CC BY
69
УДК 618.3-06-08:577.112.385.2
КОРРЕКЦИЯ ADMA-ПОДОБНОГО ГЕСТОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
© Гуреев В.В., Алёхин С.А., Должиков А.А., Мостовой А. С.
Кафедра клинической фармакологии, кафедра фармакологии, кафедра хирургических болезней № 2 Курского государственного медицинского университета, Курск; Научно-образовательный центр прикладной иммуноморфологии и цитогенетики
НИУ БелГУ, Белгород
E-mail: kaf. farmakolo g@kurskmed. com
Введение ADMA-подобного агента - LNAME крысам, вызывает блокаду NO-синтазы и приводит к патофизиологическим изменениям, подобным гестозу. Ведение фармакологических агентов обладающих эндотелеопротективными свойствами: L-аргинина, L-норвалина и рекомбинантного эритропоэтина, приводит к явной коррекции патологических изменений. При этом происходит не однородные изменения критериев оценки эффективности препаратов, что объясняется различными точками приложения механизмов их действия при ADMA-подобной модели гестоза. Результаты исследования служат предпосылкой для проведения дальнейших исследований с целью включения данных препаратов в клиническую практику или расширения показаний для их применения.
Ключевые слова: крысы, преэклампсия, L-NAME, лечение.
CORRECTION OF EXPERIMENTAL ADMA-LIKE PRE-ECLAMPSY
Gureev V. V., Alekhin S.A., Dolzhikov A.A., Mostovoy A.C.
Clinical Pharmacology Department, Pharmacology Department, Department of Surgical Diseases N 2
of the Kursk State Medical University, Kursk
L-NAME administration in pregnant rats leads to the pathological changes similar to pre-eclampsy ones. The administration of a pharmacological agent increasing NO activity (L-arginin, L-norvaline, erithropoietin) declines the pathological changes. According to different mechanisms of action the substances reveal different efficacy in ADMA-like pre-eclampsy model. The recent studies serve as a background to the further investigations and clinical adoption or broadening their indications.
Keywords: rats, pre-eclampsy, L-NAME, treatment.
Благополучное протекание беременности и успешные роды зависят от адаптационных возможностей женского организма и правильной перестройки функционирования различных систем органов и регуляторных механизмов. Основную роль в регуляции развития беременности играют гуморальные факторы, поскольку плацента не обладает нервным аппаратом. Во время беременности происходит динамическое качественное и количественное изменение не только гормонального спектра, но и многих других гуморальных регуляторов: факторов роста, простациклинов, тромбоксанов, эндотелинов, N0, цитокинов, а также рецепторов к ним [8, 10, 16, 19]. Образование гуморальных регуляторов происходит как в материнской части плаценты, так и различных участках плодного яйца. Поэтому плод является не пассивно развивающимися тканями, а объектом, принимающим активное участие в регуляции этого процесса [7, 9, 16].
В последние годы обнаружено, что концентрация асимметричного диметиларгинина (ADMA) в материнской плазме гораздо выше у женщин с преэклампсией [19] и что повышенные концентрации ADMA - один из предикторов гестоза [17, 18, 19]. ADMA является физиологическим ингибитором N0-синтазы, и поэтому его 14
повышенное содержание в эндотелиальных клетках может служить пусковым моментом к развитию гестоза.
