910 (Awareness Technology, США) [12]. Концентрацию калия оценивали турбодиметрическим методом с использованием набора «Калий-Ольвекс» (ООО «Оль-векс Диагностикум», Россия).
Динамику системного воспалительного ответа на разных стадиях посткомпрессионного периода исследовали по изменению содержания в сыворотке периферической крови провоспалительных (фактор некроза опухоли альфа - ФНО-а, интерлейкин-1р -ИЛ-1Р, интерлейкин-6 - ИЛ-6) и противовоспалительных (интерлейкин-10 - ИЛ-10) цитокинов. Профиль циркулирующих цитокинов оценивали методом мультиплексного иммунного анализа [13] на установке Bio-Plex (Bio-Rad Laboratories, USA, CA) с соответствующими наборами реагентов Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine Th1/Th2 Assay.
Статистический анализ результатов исследования осуществляли с использованием программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Определение типа распределения данных проводили по критерию Шапиро - Уилка. Непрерывные переменные в исследуемых выборках представлены в виде медианы (Ме) с 1-м и 3-м квартилями [Q25; Q75]. Для определения статистической значимости различий между двумя сравниваемыми выборками использовали критерий Манна - Уитни, различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования
Показатели отека травмированной конечности.
В ранние сроки после прекращения компрессии (через 3 сут.) отмечался выраженный отек поврежденной тазовой конечности, объем бедра при этом был увеличен на 20% (p<0,05) относительно показателей у интактных животных. В дальнейшем (спустя 7-14 сут. после травмы) отек снижался, а значения индекса отека/атрофии к 14-м сут. соответствовали значению у интактных крыс. В восстановительный период (14-28 сут.) объем бедра сдавленной конечности по сравнению с объемом бедра контралатеральной конечности уменьшился на 25,8% (p<0,05), свидетельствуя о развитии посттравматической атрофии.
Локальное применение геля гиалуроновой кислоты приводило к уменьшению отека мягких тканей бедра поврежденной тазовой конечности в раннем посттравматическом периоде на 5,0-5,9% (р<0,05) по отношению к значениям у животных из группы сравнения. В последующем объем бедра сдавленной конечности снижался и к 14-м сут. был в пределах значений у интактных животных. Достоверных различий между группами животных, которым локально вводили гель гиалуроновой кислоты и 0,9%-ный раствор натрия хлорида, в эти сроки не наблюдалось.
В восстановительный период (28-е сут. после устранения компрессии) длина окружности бедра поврежденной тазовой конечности после локального введения гиалуроновой кислоты была увеличена на 13,3% (р<0,05) по отношению к животным, которым вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида, что свидетельствовало о менее выраженной атрофии скелетных мышц конечности (табл. 1).
Таблица 1
Индекс отека/атрофии мягких тканей травмированной конечности крыс при локальном введении в область сдавления геля гиалуроновой кислоты, Ме ^25; Q75]
Группы исследования Срок наблюдения, сутки n Индекс отека/ атрофии
Контрольная группа (интактные животные) 10 1,01 [0,97; 1,04]
Группа сравнения (локальное введение 0,9%-ного раствора натрия хлорида) 3 8 1,20* [1,18; 1,23]
7 8 1,18* [1,15; 1,20]
14 6 1,06*** [1,05; 1,08]
28 6 0 75* *** [0,74; 0,76]
Основная группа (локальное введение геля гиалуроновой кислоты) 3 8 1 14* ** [1,11; 1,16]
7 8 1 11* ** [1,07; 1,13]
14 6 103*** [1,01; 1,05]
28 6 0 85* ** *** [0,84; 0,87]
Примечание (здесь и в табл. 2): *р<0,05 - различия достоверны по сравнению с интактными животными; **р<0,05 - различия достоверны по сравнению с животными группы сравнения; ***р<0,05 - различия достоверны по сравнению с предыдущим сроком наблюдения; п - количество животных; Ме - медиана; Q25; Q75 - 1-й и 3-й квартили.
Содержание в сыворотке крови продуктов рабдомиолиза (миоглобин, калий).
