CC BY
32
УДК: 577.15.03.04
КОРРЕКЦИЯ БИОПОЛИМЕРОМ ИЗ ТКАНЕЙ РАПАНЫ СОСТОЯНИЯ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО БАЛАНСА ОРГАНИЗМА КРЫС ПРИ НЕСБАЛАНСИРОВАННОМ ПИТАНИИ
Ю.В. Никитченко1, В.Н. Дзюба1, Т.Н. Овсянникова1, О.Е. Битютская2, В.В. Бондарь1,
АЛ. Шеремет1, А.С. Попович1
'Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, г. Харьков, Украина
2Южный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии,
РЕЗЮМЕ
Исследованы особенности изменения прооксидантно-антиоксидантного баланса в гепатоцитах и сыворотке крови крыс, вызванного несбалансированным питанием, и возможности его коррекции путем дополнения рациона пищевой добавкой (биополимер из тканей рапаны (БР)). Обнаружено, что использованная пищевая добавка в условиях in vitro проявляет значительную антирадикальную активность. Показано, что применение БР на фоне несбалансированного рациона приводит к нормализации содержания гидроперекисей липидов в крови и достоверному снижению уровня этих продуктов ПОЛ в гепатоцитах крыс, к замедлению снижения глутатионпероксидазной активности в гепатоцитах и нормализации супероксиддисмутазной активности в крови подопытных животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: прооксидантно-антиоксидантный баланс, несбалансированное питание, биополимер из тканей рапаны, крысы
Питание является одним из важнейших факторов, определяющих устойчивость организма к неблагоприятным условиям среды проживания. Проведенные ранее нами исследования свидетельствуют, что несбалансированная по содержанию животных белков и витаминов антиоксидантного ряда диета приводит к увеличению уровня продуктов свободнорадикального повреждения липидов и белков в печени и крови молодых и старых крыс, которое обусловлено активацией генерации активных форм кислорода и снижением активности ряда антиоксидант-ных ферментов [1, 2]. Такое нарушение прооксидантно-антиоксидантного баланса в тканях подопытных животных может быть основной причиной возникновения и развития ряда патологий, в связи с чем и требует антиоксидантной коррекции.
Известно, что введение пищевой добавки из аронии черноплодной (Агота те1апо-сагра) в несбалансированный рацион подопытных крыс снижало уровень гидроперекисей липидов (ГПЛ) в микросомах и митохондриях печени и в плазме крови до уровня контрольных животных [1-3]. Вместе с тем, эта пищевая добавка не восстанавливала у подопытных крыс сниженную активность селензависимой глутатионпероксидазы (ГП) в митохондриях и постмитохондриальной фракции печени.
В связи с вышеизложенным для эффективной коррекции прооксидантно-антиоксидантного баланса в тканях крыс, получавших несбалансированный рацион питания, представлялся целесообразным поиск новых пи-
щевых добавок, применение которых позволит увеличить активность эндогенной ферментативной антиоксидантной системы организма и, особенно, активность селензависимой ГП. Известно, что пищевая добавка биополимер из тканей рапаны (БР) характеризуется полноценным составом аминокислот, разнообразным составом углеводов и липидов, а также наличием жизненно важных минеральных веществ [4]. Изучение ан-тиоксидантных свойств этой добавки представлялось нам перспективным, поскольку ранее нами было показано [4], что биополимер из тканей мидии, полученный таким же образом, как и из тканей рапаны, способен повышать активность ряда антиоксидантных ферментов печени крыс после гипертермии.
Работа выполнена в рамках научноисследовательской темы «Вплив аліментарних факторів-модуляторів рівню активних форм кисню та азоту на функцію біомембран при старінні» (№ государственной регистрации 010611001581), которая выполняется в НИИ биологии Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина МОН Украины.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование состояния прооксидантно-антиоксидантной системы в сыворотке крови и гепатоцитах было проведено на 2-месячных крысах-самцах линии Вистар и выполнено с соблюдением правил Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986). Экспе-
риментальные животные 1-месячного возраста были разделены на контрольную и 2 подопытных группы по 6 животных в каждой. Контрольные крысы получали в течение 30 дней стандартный рацион питания. Подопытные животные обеих групп в течение 30 дней содержались на несбалансированном по содержанию белков животного происхождения и витаминов антиоксидантного ряда рационе, описанном в работе [2]. Крысам одной из подопытных групп на протяжении всего эксперимента к рациону добавляли пищевую добавку БР в дозе 60 мг на 100 г веса тела.
