CC BY
50
Balkhaev Illarion Mitrofanovich - candidate of medical sciences, associate professor, department of pharmacology and traditional medicine, medical faculty, Buryat State University. 670002, Ulan-Ude, Oktyabrskaya str., 36a. Tel. (3012) 44-82-55. E-mail: [email protected]
Shantanova Larisa Nikolaevna - doctor of biological sciences, professor, head of laboratory of safety of biological active substances, Institute of General and Experimental Biology, SB RAS; 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6. Tel. (3012) 43-37-13.
УДК 615.322
И.О. Убашеев, И.М. Бальхаев, А.Н. Плеханов
КОРРЕКЦИЯ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ОСТРОМ со4-гепатите тибетским лекарственным средством «манушитан»
В данной статье приведены результаты исследований фармакотерапевтической эффективности фитосредства тибетской медицины «манушитан» при экспериментальном СС14-гепатите. Установлено, что испытуемое средство, содержащее девясил высокий, софору желтоватую, имбирь лекарственный и бузину черную, оказывает гепатопротекторное действие при остром токсическом гепатите у белых крыс, ингибируя перекис-ное окисление липидов клеточных и субклеточных мембран, стимулируя регенераторные процессы в печени.
Ключевые слова: печень, острый гепатит, «Манушитан».
I.O. Ubasheev, I.M. Balkhaev, A.N. Plekhanov
CORRECTION OF HEPATIC FAILURE IN WHITE RATS AT ACUTE CCE-HEPATITIS BY TIBETAN REMEDY «MANUSHITAN»
4
This article presents the results of research n pharmacotherapeutical effectiveness of phytoremedy of Tibetan Medicine - «manushitan» at experimental CCl4-hepatitis. It has been revealed that the test remedy containing elfwort, Sophora yellowish, ginger and medicinal elder black, has a hepatoprotective effect on acute toxic hepatitis in white rats by inhibiting lipid peroxidation of cellular and subcellular membranes, stimulating regenerative processes in the liver.
Keywords: liver, acute hepatitis, «Manushitan».
До настоящего времени продолжаются дискуссии относительно понятия «печеночная недостаточность».
Мы остановимся только на двух группах этиологических факторов этого тяжелого патологического состояния организма.
1. Заболевания печени - гепатиты различного генеза, циррозы печени, рак, паразитарные поражения органа и др. В США и во всем мире наиболее частой причиной острой печеночной недостаточности являются вирусные гепатиты А, В, С,
Д, Е [16].
2. Интоксикации гепатотропными веществами (четыреххлористый углерод, бензол), лекарственными препаратами (парацетамол, антидепрессанты, нестероидные противовоспалительные средства, тетрациклин и др.) могут привести к сим-птомокомплексу недостаточности печени [8].
Цель настоящих исследований сводилась к оценке коррекции печеночной недостаточности у белых крыс при остром СС14-гепатите тибетского фитосредства «манушитан» (девясил высокий, софора желтоватая, имбирь лекарственный и бузина черная).
Материал и методы исследования
Отвар «манушитан» готовили из суховоздушного сырья по Государственной фармакопее РФ (1990) [3].
Острый токсический гепатит у белых крыс вызывали путем введения четыреххлористого углерода (СС14) в виде 50%-ного масляного раствора в объеме 0,4 мл/100 г массы животного, трехкратно через день, подкожно. Печень декапитированных под легким эфирным наркозом животных подвергали исследованию на 7-, 14-, 21-е сутки с начала эксперимента. Испытуемое лекарственное средство вводили в течение 14 дней внутрижелудочно в дозе 0,3 г/кг массы крысы. В качестве препарата сравнения животным вводили оротат калия в дозе 100 мг/кг. Животным контрольной группы вводили только раствор С^4.
Всего в опытах использовано 107 белых беспородных крыс с массой 175-190 г.