Ранее в нашей лаборатории исследовался целый ряд препаратов, относящихся к различным фармакологическим группам, обладающих эндо-телиопротективной активностью при различных N0 - дефицитных состояниях [3, 7, 5, 13, 15]. Обнадеживающие результаты при коррекции эндотелиальной дисфункции, в том числе и при AD-МА - подобном гестозе, получены с использованием L-аргинина [2, 12, 14]. Данный препарат значительно снижал или полностью предупреждал развитие патофизиологических явлений. Другими перспективными препаратами, обладающими способностью влиять на развитие морфофункциональных нарушений при гестозе, по нашему мнению, являются L-норвалин, относящийся к ингибиторам аргиназ, и рекомбинантный эритро-поэтин, усиливающий синтез тетрогидробиопте-рина, который, в свою очередь, является кофактором N0-синтазы. В настоящем исследовании проведено сравнительное изучение возможности коррекции экспериментального гестоза с помощью L-норвалина и рекомбинантного эри-тропоэтина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на белых крысах-самках линии Wistar массой 250-300 г. Неселективный блокатор NO-синтазы ^нитро^-аргинин-
метиловый эфир (L-NAME) вводился внутри-брюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение 7 дней (14-20 сутки беременности). На 21 сутки беременности под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в правую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Проводили сосудистые пробы на эндотелийзави-симую вазодилатацию (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, и эн-дотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНЗВ) -внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг с расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) [11]. Беременные самки были разделены на группы (n=10): I - интактные; II - с введением L-NAME ежедневно с 14 по 21 сутоки беременности; III - с введением на фоне L-NAME L-аргинина (200 мг/кг внутрижелудочно) ежедневно с 14 суток беременности; IV - с введением на фоне L-NAME L-норвалина (10 мг/кг, внутрижелудоч-но) ежедневно с 14 суток беременности; V -с подкожным введением на фоне L-NAME рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг на
7, 10, 13, 16, 19 сутки беременности. Исследование микроциркуляции в плаценте проводили с помощью оборудования компании "Biopac systems": полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDf100C и датчиком TSD144. Регистрация результатов ЛДФ производилась программой Acqknowledge версии 3.8.1, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ) [1]. NO-продуцирующая функция эндотелия оценивалась на основании данных содержания стабильных метаболитов NO - нитрит-ионов NOx в сыворотке крови. Беременность определяли пальпаторно на 14 сутки. Морфологическое исследование плацент проводилось вместе с имплантационным участком рога матки. Гистологические срезу после стандартной заливки материала в парафин изготавливали в строго вертикальном направлении через середину плацентарного диска с захватом всех слоев плаценты и стенки рога матки. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение микропрепаратов, фотопротоколирование и морфометрию проводили на микроскопе Leica DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Блокада NO-синтазы, вызванная семидневным введением L-NAME, приводила к нарушению взаимоотношений вазодилатирующих и ва-зоконстрикторных механизмов регуляции сосудистого тонуса, о чем свидетельствовало увеличение КЭД с 1,28±0,23 у интактных беременных животных до 3,06±0,32 (р<0,05). Кроме этого, наблюдался значительный подъем систолического и диастолического артериального давления с 125±6,3 и 82,0±5,8 до 183,1±9,4 и 136,7±7,4 мм рт.ст. соответственно. Введение блокатора NO-синтазы приводило к значительному снижению показателя микроциркуляции в плаценте с 425,90±39,55 до 210,00±21,08 (р<0,05), а также к снижению содержания стабильных метаболитов NOх в сыворотке крови с 2,35±0,21 мкмоль/дл до 1,33±0,09 мкмоль/дл (р<0,05). При микроскопическом исследовании плаценты наблюдаются неравномерное кровенаполнение спонгиозного слоя, вакуольная дистрофия гигантского трофоб-ласта, очаги некроза на границе гигантского тро-фобласта и децидуальной ткани, дистрофические изменения и малокровие децидуального слоя (рис. 1, 2).
Таким образом, моделирование ADMA-подобной L-NAME-индуцированной преэклам-псии в эксперименте у крыс характеризовалось выраженным повышением АД, явлениями эндотелиальной дисфункции, снижением плацентарной микроциркуляции и NO-продуцирующей функции эндотелия, деструктивными изменениями в плаценте.
Длительное, в течение 7 суток, ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина и L-норвалина на фоне L-NAME-индуцированной преэклампсии приводило к достоверному снижению КЭД до 1,50±0,25, и 1,51±0,15 соответственно, что в два раза меньше, чем у нелеченых животных (р<0,05). Отмечалось нормализации взаимоотношения вазодилатирующих и вазоконст-рикторных реакции и при коррекции экспериментальной преэклампсии эритропоэтином, о чем свидетельствует снижение КЭД в этой группе до 1,67±0,15.
Достоверно значимое снижение артериального давления примерно в равной степени отмечалось в группах животных, леченных L-аргинином и эритропоэтином. Исследование микроциркуляции плаценты выявило ее существенное улучшение во всех группах леченых животных (табл.).
При биохимическом исследовании сыворотки крови обнаружено предотвращение снижения содержания стабильных метаболитов NO у групп животных, леченных L-аргинином и L-норвали-
Рис. 1. Строение интактной плаценты.
Примечание: А - плацента на поперечном срезе; Б - спонгиозный слой; В - слой гигантского трофобласта; Г - децидуальная ткань. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото; Х 200.
Рис. 2. Патологические изменения при моделировании экспериментального гестоза.
Примечание: А - Неравномерное кровенаполнение спонгиозного слоя; Б - Вакуольная дистрофия гигантского трофобласта; В - Очаги некроза на границе гигантского трофобласта и децидуальной ткани; Г - Дистрофические изменения, малокровие децидуального слоя. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото; Х 200.