Гепатоциты получали неферментативным методом как описано [5]. Жизнеспособность клеток после выделения составляла не меньше 80-85% (тест с окрашиванием три-пановым синим). Для получения сыворотки кровь собирали во время декапитации, отстаивали 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 3 тыс. об./мин в течение 15 мин. Сыворотку крови отбирали и хранили на льду до использования в опыте.
Измерение содержания ГПЛ в гепатоци-тах проводили по методу Ohkawa et al. [6], а в сыворотке крови - по методу Asakawa et al. [7]. Спектр поглощения окрашенного продукта регистрировали на двулучевом спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) и измеряли разность экстинкций при 535 и 520 нм. Содержание ГПЛ определяли в эквивалентных количествах малонового диальдегида (МДА) с учетом коэффициента молярной экстинкции 1,56-105 М'-см"1. Содержание шиффовых оснований (ШО) в гепатоци-тах определяли флуориметрически после их экстракции (хлороформ : метанол = 1:2) из суспензии [8]. Результаты выражали в относительных единицах, считая интенсивность флуоресценции 1 мкг хининсульфата в 1 мл
0,1 N H2S04 равной 1950 единицам [8].
Измерение антиокислительной активности (АОА) биополимера из тканей рапаны проводили на модели желточных липопро-теидов [9]. Определение антирадикальной активности (АРА) (перехват "ОН-радикалов) проводили с дезоксирибозой оду [10].
Супероксиддисмутазную активность (СОД) (КФ 1.15.1.1) сыворотки крови определяли спектрофотометрически [11] при 560 нм на двулучевом спектрофотометре Specord UV VIS и рассчитывали в единицах активности на 1 мл сыворотки крови. Содержание ферментативно-активного церулоплазмина (КФ 1.16.3.1) определяли в сыворотке крови как описано в работе [12]. Окрашенные образцы спектрофотометрировали при 530 нм, содержание церулоплазмина выражали в нмоль/мл сыворотки крови. Глутатионперок-
сидазную активность (КФ 1.11.1.9) определяли в гепатоцитах и сыворотке крови спектрофотометрически при 340 нм [13] и выражали в нмоль NADPH/мин на 10б клеток или на 1 мл сыворотки с учетом коэффициента молярной экстинкции 6,22-103 М '-см"1. Глу-татион-8-трансферазную активность (ГТ) (КФ 2.5.1.18) измеряли в гепатоцитах спектрофотометрически при 340 нм [14] и рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинкции 9,6-103 М'-см"1. Глутатионредуктазную активность (ГР) (КФ 1.6.4.2) в гепатоцитах измеряли спектрофотометрически по уменьшению уровня NADPH [15] и выражали в нмоль NADPH/ мин на 10б клеток с использованием коэффициента молярной экстинкции 6,22-103 М -см"1.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью компьютерного пакета программ «Statistika V.6» с использованием t-критерия Стьюдента. Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводили с помощью критерия Шапиро-Уилки. Достоверно различающимися считались результаты при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Представленные в таблице 1 данные исследования АОА и АРА биополимера из тканей рапаны в условиях in vitro свидетельствуют, что АОА водного раствора БР была существенно ниже, чем активность пищевой добавки из аронии черноплодной и известного антиоксиданта а-токоферола [16]. Так, а-токоферол в концентрации 0,005 мг/мл реакционной среды ингибировал накопление МДА в суспензии желточных липопротеидов на 31,2±6,1 % [16], а пищевая добавка БР только в концентрации 5,0 мг/мл снижала этот показатель на 26,8% (табл. 1).
Таблица 1
Антиокислительная и антирадикальная (перехват ОН-радикалов) активности биополимера из тканей рапаны (%, M±sd; п=4)
Концентрация, мг/мл АОА АРА
0,2 - 24,0±2,1
0,4 - 40,3±2,1
0,6 9,8±2,8 -
0,8 - 59,0+1,3
1,2 17,9±2,2 -
2,5 22,8±4,3 77,3±1,2
5,0 26,8±2,4 81,7±2,2
Вместе с тем, при изучении АРА БР было установлено, что способность этой пищевой добавки перехватывать один из наиболее реакционноспособных метаболитов кислорода ("ОН-радикал) была одного порядка со
способностью известного перехватчика этих радикалов - маннита [16].
Таким образом, полученные в опытах in vitro данные свидетельствуют, что БР проявляет определенную антиокислительную активность и выраженную антирадикальную активность.
Проведенные исследования защитного действия БР в условиях in vivo позволили установить, что содержание животных в течение 30 дней на несбалансированной диете приводило к двукратному возрастанию уровня ГПЛ в гепатоцитах крыс, а дополнение
Влияние несбалансированной диеты прооксидантно-антиоксидантного бал!