Максимальное значение сывороточного миоглобина после продолжительного сдавления конечности отмечалось в ранний посткомпрессионный период (спустя 3 сут. после прекращения компрессии), в 12,7 раза (р<0,05) превышая уровень у интактных животных. В промежуточный период содержание сывороточного миоглобина снижалось, однако к началу периода восстановления (14-е сут.) оставалось повышенным в 8,4 раза (р<0,05) относительно значений у интактных крыс. К окончанию периода наблюдения (28-е сут.) содержание миоглоби-
на в сыворотке крови значимо снижалось по сравнению с предшествующим периодом наблюдения (на 48%, р<0,05), не достигая значений у интактных животных.
Локальное введение геля гиалуроновой кислоты в область компрессии мягких тканей приводило к менее выраженному приросту содержания сывороточного миоглобина в раннем и промежуточном посткомпрессионном периодах. Отличия по сравнению с уровнем миоглобина сыворотки крови животных, которым локально вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида, составляли 20,0-31,5% (р<0,05). В восстановительный период (через 28 сут. после компрессионной травмы) уровень миоглобина в сыворотке крови крыс при локальном применении геля гиалуро-новой кислоты не имел различий с его содержанием у травмированных животных группы сравнения.
Сходная динамика наблюдались в содержании в крови калия. В группе сравнения (после локального применения 0,9%-ного раствора натрия хлорида) к исходу 3-х сут. посткомпрессионного периода отмечалось наиболее выраженное повышение концентрации калия (на 83%, р<0,05) относительно уровня в крови интактных крыс. В последующем, в промежуточный посткомпрессионный период (через 7-14 сут. после прекращения компрессии), содержание калия в крови снижалось до значений, установленных в группе интактных животных. К концу периода наблюдения (28-е сут.) достоверных различий в содержании калия в крови животных группы сравнения и интакт-ной группы также не выявлено.
При локальном введении травмированным животным геля гиалуроновой кислоты (основная группа) отмечался менее выраженный прирост содержания калия в сыворотке крови в раннем посткомпрессионном периоде. Через 3 сут. после прекращения сдавления уровень калия был на 33,4% (р<0,05) ниже относительно его содержания у животных, которым вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида. В последующие сроки наблюдения концентрация калия в сыворотке крови животных основной группы и группы сравнения не имела значимых различий (табл. 2).
Показатели уровня цитокинов в сыворотке крови.
Продолжительная компрессия мягких тканей конечности сопровождалась изменениями баланса циркулирующих провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (табл. 3). Ранний посткомпрессионный период характеризовался существенным повышением уровня исследуемых про-
воспалительных цитокинов (ИЛ-1Р, ФНО-а, ИЛ-6) в циркуляторном русле травмированных животных группы сравнения, которым в область сдавления вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида. Наиболее выраженный прирост провоспалительных медиаторов характерен для ИЛ-1р. Через 3 и 7 сут. после прекращения компрессии конечности содержание в сыворотке периферической крови этого цитокина в 6,3-7,1 раза (р<0,05) превышало значения у интактных животных. Мониторинг содержания в периферической крови ИЛ-6 к исходу 3-х и 7-х сут. после травмы также показал выраженный рост активности по сравнению с контролем (в 5,0-6,2 раза, р<0,05). Пиковые значения уровня ФНО-а в сыворотке крови в эти сроки наблюдения были менее выраженными по сравнению с содержанием в крови ИЛ-1Р, однако значимо (в 2,7-3,6 раза, р<0,05) превышали показатель у контрольных (интактных) животных.