Таблица
Результаты коррекции L-NAME-индуцированной преэклампсии у крыс (М±т; п=10)
Показатель Группа САД мм рт. ст. ДАД мм рт. ст КЭД усл. ед. Микроциркуляция пер. ед. Концентрация нитрит-ионов (Шх) мкмоль/дл
Интактные 125±6,3у 82,0±5,8 у 1,28±0,23 у 425,9±39,6 у 2.35±0,21
L-NAME 183,1±9,4* 136,7±7,4* 3,06±0,32* 210,0±21,1* 1,33±0,09*
L-NAME + L-аргинин 151,2±5,3 у 112,8±6,8 у 1,50±0,25 у 342,5±29,3 у 2,33±0,15 у
L-NAME + L-норвалин 194,5±8,3* 146,4±8,2* 1,51±0,15 у 455,7±41,5 у 2,10±0,14 у
L-NAME + рекомбинантный эритропоэтин 143,5±4,3 у 98,1±5,9 у 1,67±0,15 у 301,1±19,4 у 1,39±0,12*
Примечание: САД, ДАД - систолическое и диастолическое артериальное давление (мм рт.ст.); КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции (у.е.); микроциркуляция в плаценте (Пер/ед); концентрация нитрит-ионов ^Ох);
- р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; у- р < 0,05 в сравнении с группой L-NAME.
• ч,« Фч >о
5# -• V. ч*
4 «•«'
■А - _
'г*^ I
»* 'V %
► I <ТлЮ1МЗГ> ^ /. Х>' ♦»»
Рис. 3. Морфологическая картина плаценты при лечении экспериментального гестоза L-норвалином.
Примечание: А - Децидуальный слой: мономорфная структура, отсутствие дистрофических изменений; Б - Равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя; В - Отсутствие дистрофических изменений трофобласта. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото; Х 200.
ном, уровень которых составил 2,33±0,15 и 2,10±0,14 мкмоль/дл соответственно.
Микроскопическое исследовании патологических изменений плаценты при моделировании АДМА-подобного гестоза выявило эффективность используемых фармакологических агентов, но в различной степени. Наиболее близкая к группе интактных животных морфологическая картина в плаценте наблюдалась у животных, получавших L-аргинин и L-норвалин (рис. 3).
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что длительное, в течение 7 суток внутрибрюшинное введение блокатора N0-синтазы L-NAME вызывает у беременных самок крыс комплекс изменений, ассоциированных с N0-дефицитной эндотелиальной дисфункцией. На 7 сутки развивалась выраженная гипертензия, в 3 раза увеличивался коэффициент эндотелиальной дисфункции, происходило снижение показателей плацентарной микроциркуляции, снижения конечных метаболитов N0 в плазме и наблюдались четко выраженные морфологические изменения в плаценте при микроскопическом исследовании. Описанный симптомоком-плекс можно соотнести с развитием гестоза в клинических условиях.
Использование ряда фармакологических агентов приводило к явной коррекции моделируемого патологического состояния с индивидуальными особенностями в каждом случае. Это связано, с одной стороны, с вовлечением на 7 сутки в патогенетический процесс не только нитроэргической системы, но и других элементов гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения, и различными механизмами реализации улучшения функции эндотелия.
В обычных условиях физиологическая регуляция происходит таким образом, что любое повышение ADMA, или введение ADMA-подобного агента, приводит к вытеснению ими L-аргинина из активного центра фермента. Происходит конкурентное, обратимое субстратное ингибирование эдотелиальной N0-синтазы, что приводит к снижению синтеза N0. Повышение концентрации L-аргинина приводит к развитию событий в обратном направлении. Происходит субстратное вытеснение ADMA, активация N0-синтазы, увеличение синтеза N0 [2, 12, 14]. Повышения содержания L-аргинина можно добиться путем введения его извне.
Другим способом увеличения количества L-аргинина, связывающегося с N0-синтазой, является блокирование активности аргиназы, которая образует из L-аргинина орнитин и мочевину. Этим объясняется выраженная эффективность применения L-норвалина, являющегося блокато-ром аргиназы. Введение этого фармакологическо-18
го агента по большинству основных критериев оказывает терапевтический эффект, равный L-аргинину.
Увеличение синтеза N0 из L-аргинина можно добиться не только повышением активности N0-синтазы, но и увеличением ее количества. Введение рекомбинантного эритропоэтина приводит к усилению синтеза тетрогидробиоптерина. Тот, в свою очередь, являясь ко-фактором N0-синтазы, способствует ускорению ее синтеза, что приводит к увеличению образования N0 из L-аргинина [5].
Неоднородное изменение критериев оценки эффективности используемых фармакологических агентов для коррекции экспериментального гестоза объясняется различными точками приложения. Результаты проведенного исследования сопоставимы с данными исследований, проводимых другими авторами [2, 5, 12, 14]. Это, с одной стороны, подтверждает правильность выбранной концепции, с другой - дает основание для проведения более углубленных исследований в этом направлении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Покровский М.В. и др. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. -Т. 71, № 3. - С. 23-25.