несбалансированного рациона в течение всего эксперимента пищевой добавкой вызывало снижение накопления этих продуктов в
1,5 раза (табл. 2). Содержание конечных продуктов свободнорадикального окисления липидов (ШО) в ответ на несбалансированное питание возрастало в 2 раза относительно их уровня при использовании стандартного рациона, а при использовании пищевой добавки несколько снижалось (на 21%, Р>0,05) относительно несбалансированного рациона, оставаясь при этом значительно выше, чем у контрольных крыс (табл. 2).
Таблица 2
и пищевой добавки БР на состояние шса в гепатоцитах крыс (M±sd; п=4-5)
Измеряемый параметр Варианты опыта
Контроль Диета Диета + БР
ГПЛ, нмоль МДА/100 клеток 0,647±0,157 1,375+0,132' 0,931+0,116 v
ШО, уел. ед./10° клеток 17,65+1,78 35,73+6,78' 28,25+3,31
Общая ГП активность, нмоль КАБРН/мин-Ю0 клеток 117,50+13,16 32,30+4,41 48,90+7,02
Селензависимая ГП активность, нмоль КАБРН/ мин-106 клеток 55,51+10,29 3,45+0,76* 9,70+2,30*’**
Селеннезависимая ГП активность, нмоль КАБРН/ мин-106 клеток 62,05+4,52 28,96+3,85* 37,42+4,91*
ГТ, нмоль ХНБ/мин-10° клеток 7,33+0,72 15,20+3,31 19,81+4,36
ГР, нмоль КАЕ)РН/мин-10о клеток 35,1+1,9 32,3+3,9 44,6+9,2
F < 0,05 относительно контроля; ** - Р < 0,05 относительно группы «Диета».
В гепатоцитах крыс селензависимая ГП активность в ответ на несбалансированную диету снижалась в 16 раз (табл. 2). Применение БР приводило к увеличению уровня исследованной активности в 2,8 раза относительно несбалансированной диеты, но при этом уровень этой активности оставался существенно ниже, чем при использовании стандартного рациона. Общая (селензависимая + селеннезависимая) ГП активность, которую измеряли с гидроперекисью кумола, в гепатоцитах животных, содержавшихся на несбалансированном рационе, снижалась менее выражено, чем селензависимая активность (в 3,6 раз относительно стандартного рациона). Введение в рацион пищевой добавки не приводило к достоверному возрастанию общей ГП активности. Установленные особенности изменения общей ГП активности могут быть связаны с тем фактом, что в ответ на использование несбалансированного рациона и применение на его фоне пищевой добавки изменения селеннезависи-мой ГП активности были менее выраженными, чем селензависимой (табл. 2).
При изучении влияния несбалансированного питания и пищевой добавки на активность других антиоксидантных ферментов в гепатоцитах крыс было обнаружено, что в ответ на несбалансированный рацион активность ГТ достоверно возрастала, а добавка к рациону БР не вызывала дальнейших изменений этой активности (табл. 2). Активность
ГР практически не изменялась ни у одной из подопытных групп животных (табл. 2).
Исследование состояния прооксидантно-антиоксидантного баланса крови крыс позволило установить, что в ответ на несбалансированное питание содержание ГПЛ достоверно возрастало относительно уровня у животных со стандартным питанием (на 34%) (табл. 3). При этом содержание ферментативно-активного церулоплазмина не изменялось, а активности селензависимой ГП и СОД снижались на 48% и 23% соответственно. Введение в рацион БР не приводило к нормализации ГП активности, но снижало содержание ГПЛ и повышало активность СОД до уровня контроля (табл. 3).
В целом, полученные данные свидетельствуют, что использованная пищевая добавка (биополимер из тканей рапаны), которая проявляла в условиях in vitro значительную антирадикальную активность, может быть использована для коррекции изменений прооксидантно-антиоксидантного баланса при несбалансированном питании, так как при введении крысам на фоне несбалансированного рациона она приводит к нормализации содержания гидроперекисей липидов в крови и достоверному снижению уровня этих продуктов ПОЛ в печени крыс, к менее выраженному снижению глутатионперокси-дазной активности в печени и нормализации супероксиддисмутазной активности в крови подопытных крыс.