Таблица 2
Содержание миоглобина (нг/мл) и калия (ммоль/л) в сыворотке крови травмированных
крыс при локальном введении в область сдавления мягких тканей геля гиалуроновой кислоты, Ме ^25; Q75]
Группы исследования Срок наблюдения, сутки п Показатели
Миоглобин, нг/мл Калий, ммоль/л
Контрольная группа (интактные животные) 10 77,5 [69,0; 90,0] 4,1 [3,9; 4,4]
Группа сравнения (локальное введение 0,9%-ного натрия хлорида) 3 8 981,4* [922,8; 1040,0] 7,5* [7,2; 8,0]
7 8 871,2* [823,8; 918,6] 4,7 [4,1; 5,0]
14 6 652 6* *** [589,9; 715,3] 3,4 [3,2; 3,8]
28 6 339 3* *** [288,8; 391,4] 3,6 [3,3; 4,2]
Основная группа (локальное введение геля гиалу-роновой кислоты) 3 8 776 1* ** [716,9; 838,3] 5,0*, ** [4,7; 5,6]
7 8 694,0*, ** [630,4; 707,3] 4,1 [3,5; 4,4]
14 6 447,2*, **, *** [386,0; 507,2] 3,5 [3,3; 3,9]
28 6 340,0* [289,2; 392,2] 4,4 [4,1; 5,0]
Таблица 3
Содержание провоспалительных (ИЛ-1Р, ФНО-а, ИЛ-6) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови крыс при регионарном внутримышечном введении геля гиалуроновой кислоты в область статической компрессии мягких тканей конечности, Ме ^25; Q75]
Группы исследования Срок наблюдения, сут. п Содержание цитокинов в сыворотке крови (пг/мл)
ИЛ-1Р ФНО-а ИЛ-6 ИЛ-10
Контроль (интактные животные) 10 7,7 [7,4; 8,1] 6,4 [6,3; 6,5] 4,6 [4,1; 4,9] 3,2 [1,8; 4,0]
Группа сравнения (0,9%-ный р-р натрия хлорида) 3 8 48,4* [42,6; 52,3] 17,6* [15,7; 23,1] 28,7* [24,0; 32,8] 5,3 [3,2; 7,1]
7 8 54,3* [51,2; 56,5] 23,4* [20,5; 26,3] 23,2* [21,9; 26,1] 6,8 [3,4; 10,0]
14 6 28 6* *** [26,6; 30,8] 16 2* *** [14,5; 18,8] 15 4* *** [14,9; 17,6] 19 4* *** [17,8; 23,3]
28 6 18 4* *** [15,7; 21,4] 14,8* [12,0; 17,4] 13,5* [13,2; 15,6] 16,8* [16,1; 18,6]
Основная группа (гиалуроновая кислота) 3 8 29 2* ** [26,9; 30,9] 113* ** [9,2; 14,3] 17 1* ** [13,9; 19,4] 8,9* [7,8; 10,8]
7 8 30 7* ** [28,0; 32,1] 16 2* ** [12,6; 18,6] 18 4* ** [15,9; 21,8] 9,2* [7,3; 12,7]
14 6 19 2* ** *** [18,9; 19,7] 14,3* [13,6; 16,2] 13,5* [12,0; 15,7] 12 4* ** [11,0; 16,2]
28 6 16,6* [15,3; 17,7] 12,6* [9,8; 15,2] 11,2* [9,2; 13,5] 11 2* ** [10,4; 12,5]
Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,05) по сравнению с интактными животными; ** -различия статистически значимы (р<0,05) по сравнению с животными группы сравнения; *** - различия статистически значимы (р<0,05) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения; ИЛ-1@- интерлейкин 1 бета; ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа; ИЛ-6 - интерлейкин 6; ИЛ-10 - интерлейкин 10; п - количество животных; Ме - медиана; ^25; Q75 - 1-й и 3-й квартили.
Локальное внутримышечное введение в область ло в данный срок наблюдения влияния на уровень
компрессии мягких тканей конечности геля гиалуро-новой кислоты сопровождалось в ранний посттравматический период менее значимым приростом в крови уровня провоспалительных цитокинов. Через 3 и 7 сут. после декомпрессии содержание в сыворотке крови ИЛ-1Р было на 40-43% (р<0,05) ниже значений у травмированных животных группы сравнения, которым в область сдавления внутримышечно вводили изотонический солевой раствор. Среднее значение цитокина тем не менее оставалось достоверно выше по сравнению с контролем в 3,8-4,0 раза (р<0,05). Динамика изменений в ранний период после компрессионной травмы уровня ИЛ-1Р соответствовала результатам мониторирования в сыворотке периферической крови ИЛ-6 и ФНО-а. При внутримышечном регионарном введении в область компрессии геля гиалуроновой кислоты содержание ИЛ-6 через 3 и 7 сут. после травмы было на 40% (р<0,05) и 21% (р<0,05) ниже показателя у животных группы сравнения, которым после декомпрессии локально вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида, однако относительно исходных значений у интактных не-травмированных животных содержание в крови ИЛ-6 оставалось выше в 3,7-4,0 раза (р<0,05).
Содержание ФНО-а в сыворотке крови животных основной группы через 3 и 7 сут. после декомпрессии было снижено относительно группы сравнения на 36% (р<0,05) и 31% (р<0,05), превышая, однако, в 1,7-2,5 раза (р<0,05) показатель в контрольной группе.