2. Залозных Я.И., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. и др. Применение L-аргинина в комплексе с амло-дипином и индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции // Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - № 1-2. - С. 52-55.
3. Корокина Л.В., Граник В.Г., Макаров В.А. и др. Изучение эффектов синтетических доноров оксида азота при L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции // Кубанский науч. мед. вестн. -2006. - № 9. - С. 141-145.
4. Корокин М.В., Пашин Е.Н., Бобраков К.Е. и др. Изучение эндотелиопротективного и коронарного действия производных 3-оксипиридина // Кубанский науч. мед. вестн. - 2009. - № 4. - С. 104-108.
5. Корокина Л.В., Колесник И.М., Покровский М.В. и др. Фармакологическая коррекция L-NAME индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином // Кубанский науч. мед. вестн. - 2009. - № 9. - С. 66-69.
6. Крукиер И.И., Орлов А.В., Ермолова Н.В. Продукция вазоактивных компонентов в плаценте при ее функциональной недостаточности // Пренатальная диагностика и беременности высокого риска: матер. пленумов Росс. ассоц. акуш.-гинекол., про-блемн. комис. РАМН МЗ РФ. - Ростов н/Д: Изд-во МП «Книга», 2003. - С. 74-76.
7. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Орлов В.И., Друк-кер Н.А. Состояние простагландинсинтезирующей системы и продукция интерлейкинов в плодных
оболочках при преждевременных родах // Пренатальная диагностика и беременности высокого риска: матер. пленумов Российской ассоц. акуш.-гинекол., проблемн. комис. РАМН МЗ РФ. - Ростов н/Д: Изд-во МП «Книга», 2003. - С. 61 - 65.
8. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. Содержание оксида азота и эндотелина в пуповине и плодных оболочках при преждевременных родах // Успехи современного естествознания. - 2005. - № 10. - С. 164.
9. Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Длужевская Т.С., Мелконова К.Ю., Крукиер И.И. Околоплодные воды. Химический состав и биологические функции. - Ростов н/Д: Изд-во МП «Книга», 1998. -216 с.
10. Орлов А.В., Погорелова Т.Н., Крукиер И.И., Друк-кер Н.А. Содержание факторов роста и вазоактивных соединений в сыворотке крови женщин в 1 триместре беременности // Пренатальная диагностика и беременности высокого риска: матер. пленумов Росс. ассоц. акуш-гинекол., проблемн. ко-мис. РАМН МЗ РФ. - Ростов н/Д: Изд-во МП «Книга», 2003. - С. 302 - 305.
11. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - № 10, Т. 91. - С. 72 - 77.
12. Покровский М.В., Покровская Е.Г., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б. Эндотелиопротективные эффекты L-аргинина при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота // Эксперим. и кли-нич. фармакология. - 2008. - Т. 71. № 2. - С. 29 -31.
13. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. Сравнительное изучение потенциальных эн-
дотелиопротекторов и препарата «Импаза» при моделировании дефицита оксида азота // Бюл. экс-перим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, №
8, приложение. - С. 154 - 158.
14. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Гуреев В.В. и др. Фармакологическая коррекция L-аргинином «ADMA-ENOS-ассоциированных мишеней» при экспериментальной преэклампсии // Кубанский науч. мед. вестн. - 2010. - № 1. - С. 85 - 92.
15. Черноморцева Е.С., Покровский М.В., Покровская Т.Г. и др. Экспериментальное изучение кар-диопротекторного и эндотелиопротекторного действия макролидов и азалидов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72, № 2. - С. 29 - 31.
16. Pogorelova T.N., Drukker N.A., Krukier I.I., Orlov V.I. Physical and chemical modification of placental plasmatic membranes under hypoxia // J. Hypoxia medical. - 1998. - Vol. 6, N2. - P. 56.
17. Savvidou M.D. Endothelial dysfunction and raised plasma concentrations of asymmetric dimethylargin-ine in pregnant women who subsequently develop preeclampsia // Lancet. - 2003. - Vol. 361. - P. 1511 -1517.
18. Smith C.L. Dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity modulates ADMA levels, VEGf expression, and cell phenotype // Biochemical & Biophysical Research Communications. - 2003. - Vol. 308. - P. 984 - 989.
19. Speer P.D. Elevated asymmetric dimethyl-arginine concentrations precede clinical preeclampsia, but not pregnancies with small-for-gestational-age infants // Am J Obstet Gynecol. - 2008. - Vol. 198, N1. -P. 112 - 117.