Таблица 3
Влияние несбалансированной диеты и пищевой добавки БР на состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса в сыворотке крови крыс (М±м1; п=6)
Измеряемый параметр Варианты опыта
Контроль Диета Диета + БР
ГПЛ, нмоль МДА/мл 3,51±0,19 4,69±0,25 3,53±0,18
ГП активность, мкмоль КАБРН/мин-мл 2,33±0,18 1,22±0,14 1,36+0,13'
Церулоплазмин, нмоль/мл 1,17±0,06 1,58±0,23 1,50±0,23
Супероксиддисмутаза, уел. ед./мл 111,7±4,5 86,6±6,8 110,8±6,7"
* - F < 0,05 относительно контроля; ** - Р < 0,05 относительно группы «Диета».
ВЫВОДЫ
1. В условиях in vitro биополимер из тканей рапаны проявляет определенную анти-окислительную активность и выраженную антирадикальную активность, соизмеримую с активностью известного перехватчика "ОН-радикалов - маннитола.
2. Введение биополимера из тканей рапаны на фоне несбалансированной диеты приводит к существенному снижению содержания гидроперекисей липидов в ге-патоцитах и нормализации этого показателя в сыворотке крови крыс.
3. При исследовании показателей, характеризующих состояние ферментативной антиоксидантной системы печени и кро-
ЛИТЕРАТУРА
1. Tkachenko V., Nikitchenko Y., Tovstiak V. // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, Lublin-Polonia. - 2004. - Vol. XVII. - № 2. - P. 289-291.
2. Никитченко Ю.В., Падалко В.И., др. //Радиац. Биол. Радиоэкология,- 2008. - Т.48, №2. -С.171-176.
3. Ткаченко В.М., Нікітченко Ю.В., ТовстякВ.В. //Біологія тварин. - 2004. - Т.6, № 1-2. - С. 196-202.
4. Декларац. пат. 60504 UA, А 7 А61К35/36. Біополімер з тканин молюсків, спосіб його виділення та біологічні властивості: О.Є. Бітютська, Т.М. Овсянникова, А.Г. Губанова та ін. (Україна). - № 2002108573; Заявл. 29.10.02; Опубл. 15.10.03, Бюл. № 10. -9 с.
5. Kravchenko L., Petrenko A., Fuller В. // Cell Biol. Int. - 2002. - Vol. 26. - P. 1003-1006.
6. OhkawaH., Ohahi N., Jadi K. //Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 95. - № 2. - P. 351-358.
7. Asakawa Т., Matsushita S. //Lipids. - 1980. - Vol. 15. - № 3. - P. 137-140.
8. Flercher B.L., Dillard C.J., Tappel A. Y. //Anal. Biochem. - 1973. - Vol. 52. - P. 1-9.
9. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. и др. // Лаб. дело. - 1988. - № 5. - С. 59-62.
10. Halliwell В., Guttendge J.M.C., Aruoma O.I. //Anal. Biochem. - 1987. - Vol. 165. - № 1. - P. 215-219.
11. Beavchamp C., Fridovich I. //Anal. Biochem. - 1971. - Vol. 44. -№ 1. -P. 276-287.
12. RavinH.A. //Lancet. - 1956. - Vol. 1. - P. 7267-7271.
13. PagliaD.E., Valentine W.N. //I Lab. Clm. Med. - 1967. - Vol. 70. - P. 158-169.
14. YounesM., Schlichting R., Siegers C.P. //Pharmacol. Res. Communs.- 1980.-Vol.2.-№ 2. - P. 115-128.
15. Герасимов A.M., Королева JI.A., Брусев A.C. и др. //Вопр. мед. химии,- 1976.-Т.22, № 1. - С. 89-94.
16. Прооксидантно-антиоксидантний баланс та структурно-функціональний стан біомембран при застосуванні незбалансованих дієт: Звіт про НДР / НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. - № ДР 0106U001581. - X., 2006. - 37 с.
ви крыс, установлено, что в ответ на введение биополимера из тканей рапаны на фоне несбалансированного питания наблюдается замедление снижения глу-татионпероксидазной активности в гепа-тоцитах и нормализация супероксиддис-мутазной активности в сыворотке крови.
Представляется целесообразным дальнейший поиск новых средств более эффективной коррекции изменений активности ферментативной антиоксидантной системы организма и, особенно, глутатионпероксида-зы, возникающих при несбалансированном по содержанию животных белков и витаминов антиоксидантного ряда питании.