Для оценки функционального состояния печени при остром гепатите нами был применен ряд методик. В частности, для оценки фармакотерапевтической эффективности исследуемого лекарственного средства определяли степень активно-
сти аланинаминотрансферазы - АЛТ и аспартата-минотрансферазы - ACT [17], активности щелочной фосфатазы (унифицированный метод Вассея, Лоури и Брока с использованием набора реактивов Био-Ла-Тест, Чехословакия), концентрацию холестерина (метод Илька) и Р-липопротеидов (метод Бурштейна и Самай), содержание общего белка (биуретовая реакция), количество общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови (метод Иендрашека), показатель тимоловой пробы - метод Хуэрго и Поппер с набором реактивов Био-Ла-Тест, Чехословакия [4].
Для определения фракций белка в сыворотке крови использовали унифицированный метод электрофоретического разделения на пленках из ацетата целлюлозы [5].
Для оценки состояния перекисного окисления липидов в печени животных нами использована методика определения метаболита радикальных реакций - малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и гомогенатах печени [13].
Цифровые данные, полученные в опытах, обрабатывали по параметрическому критерию (t) Стьюдента - Фишера [9].
Кусочки печени фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Депарафиниро-ванные гистологические срезы органа для оценки морфологической картины окрашивали по общепринятой методике гематоксилин - эозином и пи-крофуксином по ван Гизон [6].
Для оценки состояния перекисного окисления липидов выявляли содержание в печени пигмента липофусцина по Шморлю [7].
В свежезамороженных срезах печени, полученных на микротом-криостате МК-25, определяли количество гликогена ШИК-реакцией, нейтральных жиров - Суданом черным «Б», активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ-азы) и лак-татдегидрогеназы (ЛДГ-азы) - по Нахласу [7].
Для микроскопических исследований использован немецкий микроскоп «Motik» со встроенной видеокамерой.
Результаты исследований
Прежде чем представить морфологическую основу регенераторных процессов в печени, остановимся на некоторых механизмах ее повреждения при воздействии токсических агентов. В результате гиперлипопереокисления наблюдаются образование промежуточных и конечных продуктов свободнорадикального окисления липидов
(малонового диальдегида, липофусцина), нарушение сопряжения биологического окисления и окислительного фосфорилирования (образования АТФ), что обусловливает дефицит макроэргиче-ских соединений, расстройство клеточной энергетики - начальное звено патологии. Здесь мы имеем налицо подавление активности сукцинат-и лактатдегидрогеназа.
Дестабилизация клеточных мембран вызывала цитолиз гепатоцитов в печени подопытных крыс. При синдроме цитолиза отмечено повышение активности ферментов АЛТ и ACT, являющихся органоспецифичными при гепатите.
Одним из проявлений дестабилизации клеточных мембран в результате гиперлипопереокисления является признак синдрома холе стаза, который сводится к повышению активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови, стенках желчных капилляров, возрастанию уровней содержания холестерина и Р-липопротеидов, нарушению пигментного обмена (изменениям количества общего билирубина, его прямой и непрямой фракций), диспротеинемии (по данным тимоловой пробы) (табл. 1).
Печень играет ведущую роль в белковом обмене.
В наших исследованиях при введении крысам «манушитана» происходило более интенсивное повышение содержания общего белка по сравнению с контролем: 5,2 0,07 - на 7-е сутки, 7,0 0,07
- на 14-е сутки и 6,73 0,4 г/л - на 2-е сутки исследований (табл. 1).
Повреждение печени не является местным и локальным процессом. Оно связано с общим состоянием организма, напряженностью его защитно-приспособительных реакций и формируется на различных уровнях организации - от молекулярного до целого организма. Известно, что даже однократное введение четыреххлористого углерода (CCl4), помимо диффузной дистрофии гепатоцитов, вызывает некроз в центре печеночных долек [10]. Дистрофические и деструктивные явления сопровождаются резким нарушением ферментативной системы клеток и изменением со стороны ультраструктуры гепато-цита. По данным Д.С. Саркисова и Б.В. Втюри-на [11], уже через 30 минут после введения CCl4 отмечается набухание митохондрий, уменьшение гладких мембран эндоплазматической сети и расширение ее канальцев.