В промежуточном посткомпрессионном периоде (через 14 сут. после травмы) у животных группы сравнения, которым локально вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида, отмечалось в среднем двукратное снижение сывороточного уровня ИЛ-1Р по сравнению с его значением в ранние сроки после прекращения компрессии, который все же оставался значимо выше (в 3,7 раза, р<0,05) показателя интактных животных. При введении травмированным животным в область компрессии мягких тканей геля гиалуроновой кислоты уровень циркулирующего ИЛ-1Р в среднем на 33% (р<0,05) был ниже показателя группы сравнения, оставаясь в 2,5 раза (р<0,05) выше содержания цитокина в крови интактных животных. В поздний посткомпрессионный период (через 28 сут.) у травмированных животных группы сравнения регистрировалась дальнейшая спонтанная убыль содержания ИЛ-1Р в периферической крови, не достигающая тем не менее в 2,4 раза (р<0,05) значений у интакт-ных животных. Локальное применение в область сдавления геля гиалуроновой кислоты не оказыва-
ИЛ-1Р в сыворотке крови.
Аналогичная динамика реакции провоспали-тельных цитокинов на статическую компрессию мягких тканей отмечалась у животных группы сравнения при определении в промежуточный и поздний посткомпрессионный периоды содержания циркулирующих ФНО-а и ИЛ-6. К исходу 14-х сут. после продолжительного сдавления мягких тканей уровень ФНО-а и ИЛ-6 в сыворотке крови животных, которым локально вводили солевой изотонический раствор, в равной мере снижался в 1,4-1,5 раза (р<0,05) относительно содержания в ранний период после сдавле-ния, оставаясь, однако, в 2,5-3,3 раза (р<0,05) выше значений интактных животных. В поздний посттравматический период (через 28 сут. после компрессии) показатели ФНО-а и ИЛ-6 оставались без существенных изменений, в 2,3-2,9 раза (р<0,05) превышая их содержание в крови интактных животных.
Внутримышечное введение в область сдав-ления мягких тканей геля гиалуроновой кислоты не изменяло в промежуточный и поздний периоды после компрессионной травмы содержание в крови ФНО-а и ИЛ-6. Уровни данных цитокинов в эти сроки наблюдения в 2,0-2,4 раза (р<0,05) оставались выше значений, установленных в группе интактных животных, не отличаясь от содержания в крови травмированных животных группы сравнения.
В отличие от профиля исследуемых циркулирующих провоспалительных цитокинов содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в ранний посттравматический период (через 3 и 7 сут. после прекращения компрессии мягких тканей) у животных, которым локально вводили солевой изотонический раствор, повышалось несущественно, оставаясь на уровне диапазона значений интактных животных. Повышенные уровни цитокина в сыворотке крови регистрировались у животных этой группы не ранее промежуточного периода (через 14 сут.), в 6,1 раза (р<0,05) превышая контрольные значения нетравми-рованных животных. В поздние сроки исследования (через 28 сут.) содержание циркулирующего ИЛ-10 существенно не изменялось и оставалось в 5,2 раза (р<0,05) выше контрольных значений.
Внутримышечное введение в область компрессии мягких тканей геля гиалуроновой кислоты характеризовалось в ранний посткомпрессионный период (через 3-7 сут. после травмы) умеренным повышением в крови уровня ИЛ-10 (в 2,8-2,9 раза, р<0,05) по сравнению с содержанием циркулирующего цитоки-на у нетравмированных животных. В последующие сроки исследования (через 14-28 сут. после травмы) содержание ИЛ-10 в сыворотке крови оставалось в
тех же пределах, на 33-36% (р<0,05) ниже значений, установленных у животных группы сравнения.
обсуждение
Продолжительная компрессия мягких тканей тазовой конечности экспериментальных животных приводила в ранние сроки после травмы к формированию отека области сдавления, что является следствием увеличения проницаемости сосудов микро-циркуляторного русла и усиления транскапиллярной фильтрации жидкости [14]. Одновременно наблюдалось значительное повышение уровней миоглобина и калия в крови как результат деструкции скелетных мышц и развития рабдомиолиза [11].
