Коррекция холодового воздействия с помощью препарата, содержащего янтарную кислоту Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 591.494(678.048):616-001.18/.19]547.461.4

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ С ПОМОЩЬЮ ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ЯНТАРНУЮ КИСЛОТУ

В.А.Доровских, НВ.Симонова, Ю.В.Доровских, О.НЛи

Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95

РЕЗЮМЕ

Холодовой стресс, приводящий к развитию различных дизрегуляционных процессов, направленных на трансформацию сложившегося гомеостаза, создает благоприятные условия для радикалообра-зования и способствует истощению мощности анти-оксидантной системы в теплокровном организме. При адаптации организма к холоду наблюдается диспропорция в гормональном и энергетическом статусе анаболических процессов, возникает дефицит биоэнергетических ресурсов и гипоксия тканей. Сложный механизм развития гипоксии в организме, многокомпонентная система биохимических и метаболических процессов, возникающих при различной патологии, объясняет трудности в назначении препаратов, выполняющих задачи коррекции функций дыхательной цепи и других метаболических процессов, поставляющих энергетические субстраты. Перспективным с этих позиций представляется использование препаратов, содержащих янтарную кислоту, являющуюся одним из метаболитов цикла Кребса. В экспериментальных условиях исследована возможность коррекции холодового воздействия введением сукцинатсодержащего препарата Реамберин® (НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург) в дозе 50 мг/кг. Холодовое воздействие на организм 110 крыс с использованием климатокамеры Реп^оп (температурный режим -15°С) и внутрибрюшинное введение препарата осуществляли в течение 28 дней. Анализ результатов показал, что холодовое воздействие во все дни эксперимента активирует перекис-ное окисление липидов, снижая активность антиоксидантной системы организма (уровень витамина Е в 1,2-1,5 раза, каталазы - на 30-40% относительно интактных животных). В условиях длительного влияния холода реамберин оказывал выраженное антиоксидантное действие, на что указывало снижение содержания в крови продуктов пероксидации в 1,6-1,8 раза по сравнению с контролем и повышение активности компонентов антиоксидантной системы (церулоплазмина, каталазы, супероксиддисмутазы) в 1,5-2 раза. Кроме этого, экспериментально было показано, что реамберин в дозе 50 мг/кг, изменяя сродство гемоглобина к кислороду, способствовал увеличению количества фетального гемоглобина, формируя адекватный уровень внутриклеточных и системных ответов на гипоксическое воздействие холода, в частности, за счет механизмов транспорта кислорода кровью.

Ключевые слова: реамберин, Холодовой стресс, пе-рекисное окисление липидов биологических мембран,

продукты пероксидации (гидроперекиси липидов, диеновые конъюгаты, малоновый диалъдегид), антиоксидантная система.

SUMMARY

CORRECTION OF COLD EFFECT BY MEANS OF THE DRUG WITH SUCCINIC ACID

V.A.Dorovskikh, N.V.Simonova, Yu.V.Dorovskikh,

O.N. Li

Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str.,

Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation

Cold stress leading to the development of different disregulation processes directed to the transformation of the formed homeostasis creates favorable conditions for the radicals formation and contributes to the depletion of intensity of antioxidant system in the warmblooded organism. During adaptation of the organism to cold, the disproportion in the hormonal and energy state of anabolic processes is observed, the deficiency of bioenergetic resources and hypoxia of tissues occur. A complex mechanism of hypoxia development in the organism and a multi-component system of biochemical and metabolic processes appearing in the case of different pathology explain the difficulties in administering the drugs correcting functions of the respiratory chain and other metabolic processes bringing energetic substrata. In this case, the use of drugs containing succinic acid, which is one of metabolites of Krebs cycle, is perspective. In the experimental conditions the possibility of correction of cold effect by means of introduction of succinate containing drug called Reamberin® (Polysan, St. Petersburg) in the dose of 50 mg/kg was studied. Cold effect on the organism of 110 rats with the use of climatic camera Fentron (conditions of temperature were -15°C) and intra-abdominal introduction of Reamberin were accomplished during 28 days. The analysis of the experiment’s results showed that cold effect during all days of the experiment activates lipid peroxidation decreasing the activity of antioxidant system of the organism (the level of vitamin E was 1.2-1.5 times less, catalase fell by 30-40% in intact animals). During long period of cold effect Reamberin had an evident antioxidant action. The 1.6-1.8 times decrease of the content of peroxidation products in comparison with the control and the 1.5-2 times increase of activity of components of antioxidant system (ceruloplasmin, catalase, superoxide dismutase) showed that. Besides, it was shown experimentally that Reamberin in the dose of 50 mg/kg changing the «affinity» of hemoglobin to oxygen contributed to the increase of the amount of fetal hemoglobin forming an adequate level of intracel-

lular and systemic responses to hypoxic effect of cold, in particular, due to mechanisms of oxygen transport in blood.

