CC BY
64
ПРЕПАРАТЫ
КОРРЕКЦИЯ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБАКТЕРИОЗА, ВЫЗВАННОГО АМПИОКСОМ, ПРОБИОТИКАМИ
Осипова И. /"., Мефед К. М„ Давыдов Д. С.
Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича, Москва
<
Показано резкое изменение состава микрофлоры кишечника лабораторных животных под влиянием антибиотика ампиокса. Выявлено значительное увеличение общего количества условно-патогенных микроорганизмов при сохранении нормофлоры кишечника. При экспериментальном моделировании дисбиоза у лабораторных животных выявлено усиление адгезии условно-патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника. Продемонстрировано количественное увеличение нормофлоры при применении споро-, коли-, лакто- и би-фидосодержащих пробиотиков.
Ключевые слова: экспериментальный дисбактериоз, ампиокс, транслокация кишечной микрофлоры, пробиотики, адгезивная активность
^ /
В нашей стране при отборе штаммов — кандидатов в пробиотики основное внимание уделяют спектру и выраженности их антагонистической активности, которую изучают в опытах in vitro. Подобная характеристика является недостаточной, поскольку она не раскрывает механизма терапевтического эффекта пробиотика, его позитивного воздействия на макроорганизм и биосовместимости с другими видами бактерий нормальной микрофлоры. Отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между пробиоти-ческими и условно-патогенными бактериями (УПБ) приводит порой к неправильному выбору пробиотика для лечения и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта.
В решении многих проблем биологии и медицины важную роль играют экспериментальные исследования на животных, позволяющие моделировать и изучать динамику патологического процесса в различных условиях метаболизма. В литературе описаны различные подходы к моделированию дисбактериоза у животных. Известны модели дисбактериоза, вызванные голоданием, тотальной кровопотерей, радиационным облучением, введением антибиотиков [1,3,6,10]. Задачей настоящего исследования явилось изучение количественного и качественного состава микробиоценоза кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом, индуцированным продолжительным введением ампиокса, а также влияния различных групп пробиотических препаратов на микрофлору животных в эксперименте.
МсТгериэлы^ и методы
Использовали следующие коммерческие пробиотики (ПБ):
• споровые — биоспорин и бактисубтил;
• колисодержащие — колибактерин;
• бифидосодержащие — бифидумбактерин и бифи-
дин;
• лактосодержащие — лактобактерин и ацилакт.
Исследования осуществлены на лабораторных животных: беспородных мышах (обоего пола), массой 14-16 г (п = 400).
Экспериментальный дисбактериоз у мышей вызывали путем перорального введения ампиокса (4 мг/сут) [7], который вводили через жесткий зонд в течение 14сут. Животные были разделены на две группы: основную, получавшую ампиокс, и — контрольную, получавшую 0,7%-й раствор хлорида натрия (ЗФР). Животные обеих групп содержались в одинаковых условиях.
Количественный состав микрофлоры определяли по методике, разработанной Бочковым И. А. с соавт. [2], используя стандартные питательные среды. Определение количества микрофлоры кишки и фекалий проводили через 24 ч после последнего введения пробиотика.
Изучение адгезивных свойств осуществляли на эпителиальных клетках кишечника мышей [3].
Исследование транслокации было проведено на мышах, получавших ампиокс 4 мг/сут в течение 10 сут. (количество животных в каждой группе — 10). Определение количества УПБ, транслоцированных в органы (легкие, печень, почки, селезенка, тимус) и кровь проводили через 24 ч после последнего введения ампиокса. Навески органов растирали в ступке со стерильным песком, готовили серийные десятикратные разведения взвеси органов в ЗФР до 106 и делали высевы на чашки со средами МПА, Эндо, солевой агар, кровяной агар и Сабуро. Кровь после обогащения на жидкой пи-
С
£ Март 2008 г.
Таблица 1
Адгезия условно патогенных бактерий к энтероцитам
Штаммы 1 группа «N1» 2 группа «N2» 3 группа «д»
СПА К,% СПА К, % СПА к,%
S.aureus 209 4,28 ± 0,3 89,2 ± 1,36 5,46 ± 0,7 94,2 ± 1,6 8,78 ± 0,5 95,8 ± 1,8
S.xylosis 25 4,75 ±0,31 89,0 ± 1,2 — — 8,6 + 0,42 90,0 + 3,4
~~Exoli 157 7,18 ±0,8 90,6 ± 0,97 8,21 ±0,4 92,8 ± 1,5 11,2 ±0,4 98,1 ± 1,9
Р. vulgaris 177
4,3 ±0,5
84,3 ± 1,44
5,25 ± 0,5
90,7 ± 1,42
8,52 ± 0,4
97,2 ± 1,4
Примечание: 1 группа «N1» — энтероциты от здоровых мышей в начале опыта; 2 группа «N2» — энтероциты от здоровых мышей в конце опыта; 3 группа «Д» — энтероциты от мышей с экспериментальным дисбактериозом; «—» не изучали; СПА — средний показатель адгезивной активности (число микробов на 1 клетку — микроб/клетка в 10 полях зрения); К — коэффициент адгезивности (процент энтероцитов, имеющих на своей поверхности адгезировавшие микробы).