Локальное применение геля гиалуроновой кислоты снижало выраженность посттравматического отека мягких тканей бедра тазовой конечности, сопровождалось менее выраженным приростом содержания миоглобина и калия в сыворотке крови. Есть основания полагать, что причинные связи такого эффекта в раннем периоде после механического сдавле-ния обусловлены структурной организацией гиалуроновой кислоты, которая обеспечивает вязкоупругие и водоудерживающие свойства, позволяющие связывать и достаточно продолжительно удерживать большое количество молекул воды [15], снижая тем самым выход токсических продуктов рабдомиолиза в циркулирующее русло. Формирующиеся трехмерные сетки гиалуроновой кислоты приводят к увеличению вязкоупругих свойств раствора [16]. Наличие полярных и неполярных сегментов в структуре гиалуроно-вой кислоты также придает ей способность взаимодействовать с различными химическими агентами, а ионные связи солей высокомолекулярной гиалуро-новой кислоты приводят к образованию геля с выраженными гидрофильными свойствами [17].
Длительная компрессия мягких тканей сопровождалась существенным изменением баланса про-воспалительных и противовоспалительных цитоки-нов в сторону увеличения доли провоспалительных компонентов. Наблюдаемое увеличение концентрации циркулирующих провоспалительных цитоки-нов (ИЛ-1р, ФНО-а, ИЛ-6) с преимущественным повышением в сыворотке крови уровня ИЛ-1Р в раннем посткомпрессионном периоде (3-7 сут.) обусловлено развитием реперфузионной токсемии, выходом в периферическую кровь провоспалительных сигнальных молекул и формированием системного воспалительного ответа [2]. При этом выбросом про-воспалительных цитокинов организм реагирует уже в начальный период ишемии-реперфузии. Динамика уровня сывороточного ИЛ-1Р может отражать массивное компрессионное повреждение мягких тканей, повергнутых ишемии-реперфузии и, как следствие, массивный выход аларминов [11].
Противовоспалительный цитокин ИЛ-10 отличался устойчивым ростом в периферическом кровотоке в промежуточном и позднем посткомпрессионном периоде (периоде реперфузии). Очевидно, исследуемые про- и противовоспалительные цитокины, являясь обязательными участниками воспалительного процесса, оказываются за счет своего дистантного действия эффекторами системной воспалительной реакции [3, 18]. Выраженный цитокиногенез может приводить к генерализации воспалительного процесса в органах и тканях, удаленных от первичного очага повреждения, с развитием полиорганной недо-
статочности [19]. Проведенные исследования демонстрируют один из значимых механизмов инициации системного воспаления с вовлечением про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на травматическое повреждение. Вполне вероятно, что именно дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов является свидетельством основных проявлений и патогенетических звеньев системного воспалительного ответа при компрессионной травме.
Локальное внутримышечное введение в область компрессии мягких тканей конечности геля гиалуро-новой кислоты сопровождалось в ранний посттравматический период менее значимым приростом в крови уровня ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6 на фоне умеренного прироста содержания ИЛ-10, свидетельствуя о способности высокомолекулярной гиалуроновой кислоты снижать проявления системного дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов, уменьшать постишемическое повреждение скелетных мышц и выраженность рабдомиолиза. Основания для такого заключения вполне закономерны. Высокомолекулярная гиалуроновая кислота не только функционирует как гидрофильный наполнитель внеклеточного пространства, но и обладает широким спектром биологической активности, включая противовоспалительную и антиангиогенную, что обеспечивает благоприятное течение процессов в фазу как острого воспаления, так и репаративной регенерации. Раннее применение высокомолекулярной гиалуроновой кислоты в фазу воспаления блокирует взаимодействие короткоцепочечной низкомолекулярной гиалуроно-вой кислоты с провоспалительными рецепторами клеточной поверхности, что снижает активность воспалительных клеток в ране, уменьшает в последующем фиброз и образование патологических рубцов [20]. Гиалуроновая кислота проявляет высокую аффинность связывания с CD44 в фибробластах и устойчивость к диссоциации по мере увеличения ее молекулярной массы [21]. Экзогенно введенная гиалуроновая кислота, связываясь с CD44 в эпидер-мальных или фибробластных клетках, приводит к генетической экспрессии, связанной с ускорением заживления ран, и, по-видимому, стимулируется сигнальной трансдукцией CD44 [22]. Снижение проявлений воспалительного ответа под влиянием высокомолекулярной гиалуроновой кислоты ассоциировано с ингибированием выработки макрофагами провос-палительных цитокинов (ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6) посредством подавления транскрипционных факторов NF-kappa B и I-kappa B alpha через сайты связывания с молекулами межклеточной адгезии ICAM-1 [23]. Интраартикулярное введение высокомолекулярной гиалуроновой кислоты значительно снижало объем выпота и повышенное содержание ИЛ-6 при остео-артрите коленного сустава, коррелируя с клиническим улучшением [24]. При местном применении в зону повреждения периферического нерва высокомолекулярная гиалуроновая кислота проявляла способность снижать индуцированную травмирующим воздействием экспрессию провоспалительных факторов (ИЛ-ip, ФНО-а, То1-подобных рецепторов, матрикс-ных металлопротеиназ) [25].