Key words: Reamberin, cold stress, biological membranes lipid peroxidation, products of peroxidation (lipid hydroperoxides, diene conjugates, malonic dialdehyde), antioxidant system.

Холодовое воздействие, как стрессирующий фактор, является пусковым моментом в развитии каскада изменений метаболических процессов организма. Разобщая окислительное фосфорилирование, нарушая передачу электронов в дыхательной цепи митохондрий, холод, несомненно, увеличивает энтропию, возрастание образования тепла, при этом существенно нарушая синтез АТФ [7]. В свою очередь, уменьшение концентрации АТФ в клетке вызывает ее ингибирующее влияние на ключевой фермент гликолиза -фосфофруктокиназу. Усиленный распад фосфолипидов за счет образования лизофракций и распад белков приводит к деструкции клеточных структур. В результате повышается концентрация ненасыщенных жирных кислот, усиливается перекисное окисление липидов (ПОЛ), подавляется активность антиоксидантной системы (АОС) организма и, прежде всего, супероксид-дисмутазы, каталазы и др. [4]. Таким образом, ведущими патогенетическими звеньями холодового воздействия становятся гипоксия и оксидантный стресс, коррекцию которых мы попытались осуществить введением комплексного препарата Реамберин®, содержащего среди других компонентов янтарную кислоту, изготовленного научно-технологической фармацевтической фирмой «Полисан» Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. Целесообразность и обоснованность применения су-кцинатсодержащих препаратов при воздействии низких температур, на наш взгляд, не вызывает сомнений, поскольку превращение янтарной кислоты в организме связано с продукцией энергии, необходимой для обеспечения жизнедеятельности, а в условиях возрастания нагрузки на любую из систем организма, в частности при холодовом воздействии, поддержание ее работы обеспечивается преимущественно окислением янтарной кислоты. Важно отметить, что мощность системы энергопродукции, использующей янтарную кислоту, в сотни раз превосходит все другие энергообразования организма [3].

Цель исследования - изучение эффективности ре-амберина в качестве стресс-корректора при адаптации организма к холоду.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на кафедре фармакологии Амурской государственной медицинской академии. Эксперимент проводили на 110 белых беспородных крысах-самцах массой 150-180 г в течение 28 дней.

Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по про-

ведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), Приказе М3 СССР №755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Приказе М3 РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». При проведении экспериментов руководствовались основными положениями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [8].

При завершении исследований выведение животных из опыта проводили путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно Приложению №4 «О порядке проведения эвтаназии умерщвления животного» к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к Приказу М3 СССР №755 от 12.08.1977 г.). Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии.

Охлаждение животных осуществляли ежедневно в течение 3 часов в условиях климатокамеры Гейгоп (Германия), создавая температурный режим -15°С с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции [2]. Животные были разделены на 9 групп, в каждой по 12 крыс: 1 группа - интактные животные, которых содержали в стандартных условиях вивария;

2, 4, 6 и 8 группы - контрольные, где крысы подвергались воздействию холода по 3 часа ежедневно в течение 7, 14, 21 и 28 дней, соответственно; 3, 5, 7, 9 группы - подопытные, где животным перед охлаждением (время экспозиции - 3 часа) ежедневно внутри-брюшинно вводили реамберин в дозе 50 мг/кг в течение 7,14,21 и 28 дней, соответственно. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали, исследуя содержание гидроперекисей липидов (ГП), диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и компонентов АОС - церулоплазмина, витамина Е, глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ), каталазы, супероксид-дисмутазы (СОД) в крови животных по методикам, изложенным в ранее опубликованной нами работе [5]. Формирование кислородсвязывающих свойств крови определяли по изменению количества 2,3 дифосфогли-церата (2,3 ДФГ) и содержания фетального гемоглобина. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стъюдента (I) с помощью программы §1аЙ5Йса у.6.0. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Холодовое воздействие, являясь мощным проокси-дантным фактором, активирует ПОЛ биомембран у контрольных животных во все дни эксперимента, что согласуется с результатами проведенных нами ранее исследований [1,6], причем наиболее выраженные изменения были обнаружены к концу первой и второй недель опыта: содержание ГП в крови контрольных животных достоверно увеличилось на 15-27% относи-