КОРЕКЦІЯ БІОПОЛІМЕРОМ 13 ТКАНИН РАПАНН СТАНУ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО БАЛАНСУ ОРГАНІЗМУ ЩУРІВ ПРИ НЕЗБАЛАНСОВАНОМУ ХАРЧУВАННІ
Ю.В. Нікітченко1, В.М. Дзюба1, Т.М. Овсяннікова1, О. Є. Бітютська2, В.В. Бондар1,
Г.О. Шеремет1, А. С. Попович1
'Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, м. Харків, Україна
2Південний науково-дослідний інститут морського рибного господарства та океанографії, м. Керчь,
Україна
РЕЗЮМЕ
Досліджено особливості зміни прооксидантно-антиоксидантного балансу в гепатоцитах і сироватці
крові щурів, яка викликана незбалансованим харчуванням, та можливості її корекції шляхом доповнення раціону харчовою домішкою (біополімер із тканин рапани (БР)). Встановлено, що використана харчова домішка в умовах in vitro виявляє значну антирадикальну активність. Показано, що застосування БР на тлі незбалансованого раціону приводить до нормалізації вмісту гідроперекисів ліпідів у крові та вірогідного зниження рівня цих продуктів ПОЛ у гепатоцитах щурів, до уповільнення зниження глутатіонпероксидазної активності в гепатоцитах і нормалізації супероксиддисмутазної активності в крові піддослідних тварин.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: прооксидантно-антиоксидантний баланс, незбалансоване харчування, біополімер із тканин рапани, щури
CORRECTION BY BIOPOLYMER FROM RAPANA TISSUES THE CHANGE OF PROOXIDANT -ANTIOXIDANT BALANCE STATE OF RAT ORGANISM UNDER UNBALANCED NUTRITION
Yu. V. Nikitchenko1, V.N. Dzyuba1, T.N. Ovsyannikova1, O. Ye. Bityutskaya2, V. V. Bondar1,
A.A. Sheremet1, A.S. Popovich1
'V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, Ukraine
2South Scientific-research institute of marine fish industry and oceanography, Kerch, Ukraine SUMMARY
The peculiarities of change of prooxidant-antioxidant balance in rat hepatocytes and blood serum under unbalanced nutrition and possibilities of its correction by means of supplement of ration by food addition (biopolymer from rapana tissues (BR)) were investigated. It was found out that the used food addition in conditions in vitro had revealed significant antiradical activity. It is shown that the use of BR against the background of unbalanced ration led to normalization of lipid hydroperoxides content in blood and significant decrease of the level of these LPO products in rat hepatocytes, to the slowing of glutathione peroxidase activity decrease in hepatocytes and normalization of superoxide dismutase activity in blood of experimental animals.
KEY WORDS: prooxidant-antioxidant balance, unbalanced nutrition, biopolymer from rapana tissues, rats
АНТАГОНІСТИЧНА АКТИВНІСТЬ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПІД ВПЛИВОМ АКТИВАТОРІВ АЛОСТЕРИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
Т.П. Осолодченко, Н.І. Городницька, Л.Г. Штикер
Державна установа «Інститут мікробіології та імунології імені 1.1. Мечникова АМН України», Харків, Україна
РЕЗЮМЕ
У роботі використовувались штами Pseudomonas aeruginosa, енхансери із груп похідних ізохінолі-нів та імідазолів. Досліджувалась дія енхансерів як окремо, так і в їх комбінаціях на антагоністичну активність Pseudomonas aeruginosa. В результаті проведених досліджень було встановлено, що при використанні активаторів алостеричних ферментів антагоністична активність збільшується в 2 рази. Відмічався взаємний антагонізм між клінічними штамами P. aeruginosa 15, 27 і 87 та вакцинним штамом P. aeruginosa 66-16, який використовується при виробництві вакцин.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: Pseudomonas aeruginosa, клінічні та вакцинні штами, енхансери, антагоністична активність.
Інфекційні захворювання за даними ВООЗ за смертністю населення знаходяться на першому місці. Представники виду Pseudomonas aeruginosa широко розповсюджені в природі і виділяються від сільськогосподарських тварин, людини, гризунів, птахів та інше. P. aeruginosa є збудником синьогній-ної інфекції, яка широко розповсюджена в клініці. Штами P. aeruginosa є антибіотико-резистентними, тому вивчення відповідних біологічних властивостей має актуальне значення [1, 2]. Всі мікроорганізми/*, aerugino-
5а мають подібні культуральні та морфологічні властивості, а відрізняються за біохімічними, серологічними, імунологічними та патогенними властивостями [3, 4]. Однак про антагонізм мікроорганізмів по відношенню до інших штамів мало що відомо.
Вперше антагонізм мікробів був відмічений Л. Пастером в 1887 р. В подальших дослідженнях було встановлено, що це явище широко розповсюджене у природі. Під впливом антагоністів мікроби припиняють зростати та розмножуватися, в інших випадках