43
Таблица 1
Динамика изменений биохимических показателей под влиянием растительного препарата «Манушитан» и оротата калия при остром СС14-гепатите у белых крыс (М ± т)
Показатель 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки
Условия опыта Условия опыта Условия опыта
Контроль (CCl4), n=7 CCl4 + манушитан, n=7 CCl4 + оротат калия, n=7 Контроль (CCl4), n=7 CCl4 + манушитан, n=7 CCl4 + оротат калия, n=7 Контроль (CCl4), n=7 CCl4 + манушитан, n=7 CCl4 + оротат калия, n=7
Общий белок, г/л 4,8 і 0,11 5,2 і 0,07* 5,3 і 0,05* 5,8 і 0,42 7,0 і 0,07* 6,8 і 0,04* 6,27 і 0,55 6,73 і 0,41 7,2 і 0,21*
Тимоловая проба, ед. 4,56 і 0,41 2,7 і 0,22* 3,1 і 0,18* 4,06 і 0,12 2,1 і 0,15* 2,7 і 0,21 4,15 і 0,52 2,13 і 0,53* 1,8 і 0,43*
АЛТ, ед. 199,0 і 9,25 96,0 і 8,96* 103,6 і 34,19* 88,3 і 2,61 69,7 і 1,82* 80,6 і 1,11 90,5 і 1,47 60,9 і 5,31* 72,5 і 6,56*
ACT, ед. 296,0 і 10,11 216,0 і 2,02* 196,5 і 19,28* 168,5 і 9,43 185,5 і,82* 220 і 5,43* 272,8 і 11,0 144 і 7,54* 192,0 і 10,33*
Холестерин, ммоль/л 2,58 і 0,24 1,53 і 0,22* 1,24 і 0,12* 3,05 і 0,29 1,82 і 0,14* 1,65 і 0,13 3,31 і0,13 1,8 і 0,35* 2,3 і 0,11*
Щелочная фосфатаза, ед./л 518,0 і 48,42 374,0 і 3,55* 330,8 і 15,45* 303,06 і 10,75 180,9 і 17,83* 175,2 і 13,54* 257,2 і 3,71 134,8 і 10,51* 156,2 і 19,31*
Общий билирубин, ммоль/л 16,4 і 2,11 12,8 і 1,19* 11,2 і 1,17* 10,5 і 1,51 7,51 і 0,65* 6,2 і 0,17* 4,74 і 0,33 5,96 і 0,63 4,66 і 0,62
Р-липопротеиды, уел. ед. 1,68 і 0,04 1,17 і 0,02* 1,2 і 0,04* 1,38 і 0,05 0,87 і 0,02* 0,98 і 0,17* 0,99 і 0,03 0,90 і 0,02* 1,00 і 0,02
Прямой билирубин, мг/100г 3 ,4 0 -н 8 ,3 6, 4,18 і 0,32* 4,7 і 0,14* 3,18 і 0,37 2,04 і 0,14 2,4 і 0,23 2,73 і 0,31 1,80 і 0,16* 1,76 і 0,35*
Непрямой билирубин, мг/100г 10,7 і 2,31 7,12 і 0,18* 6,8 і 1,17* 7,2 і 0,12 4,17 і 0,21* 4,4 і 0,81* 4,4 і 0,83 3,5 і 0,16 2,9 і 035
Примечание * - различия достоверны по сравнению с контролем при P < 0,05; n - количество животных в группе
И.О. Убашеев, И.М. Бальхаев, А.Н. Плеханов. Коррекция печеночной недостаточности у белых крыс при остром СС14-гепатите тибетским лекарственным средством «Манушитан»
Установлено, что чаще погибают гепатоциты в центре долек печени, чем на ее периферии. В целом, вышеотмеченные изменения в печени обусловливают печеночную недостаточность. Д.С.