тельно интактных крыс, ДК - на 23-39%, МДА - на 25-30% (табл. 1). При холодовом воздействии на крыс наблюдалось напряжение и истощение АОС, о чем свидетельствовало достоверное снижение уровня церулоплазмина в крови контрольных животных на 48% (7 день), 56% (14 день), 36% (21 день) и 37% (28 день)

в сравнении с аналогичным показателем в интактной группе. Снижение содержания витамина Е составило 25% (7 день), 21% (14 день), 28% (21 день) и 30% (28 день) в сравнении с показателями в контроле, уменьшение активности каталазы - 18-28%, СОД - 24-52%, Гл-6-ФДГ - 8-14% (табл. 2).

Таблица 1

Содержание продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных (нмоль/мл)

Группы животных ГП ДК МДА

Интактные крысы 26,7±1,0 47,8±5,1 5,0±0,2

Воздействие холода в течение 7 дней 36,5±1,3* 76,5±4,3* 7,1±0,2*

Воздействие холода и введение реамберина в течение 7 дней 30,4±1,7 48,1±3,2** 5,0±0,3**

Воздействие холода в течение 14 дней 34,2±1,3* 78,4±2,3* 6,8±0,3*

Воздействие холода и введение реамберина в течение 14 дней 27,4±0,5** 48,0±1,7** 5,2±0,1**

Воздействие холода в течение 21 дня 32,6±1,3* 75,3±3,2* 6,8±0,2*

Воздействие холода и введение реамберина в течение 21 дня 26,8±0,3** 47,8±2,6** 5,2±0,1**

Воздействие холода в течение 28 дней 31,4±1,1* 71,1±3,5* 6,7±0,2*

Воздействие холода и введение реамберина в течение 28 дней 26,6±1,0** 45,0±2,6** 5,1±0,3**

Примечание: здесь и далее * - достоверность различия показателей по сравнению с группой интактных животных (р<0,05); ** - достоверность различия показателей по сравнению с группой животных, к которым применяли только воздействие холода (р<0,05).

Таблица 2

Содержание компонентов АОС в крови экспериментальных животных

Группы животных Церулоплазмин, мкг/мл Витамин Е, мкг/мл Каталаза, мкмоль Н202 л1с1 сод. Ед/мл Гл-6-ФДГ, мкмоль НАДФН л'с1

Интактные крысы 48,2±4,3 28,1±1,3 83,2±1,6 6,22±0,12 17,0±0,1

Воздействие холода (7 дней) 25,2±3,0* 21,0±0,7* 60,2±2,1* 3,19±0,18* 15,1±0,2*

Воздействие холода и введение реамберина (7 дней) 56,9±2,7** 27,2±1,6** 79,4±2,1** 4,97±0,22** 16,8±0,4**

Воздействие холода (14 дней) 21,4±2,7* 22,0±1,2* 61,1±2,2* 3,0±0,15* 14,7±0,2*

Воздействие холода и введение реамберина (14 дней) 50,1±1,8** 27,9±1,1** 83,0±2,6** 4,68±0,27** 16,9±0,1**

Воздействие холода (21 день) 31,0±1,4* 20,1±1,2* 68,5±3,4* 3,59±0,17* 14,8±0,3*

Воздействие холода и введение реамберина (21 день) 48,7±2,1** 27,0±1,6** 83,0±3,1** 4,42±0,21** 16,5±0,1**

Воздействие холода (28 дней) 35,1±1,8* 19,8±0,5* 61,4±2,7* 4,7±0,3* 15,7±0,8

Воздействие холода и введение реамберина (28 дней) 48,4±2,2** 28,1±1,0** 82,5±1,7** 4,1±0,2 16,9±0,4

Исследование антиоксидантной активности препарата, содержащего янтарную кислоту, показало, что введение реамберина в условиях длительного холодового воздействия препятствует накоплению токсических продуктов радикального характера: в сравнении с контрольной группой уровень ГП достоверно снизился к концу первой недели эксперимента на 17%,

второй - на 20%, третьей - на 18%, четвертой - на 15%; содержание ДК было ниже аналогичного показателя в контроле в среднем на 37% во все дни исследований; на 24-30% уменьшился уровень вторичного продукта пероксидации МДА (табл. 1). Использование реамберина в эксперименте способствовало повышению активности АОС на фоне холодового воздействия (табл.