Следовательно, оценка содержания циркулирующих провоспалительных и противовоспалительных цитокинов свидетельствует о возможности ослабления формирования системного воспалительного ответа в условиях локального введения геля высокомоле-
кулярной гиалуроновой кислоты в область сдавления. Наиболее выраженная модификация воспалительного ответа цитокинов наблюдается в ранний период после продолжительной компрессии мягких тканей.
Выводы
1. Продолжительная статическая компрессия мягких тканей конечности является пусковым фактором формирования ишемии-реперфузии с усилением продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов - основных участников системного воспалительного ответа.
2. Ранний посткомпрессионный период характеризуется увеличением содержания в сыворотке крови провоспалительных цитокинов (ИЛ-1Р, ФНО-а, ИЛ-6). В промежуточный и восстановительный периоды происходит смещение баланса циркулирующих цитокинов в сторону повышения уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-10.
3. Внутримышечное введение в область сдавле-ния геля высокомолекулярной гиалуроновой кислоты через 3 ч после прекращения компрессии снижает индуцированный травмой уровень циркулирующих провоспалительных цитокинов (ИЛ-1Р, ФНО-а, ИЛ-6) в раннем посткомпрессионном периоде, а также содержание противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10) в промежуточном и восстановительном периодах.
4. Процедура раннего (через 3 ч после прекращения компрессии) внутримышечного обкалывания гелем высокомолекулярной гиалуроновой кислоты области сдавления уменьшает выраженность ише-мического отека мягких тканей конечности, а также проявления посткомпрессионного рабдомиолиза, что может рассматриваться как перспективный подход снижения реперфузионных осложнений острой ише-мической травмы конечности.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явного или потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией статьи.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Литература/References
1. Murata I., Miyake Y., Takahashi N. et al. Low-dose sodium nitrite fluid resuscitation prevents lethality from crush syndrome by improving nitric oxide consumption and preventing myoglobin cytotoxicity in kidney in a rat model. Shock. 2017;48(1):112-118. DOI: 10.1097/SHK.0000000000000817.
2. Xu P., Wang F., Zhou X.-L., et al. Systemic inflammatory response and multiple organ dysfunctions following crush injury: a new experimental model in rabbits. Inflammation. 2018;41(1):240-248. DOI: 10.1007/s10753-017-0683-5.
3. Relja B., Mors K., Marzi I. Danger signals in trauma. Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 2018;44(3):301-316. DOI: 10.1007/s00068-018-0962-3.
4. Gaballah M.H., Horita T., Takamiya M., et al. Time-dependent changes in local and serum levels of inflammatory cytokines as markers for incised wound aging of skeletal muscles. Tohoku J. Exp. Med. 2018;245(1):29-35. DOI: 10.1620/tjem.245.29.
5. Ляпина С.А., Федотова Г.Г. Реактивные изменения нейтрофилов при бронхолегочных заболеваниях // Современные проблемы науки и образования. 2018. №6. С. 1-6. [Lyapina S.A., Fedotova G.G. Reactive changes of neutrophiles in bronchopulmonary diseases. Modern Problems of Science and Education. 2018;(6):1-6. (In Russ.)]
6. Шулепов А.В., Шперлинг Н.В., Юркевич Ю.В. и др. Регенеративные эффекты регионарного применения мезенхимных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой кислоты при экспериментальной компрессионной травме мягких тканей // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2018. №1. С.75-83. [Shulepov A.V., Shperling N.V., Yurkevich Yu.V. et al. Regenerative effects of regional introduction of mesenchymal stromal human cells in hyaluronic acid gel under experimental compression trauma of soft tissues. Mediko-biologicheskie i sotsial'no-psikhologicheskie problemy bezopasnosti v chrezvychainykh situatsiyakh. 2018;(1):75-83. (In Russ.)] DOI: 10.25016/2541-7487-2018-0-1-75-83.