Саркисов [10] и Б.П. Солопаев [12] считают, что регенерация печени после патологического процесса, в основном, обеспечивается гипертрофией клеток и полиплоидией их ядер (табл. 2).
Таблица 2
Показатели регенерации в печени белых крыс по плоидности ядер при остром токсическом гепатите (М ± т)
Условия опыта Срок исследования, сутки
7-е 14-е 21-е
Содержание ДНК в ядрах гепатоцитов, отн. ед.
СС14 (контроль), п=7 11,95 ± 0,22 16,91 ± 0,50 22,05 ± 0,67
СС14+ манушитан, п=7 15,18 ± 0,32* 17,65 ± 0,33 32,29 ± 1,09*
СС14+ оротат калия, п=7 13,91 ± 0,49* 17,47 ± 0,363 17,14 ± 0,49
Количество пролиферирующих гепатоцитов, %
СС14 (контроль), п=7 33,3 34,6 29,2
СС14+ манушитан, п=7 32,2 38,0 51,9
СС14+ оротат калия, п=7 25,4 37,9 32,0
Число полиплоидных гепатоцитов, %
СС14 (контроль), п=7 4,6 12,0 19,6
СС14+ манушитан, п=7 21,0 21,6 27,3
СС14+ оротат калия, п=7 13,3 14,6 24,0
Примечание. * - достоверность разницы между опытом и контролем при Р < 0,05; п - количество животных в группе.
Анализ показателей репаративной регенерации печени белых крыс после ее токсического повреждения, приведенных в таблице 2, подтверждает разные темпы структурного восстановления органа у животных в разных экспериментальных группах. Наблюдаемое повышение уровней поли-плоидизации и пролиферации гепатоцитов, увеличение общего содержания ДНК в клетках печени животных, получавших «манушитан», следует считать основой ускорения морфофункционального восстановления печени после ее повреждения, ибо известно, что полиплоидная клетка ввиду особенностей своего образования обладает большой функциональной активностью [2].
Фармакологическое действие фитосредства «манушитан» вытекает из важной биологической роли полифенольных комплексов в биохимических процессах в живой клетке [17]. Фенольные соединения «манушитан», взаимодействуя со свободными радикалами, резко замедляют процесс липопереокисления в организме в результате образования малоактивных фенольных радикалов.
Курсовое введение подопытным крысам «ма-нушитана» обусловливало уменьшение жировой
дистрофии, повышение содержания гликогена.
«Манушитан» действует мягче, т.е. без побочного действия, повышая защитные силы организма. Это подтвердили результаты исследований антиоксидантных и адаптогенных свойств целого ряда природных лекарственных средств, составленных на основе рецептурных прописей тибетской медицины [15] и обусловленных выраженным мембранотропизмом полифенольных соединений испытуемых средств.
Проблема поражения печени в настоящее время привлекает внимание многих исследователей. В патогенезе поражения печени важную роль играет перекисное окисление липидов мембран гепатоцитов, которое приводит к нарушению физико-химических свойств мембран вплоть до полного разрыва как самих клеток, так и субклеточных структур - митохондрий, лизосом и ми-кросом.
А.Ф. Блюгер и А.Я. Майоре [1] высказали мнение, что большинство патологических процессов по своей сути являются патологией мембран печеночных клеток. Поэтому и подходы к лечению этих заболеваний должны включать по-
иск веществ, предотвращающих или устраняющих поражение мембран клетки или клеточных органелл, т.е. новые лечебные средства могут быть выявлены среди веществ, обладающих анти-оксидантным действием, способным ингибировать свободнорадикальное перекисное окисление липидов, предупреждать разрушение структуры мембран, стимулировать компенсаторные механизмы клеток.
В наших исследованиях тибетское растительное средство «манушитан» способствовало нормализации белкового, липидного и пигментного обмена, повышая активность цитоплазматических ферментов и ускоряя нормализацию гистохимических показателей, что свидетельствовало о восстановлении структуры и функции печени белых крыс при СС14-гепатите.