тательной среде высевали на те же среды. Посевы инкубировали 24-48 ч при температуре 37 °С.
В эксперименте по коррекции дисбактериоза животные были разделены на группы:
• I группа (п = 10) получала только ЗФР per os в течение 14 сут.;
• 2 группа животных (п = 10), мыши с экспериментальным дисбактериозом (без лечения);
• 3-9 группы животных (п=20 в каждой), мыши с экспериментальным дисбактериозом, ежедневно пе-рорально 1 раз в сут. получали исследуемый проби-отик. Курс приема пробиотика составил 14 сут. в двух дозировках: ч.д. — «человеческая» доза (п = 10) и м.д. — «мышиная» доза (п = 10).
Препараты были взяты в следующих дозировках: би-фидумбактерин, ацилакт, бифидин — ч.д. = 1x108 КОЕ/ 0,5 мл и м.д. = 1x105 КОЕ/0,5 мл.; лактобактерин — ч.д. = 5x109 КОЕ/0,5 мл и м.д.= 5х106 КОЕ/0,5 мл; колибакгерин — ч.д. = 1,2x1010 КОЕ/0,5 мл и м.д. = 1,2x107 КОЕ/0,5 мл; биоспорин и бактисубтил — ч.д. = 1x109 КОЕ/0,5 мл и м.д. = 1хЮ6КОЕ/0,5 мл.
Полученные данные обработаны с помощью методов вариационной статистики, позволяющих вычислять параметры достоверной значимости результатов ис-
следования. Результаты оценивали на основании данных 3 или 5 опытов.
Результаты и обсуждение_
При изучении влияния ампиокса на состав микрофлоры мышей было показано резкое изменение в составе микрофлоры (рис. 1). Выявлено увеличение общего количества микроорганизмов: лакгозоположительных кишечных палочек (примерно на 2 lg), лактозоотрицательных E.coli (более чем на 51д), грибов рода Candida (на 2 lg). Показано появление бактерий рода Proteus, возрастание количества Pseudomonas aerogenosa, Staphylococcus epidermidis и Enterococcusfaecium (на 1 lg). Уровень бифи-добактерий, лактобактерий и Clostridium spp. оставался неизменным.
Известно, что колонизация УПБ усиливается в организме больных, подвергнутых воздействию антибиотиков, особенно при нерациональной антибиотикотера-пии [3]. Проведено сравнительное изучение адгезивной активности УПБ (тест-штаммы) к эпителиальным клеткам тонкого кишечника здоровых мышей и мышей с экспериментальным дисбактериозом (получавших ампиокс в течение 14 сут. — табл. 1).
Lactobacillus
АО г- ^
Clostridium i ^ Bifidobacterium
Легкие
Candida
E.coli lac+
Enterococcus ^
Staphylococcus ep.
Pseudomonas
Proteus Контрольный уровень • Уровень после обработки ампиоксом
Рис. 1.
Изменение состава микрофлоры мышей под воздействием ампиокса 4 мг/ сут. в течение 14 сут.
Э
Печень
Рис. 2.
Органно-тканевая транслокация лактозоотрицатель-ной кишечной флоры у мышей с экспериментальным дисбактериозом.
ПРЕПАРАТЫ
Рис. 3.
Состав микрофлоры кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом после коррекции колибактерином. Примечание: ч.д. — «человеческая» доза, м.д. — «мышиная» доза.
Рис. 4.
Состав микрофлоры кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом после коррекции лактобактерином (Л) и ацилактом (А).
Примечание: ч.д. — «человеческая» доза, м.д. — «мышиная» доза.
е
£Март2008г.
Рис. 5.
Состав микрофлоры кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом после коррекции
бифидумбактерином (Б) и бифидином (БФ).
Примечание: ч.д. — «человеческая» доза, м.д. — «мышиная» доза.
Из полученных результатов следует, что бактерии проявляли большую способность к адгезии к энтероци-там, выделенным от животных с экспериментальным дисбактериозом, чем от здоровых животных (р < 0,05). Таким образом, при экспериментальном дисбактерио-зе, вызванном ампиоксом, усиливается адгезия УПБ к эпителиальным клеткам кишечника. Возможно, причина заключается в модификации рецепторов эпителиальных клеток.
Известно, что маркером нарушения колонизационной резистентности у животных, помимо изменений в составе фекальной микрофлоры, служит транслокация кишечной флоры во внутренние органы.