2): уровень церулоплазмина в крови подопытных крыс вырос на 27-56% по сравнению с контролем, витамина Е - на 21-30%; активность ферментов антиоксидантной защиты была достоверно выше в первые три недели опыта (каталазы - на 17-26%, СОД - на 19-36%, Гл-6-ФДГ-на 10-13%).

Таким образом, как показали проведенные исследования, введение сукцинатсодержащего препарата Ре-амберин® способствует повышению антиоксидантного статуса теплокровного организма в условиях воздействия низких температур, а учитывая результаты, опубликованные нами ранее, отражающие антиоксидантное действие реамберина в дозе 10 мг/кг и 30 мг/кг [9], сегодня мы можем говорить о дозозависимом антиокси-

Содержание 2,3 ДФГ

дантном эффекте реамберина при холодовом воздействии.

Следующим этапом нашей экспериментальной работы было изучение антигипоксантного эффекта реамберина в условиях воздействия низких температур. Метаболит фосфоглицератного шунта гликолиза 2,3 ДФГ является аллостерическим модулятором оксиге-нации (дезоксигенации) гемоглобина. 2,3 ДФГ входит в молекулу гемоглобина и способствует отдаче кислорода молекулой оксигемоглобина. Увеличение содержания 2,3 ДФГ в эритроцитах, таким образом, должно способствовать дезоксигенации, напротив, снижение количества 2,3 ДФГ улучшает вхождение кислорода в молекулу гемоглобина.

Таблица 3

в эритроцитах крыс

Группы животных Содержание 2,3 ДФГ, мкМ/г

7 день 14 день 21 день 28 день

Интактные крысы 18,6±1,2 18,4±1,0 19,2±1,4 18,7±1,2

Воздействие холода 12,4±1,0* 19,4±1,3 27,2±1,5* 23,2±1,1

Воздействие холода и введение реамберина 16,5±1,1** 25,4±2,0 33,1±1,7 36,0±2,1**

При анализе полученных в ходе эксперимента ре-зультов было установлено достоверное снижение уровня 2,3 ДФГ в эритроцитах охлаждаемых крыс к концу первой недели опыта, однако в последующие дни наблюдалась тенденция увеличения данного показателя относительно интактных животных, причем к 21 дню содержание 2,3 ДФГ достоверно превышало аналогичный показатель в интактной группе в 1,5 раза (табл. 3). В свою очередь, введение реамберина в дозе 50 мг/кг на фоне холодового воздействия способствовало достоверному увеличению содержания 2,3 ДФГ в эритроцитах подопытных крыс в сравнении с контролем к концу первой недели эксперимента (на 25%) и четвертой недели (на 36%). Таким образом, в первые 7 дней холодового воздействия включаются компенсаторные механизмы улучшения связывания кислорода с гемоглобином, в последующие дни - компенсаторные

механизмы увеличения дезоксигенации оксигемоглобина. На этом фоне реамберин способствовал более стойкому включению компенсаторных механизмов, достоверно увеличивая дезоксигенацию оксигемоглобина со второй недели эксперимента.

Следующим благоприятным фактором улучшения кислородного режима при введении реамберина на фоне холодового воздействия является достоверное увеличение относительного количества щелочноустойчивого, или фетального гемоглобина. Результаты исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют о достоверном повышении содержания фетального гемоглобина при холодовом воздействии на 7 и 14 дни эксперимента у контрольных и подопытных крыс, причем введение реамберина способствовало росту уровня данного показателя на 34 и 30%, соответственно, по отношению к контролю.

Таблица 4

Содержание фетального гемоглобина в сыворотке крови крыс

Группы животных Содержание фетального гемоглобина, % к общему гемоглобину

7 день 14 день

Интактные крысы 3,0±0,2 3,0±0,4

Воздействие холода 21,1±2,1* 23,2±2,3*

Воздействие холода и введение реамберина 32,1±2,8** 33,4±0,5**

Таким образом, реамберин в дозе 50 мг/кг, изменяя сродство гемоглобина к кислороду, увеличивая количество фетального гемоглобина, формирует адекватный уровень внутриклеточных и системных ответов на гипоксическое воздействие холода, в частности, за счет механизмов транспорта кислорода кровью.

Выводы

1. Впервые проведено исследование антиоксидант-

ной активности сукцинатсодержащего препарата Реамберин® в дозе 50 мг/кг при холодовом воздействии на крыс.