В целом, стимулирующее влияние отвара «манушитан» на восстановительные процессы в печени крыс с острым СС14-гепатитом, по-видимому, обусловлено комплексом биологически активных веществ, преимущественно полифенольных соединений, содержащихся в растениях и являющихся компонентами изучаемого тибетского лекарственного средства. Полученные данные являются подтверждением его перспективности как гепатозащитного средства и свидетельствует о возможности и целесообразности регенерационной терапии больных при патологических состояниях печени в условиях клиники.
Литература
1. Блюгер А.Ф., Майоре А.Я. Проблема перекисно-го окисления липидов в гепатологии // Успехи гепато-логии. - Рига, 1978. - Вып. 7. - С. 22-54.
2. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. - М., 1981. - 257 с.
3. Государственная фармакопея РФ. - М., 1990. - Т.
2. - С. 238.
4. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической хирургии. - Минск, 1982. - 226 с.
5. Меньшиков В.В. Современные проблемы развития лабораторной диагностики. - М., 1987. - 73 с.
6. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - М., 1969. - 423 с.
7. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М., 1962. - 962 с.
8. Плеханов А.Н. Прогнозирование, профилактика и лечение печеночной недостаточности после резекций печени (клинико-экспериментальное исследование): автореф. дис. ... д-ра мед. наук// Иркутск, 2002.
- 33 с.
9. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. - М., 1980. - 281 с.
10. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. - М., 1970. - 283 с.
11. Саркисов Д.Р., Втюрин Б.В. Электронная микроскопия деструктивных и регенераторных внеклеточных процессов. - М., 1967. - 22 с.
12. Солопаев Б.П. Регенерация нормальной и патологически измененной печени. - Горький, 1980. - 240 с.
13. Темирбулатов Р.А., Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липид-содержащих компонентов крови и ее диагностическое значение // Лабораторное дело. - 1981.
- №4. - С. 209-211.
14. Хруст Ю.Р., Литинская Л.Л., Оглобина Т.А.. Соколова Г.А. // Основы количественной цитохимии.
- М., 1978. - С. 31-37.
15. Цыренжапова О.Д. Фармакология адаптогенов природного происхождения и пути оптимизации адаптивных процессов организма: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Улан-Батор, 1998. - 45 с.
16. Hussaun W., Mutimer D., Harrison R. et al. Fulminant hepaticfailure caused by tuberculosis // Gut. -1995. - Vol. 36. - P. 792.
17. Reitman S., Frenkel S.A. colorimetric method for the determination of serum glutamic pyruvic transaminases // Amer. J. Clin. Path. - 1975 -Vol. 28. - №1. - P. 55-59.
Убашеев Иннокентий Оширович - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Бальхаев Илларион Митрофанович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакологии и традиционной медицины медицинского факультета Бурятского госуниверситета. 670002, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская, 36а. Тел. (3012) 44-82-55.
E-mail: [email protected]
Плеханов Александр Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии медицинского факультета Бурятского госуниверситета, главный врач НУЗ «Отделенческая клиническая больница на ст. Улан-Удэ». Тел. (3012) 28-35-03.
Ubasheev Innokentiy Oshirovich - doctor of biological sciences, professor, leading research fellow, Department of Biological Active Substances, Institute of General and Experimental Biology, SB RAS.
Balkhaev Illarion Mitrofanovich - candidate of medicical sciences, associate professor, department of pharmacology and traditional medicine, medical faculty, Buryat State University; 670002, Ulan-Ude, Oktyabrskaya str., 36a. Tel. (3012) 44-82-55. E-mail: [email protected]
Plekhanov Alexander Nikolaevich - doctor of medical sciences, professor, head of department of faculty surgery, medical faculty, Buryat State University, chief physician, Branch Clinical Hospital at the station Ulan-Ude; tel. (3012) 28-35-03.