7. Aya K.L., Stern R. Hyaluronan in wound healing: rediscovering a major player. Wound Repair Regen. 2014;22(5):579-593. DOI: 10.1111/wrr.12214.
8. Johnson P., Arif A.A., Lee-Sayer S.S.M., Dong Y. Hyaluronan and its interactions with immune cells in the healthy and inflamed lung. Front. Immunol. 2018;(9):2787-2795. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02787.
9. Petrey A.C., Motte C.A. Hyaluronan, a crucial regulator of inflammation. Front. Immunol. 2014;11(5):101. DOI: 10.3389/fimmu.2014.00101.
10. Шперлинг И.А., Шулепов А.В., Шперлинг Н.В., и др. Саногенетические и фармакологические эффекты локального применения гиалуроновой кислоты при экспериментальной компрессионной травме мягких тканей // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2020. Т.10, №2. С.53-60. [Shperling I.A., Shulepov A.V., Shperling N.V. et al. Sanogenetic and pharmacological effects of local application of Hyaluronic acid in experimental soft tissue compression trauma. Crimea Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2020;10(2):53-60. (In Russ.)] DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-2-53-60.
11. Wang W., Wang Yu., Yang J. Protective effects of ischemic postconditioning on skeletal muscle following crush syndrome in the rat. Acta Cir. Bras. 2021;36(7):e360701. doi. org/10.1590/ABC360701.
12. Обухова Л.М., Эделев Н.С., Андриянова Н.А., и др. Определение содержания миоглобина в крови в судебно-медицинской практике: методические особенности и перспективы // Судебно-медицинская экспертиза. 2016. Т.59, №4. С.57-60. [Obukhova L.M., Edelev N.S., Andriyanova N.A. et al. Determination of the blood myoglobin levels for the purpose of forensic medical expertise: the methodological peculiarities and the prospects for the further use. Sudebno-meditsinskaya ekspertisa. 2016;59(4):57-60. (In Russ.)] DOI: https://doi.org/10.17116/sudmed201659457-60.
13. Riteau N., Gombault A., Couillin I. Assessment of inflammasome activation by cytokine and danger signal detection. Methods Mol. Biol. 2016;1417:63-74. DOI: 10.1007/978-1-4939-3566-6_3.
14. Hanberg P., Bue M., Kabel J. et al. Tourniquet-induced ischemia and reperfusion in subcutaneous tissue, skeletal muscle, and calcaneal cancellous bone. APMIS. 2021;129(4):225-231. DOI: 10.1111/apm.13121.
15. Капулер О.М., Галеева А.Г., Сельская Б.Н., Ка-милов Ф. Гиалуронан: свойства и биологическая роль // Врач. 2015. №2. С.25-27. [Kapuler O.M., Galeeva A.G., Sel'skaya B.N., Kamilov F. Hyaluronan: properties and biological role. Vrach. 2015;(2): 25-27. (In Russ.)]
16. Fallacara A., Baldini E., Manfredini S., et al. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. Polymers (Basel). 2018;10(7):701-710. DOI: 10.3390/polym10070701.
17. Bui H.T., Friederich A.R., Li E., et al. Hyaluronan enhancement of expanded polytetrafluoroethylene
cardiovascular grafts. J. Biomater. Appl. 2018;33(1):52-63. DOI: 10.1177/0885328218776807.
18. Cheng A., Vantucci C.E., Krishnan L. et al. Early systemic immune biomarkers predict bone regeneration after trauma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2021;118(8):e2017889118. DOI: 10.1073/pnas.2017889118.
19. Гусев Е.Ю., Зотова Н.В. Патогенез и прогноз критических осложнений политравмы с позиции общепатологических процессов // Политравма. 2021. № 1. С. 97116. [Gusev E.Yu., Zotova N.V. Pathogenesis and prediction of critical complications of polytrauma from the position of common pathological processes. Polytrauma. 2021;(1):97-116. (In Russ.)] DOI: 10.24411/1819-1495-2021-10014.
20. Valachova K., Soltes L. Hyaluronan as a prominent biomolecule with numerous applications in medicine. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(13):7077. DOI: 10.3390/ijms22137077.