2. Использование в эксперименте реамберина снижает интенсивность процессов пероксидации биомембран в условиях воздействия низких температур, что подтверждается уменьшением содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ на фоне повышения активности основных компонентов АОС в крови экспе-

риментальных животных.

3. Установлена дозозависимость эффектов реамбе-рина при холодовом воздействии.

4. Реамберин формирует адекватный уровень внутриклеточных и системных ответов на гипоксическое воздействие холода.

ЛИТЕРАТУРА

1. Адаптогены и Холодовой стресс: вчера, сегодня, завтра... / В.А.Доровских [и др.]. Благовещенск: АГМА, 2006.214 с.

2. Доровских В.А. Фармакологическая коррекция холодового воздействия в эксперименте: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Ленинград, 1987. 48 с.

3. Оболенский С.В. Реамберин - новое средство для инфузионной терапии в практике медицины критических состояний: методические рекомендации. СПб., 2002. 23 с.

4. Оковитый С.В., Шуленин С.Н., Смирнов А.В. Клиническая фармакология антигипоксантов и антиоксидантов. СПб.: ФАРМиндекс, 2005. 72 с.

5. Симонова Н.В., Доровских В.А., Штарберг М.А. Адаптогены в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных воздействием холода и ультрафиолетовых лучей // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2011. Вып. 40. С. 66-70.

6. Настой лекарственных растений и окислительный стресс в условиях холодового воздействия /

Н.В.Симонова [и др.] //Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2013. Вып.48. С.76-80.

7. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Сорос, образов, журн. 1996. №3. С.4-10.

8. Хабриев РЦ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. 832 с.

9. Шаповаленко Н.С. Фармакологическая регуляция холодового и теплового воздействия в эксперименте: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2011. 25

REFERENCES

1. Dorovskikh VA„ Korshunova N.V., Krasavina N.P, Simonova N.V., Tikhanov VI., Simonova N.P. Adaptogeny i kholodovov stress: vchera, segodnva, zavtra... [Adapto-gens and cold stress: yesterday, today, tomorrow...]. Blagoveshchensk: AGMA; 2006.

2. Dorovskikh VA. Farmakologicheskaya korrektsiva kholodovogo vozdeysMya v eksperimente: avtoreferat dis-sertatsii doktora meditsinskikh nauk [Pharmacological correction of cold exposure in the experiment: abstract of thesis... doctor of medical sciences]. Leningrad; 1987.

3. Obolenskiy S.V. Reamberin - novoe sredst\>o diva infuzionnoy terapii v praktike meditsinv kriticheskikh sos-tovaniv: metodicheskie rekomendatsii [Reamberin is a new drug for infusion therapy in the practical medicine of critical states: methodological recommendations]. St. Petersburg; 2002.

4. Okovityy S.V, Shulenin S.N., Smirnov A.V. Klinich-eskava farmakologiya antigipoksantov i antioksidantov [Clinical pharmacology of antihypoxic agents and antioxidants]. St. Petersburg: FARMindeks; 2005.

5. Simonova N.V, Dorovskikh V.A., Shtarberg M.A. Billie ten' fiziologii i patologii dyhanivd 2011; 40:66-70.

6. Simonova N.V., Dorovskikh VA., Li O.N., Shtarberg M.A., Simonova N.P. Bulleten' fiziologii i patologii dy-haniva 2013; 48:76-80.

7. Skulachev V.P Sorosovskiy obrazovatel’nyy zhurnal - Soros Educational Journal 1996; 3: 4-10.

8. Khabriev R.Ts. Rukovodst\’opo eksperimental’nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novvkh farmakologicheskikh veshchestv [Guidelines for experimental (preclinical) studies of new pharmacological agents]. Moscow: Meditsina; 2005.

9. Shapovalenko N.S. Farmakologicheskaya regulyat-siva kholodovogo i teplovogo vozdeysh’iva v eksperimente: avtoreferat dissertatsii kandidata meditsinskikh nauk [Pharmacological regulation of cold and heat exposure in the experiment: abstract of thesis... candidate of medical sciences]. Vladivostok; 2011.

Поступила 15.07.2013

Контактная ннформацня Владимир Анатольевич Доровских, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.

E-mail: agma(aiamur.ru Correspondence should be addressed to Vladimir A. Dorovskikh, AID, PhD, Professor, Head of Department of Pharmacology,

Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.

E-mail: agma(aiamur.ru