У животных с экспериментальным дисбактериозом наблюдалась транслокация лактозоотрицательной кишечной флоры (E.coli, Proteus spp.) в легкие на 4 Ig (очень высокая степень транслокации), почки (средняя степень транслокации — на 2 Ig), тимус и печень (низкая степень транслокации — на 1 Ig). Селезенка и кровь оставались стерильными. Следует отметить, что лактозопозитивная кишечная флора не траслоцировалась (рис. 2). В контрольной группе животных, не получавших ампи-окс, все органы и кровь оставались стерильными.
Транслокация условно патогенной флоры при дис-бактериозе объясняется значительным увеличением ее количества, что, в свою очередь, приводит к массовому выбросу в кровь эндотоксинов и параллельному снижению как клеточного, так и гуморального антиэн-дотоксинового иммунитета.
Следовательно, полученные результаты коррелируют с данными литературы о том, что наибольшей степенью транслокации обладает кишечная палочка [5, 6], а одним из пусковых механизмов транслокации служит чрезмерное увеличение количества кишечной флоры [9, 10].
Широкая практика применения пробиотиков из различных видов и штаммов микроорганизмов представителей нормофлоры свидетельствует об их нормализующем влиянии на кишечный микробиоценоз [10, 11]. В связи с этим нами проведено исследование воздействия различных коммерческих пробиотиков на состав микрофлоры мышей при экспериментальном дисбак-териозе.
При изучении влияния колибактерина на состав микрофлоры было установлено: увеличение лактозополо-жительных кишечных палочек (примерно на 2-3 lg), незначительное увеличение количества лактобактерий. Выявлено, что содержание бифидобактерий, стафилококков и грибов рода Candida не изменялось.
При изучении влияния лактосодержащих пробиотиков на состав микрофлоры обнаружено увеличение количества лактобактерий (примерно на 2-3 lg), статистически значимое уменьшение стафилококков, тогда как содержание бифидобактерий и грибов рода Candida не изменялось (рис. 4). В группе животных, применявших бифидумбактерин, увеличилось только количество бифидобактерий (на 2-3 lg), состав остальной флоры не менялся (рис. 5). В группе животных, при-
Э
ОРЕПАРАТЫ
Рис. 6.
Состав микрофлоры кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом после коррекции биоспорином (Биос.) и бактисубтилом (Бакт.).
Примечание: ч.д. — «человеческая» доза, м.д. — «мышиная» доза.
менявших бифидин, обнаружено увеличение уровня бифидобактерий (на 3-4 Ig), статистически значимое уменьшение стафилококков и лактозонегативных эше-рихий (рис. 5). Следует отметить, что влияние разницы в дозах препарата выявить не удалось.
Таким образом, применение колисодержащих, лак-тосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков нормофлоры при экспериментальном дисбактериозе способствовало увеличению нормофлоры представителей, тогда как уровень УПБ оставался без изменения.
При изучении состава микрофлоры после введения биоспорина (рис. 6) установлено увеличение лактозо-положительных кишечных палочек (примерно на 2-3 Ig), лактобактерий (примерно на 2-3 Ig), элиминация стафилококков и грибов при неизменном количестве бифидобактерий.
При исследовании влияния бактисубтила на состав микрофлоры было показано, что содержание лакто- и бифидобактерий не изменяется, но незначительно увеличивается количество стафилококков и грибов (рис. 6).
Таким образом, в модельных экспериментах по изучению лечебной эффективности пробиотиков при коррекции дисбактериоза получены доказательства необходимости доклинического изучения различных доз применения препаратов-пробиотиков в опытах in vivo.
Литература
1. Бондаренко В. М., Горская Е. М.//Мед. аспекты микробной экологии. — 1992. — Вып. 6. — С. 23-26.
2. Бочков И. А., Трофимов О. Д., Дарбеева О. С. и др.//Лаб. дело. — 1988. — № 6. — С. 43-47.
3. Горская Е. М., Манохина И. М., Горелов А. В., Поспелова В. В., Рахимова Н. Г.//М. — 1989. — 7 с.
4. Горская Е. М. Науч. доклад на соискание степени док. мед. наук. — Москва. — 1994. — 53 с.
5. Гриценко В. А., Брудастов Ю. А., Журлов О. С., Чертков К. Л.//Ж. микроб., эпидемиол. и иммунол. — 2000. — №1. -С. 37-41
6. Кочурко Л. И., Лиходед В. Г., Лобова Е. А.// Ж. микроб., эпидемиол. и иммунол. — 1998. — № 5. — С.25-27.
7. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. с со-авт.//ЖМЭИ. — 1998. — №4. — С. 14-16.
8. Онищенко Г. Г., Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В.В.//ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. — Москва. — 2002. — 595 с.
9. Berg R. D.//Jikken Dobutsu. — 1985.-34:1:1-16
10. Berg R. D.//Appl. Environ. Microbiol. — 1995. — V. 3. — №4. — P. 149-154.
11. Dunne C., O'Mahony L., Murphy L. et al.//J. Clin. Nutr. — 2001. — 73(suppl). — P. 386-392.
G