21. Price Z.K., Lokman N.A., Ricciardelli C. Differing roles of hyaluronan molecular weight on cancer cell behavior and chemotherapy resistance. Cancers (Basel). 2018;10(12):482. DOI: 10.3390/cancers10120482.
22. Murakami T., Otsuki S., Okamoto Y. et al. Hyaluronic acid promotes proliferation and migration of human meniscus cells via a CD44-dependent mechanism. Connect. Tissue Res. 2019;60(2):117-127. DOI: 10.1080/03008207.2018.1465053.
23. Lee C.H., Chiang C.F., Kuo F.C. et al. High-molecular-weight hyaluronic acid inhibits il-1P-induced synovial inflammation and macrophage polarization through the GRP78-NF-KB signaling pathway. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(21):11917. DOI: 10.3390/ijms222111917.
24. Otsuki T., Hatipoglu O.F., Asano K. et al. Induction of CEMIP in chondrocytes by inflammatory cytokines: underlying mechanisms and potential involvement in osteoarthritis. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(9):3140. DOI: 10.3390/ijms21093140.
25. Jou I.M., Wu T.T., Hsu Ch.Ch. et al. High molecular weight form of hyaluronic acid reduce neuroinflammatory response in injured sciatic nerve via the intracellular domain of CD44. J. Biomed. Mater. Res. 2021;109(5):673-680. DOI: 10.1002/jbm.b.34731.
УДК 616-007.15 DOI 10.24412/2220-7880-2023-1-62-67
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЧЕК ПЛОДА ПРИ ЗАДЕРЖКЕ ВНУТРИУТРОБНОГО РАЗВИТИЯ
'Юдицкий А.Д., 2Васильев Ю.Г., 1Коваленко Т.В.
'ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России, Ижевск, Россия (426034, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281), e-mail: antonyud103ped@mail.ru 2ФГБОУ ВО «Ижевская государственная сельскохозяйственная академия», Ижевск, Россия (426069, г. Ижевск, ул. Студенческая, 11)
Цель исследования: изучить морфологические особенности почек у плодов человека на сроке геста-ции 24—28 недель при задержке внутриутробного развития (ЗВУР). Проведено патоморфологическое исследование почек 18 плодов человека на сроке гестации 24-28 недель, из них 10 - с задержкой внутриутробного развития, 8 - соответствующих сроку гестации. При помощи качественного анализа и морфометрических методов доказано, что при задержке внутриутробного развития в рассматриваемый период развития наблюдаются значительная незрелость нефронов с высокой долей эмбриональных клубочков, деформация почечных телец и гипертрофия зрелых нефронов. У плодов с ЗВУР наблюдается значимое (p<0,001) абсолютное увеличение толщины нефрогенной зоны до 271,9±11,2 мкм, повышение интегрального показателя соотношения малодифференцированных почечных телец (стадии V, S, С) к относительно зрелым тельцам (стадии I, II, III) до 1,26±0,09 (p<0,001). При ЗВУР наблюдается значительный полиморфизм сосудистых клубочков с глубокими фенестрами и грубой деформацией. Таким образом, к гестационному возрасту 24-28 недель почки плодов с задержкой внутриутробного развития характеризуются глубокой морфологической незрелостью структур почечной паренхимы, замедлением нефрогенеза и комплексом морфологических изменений, ассоциированных с неблагоприятными отдаленными клиническими исходами.
Ключевые слова: задержка внутриутробного развития, почки, нефрогенез, клубочки.
INTRAUTERINE GROWTH RETARDATION. MORPHOLOGICAL FEATURES OF THE KIDNEYS IN THE FETUS
'YuditskiyA.D., 2Vasil'yev Yu.G., 'Kovalenko T.V.
'Izhevsk State Medical Academy of the Ministry of Health of Russia, Izhevsk, Russia (426034, Izhevsk, Kommunarov St., 281), e-mail: antonyud103ped@mail.ru
2Izhevsk State Agricultural Academy, Izhevsk, Russia (426069, Izhevsk, Studencheskaya St., 11)
The purpose of the study is to study the morphological features of the kidneys in human fetuses at the gestational age of 24-28 weeks with intrauterine growth retardation (IUGR). A pathological morphological study of the kidneys in 18 human fetuses at the gestational age of 24-28 weeks was carried out, 10 of them with
