CC BY
30
Конъюгированные антигены на основе синтетических иммуномодуляторов
А. 3. Абышев, Э. М. Агаев
Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток, РФ Азербайджанский медицинский университет, г. Баку
ВВЕДЕНИЕ. Как известно из многочисленных литературных данных [1-7, 9-12, 14, 15, 17-25, 27, 28, 30, 33, 35-39], современная биотехнология и иммунофармакология располагают высокоэффективными природными и синтетическими им-муномодуляторами (ИМ) для получения, на их основе, антител к антигенным детерминантам различных вирусов. Это обстоятельство обеспечивает бурное развитие разработок многих современных препаратов, необходимых для диагностики и лечения различных вирусных инфекций. В последние годы интерес к проблеме синтетических иммуномодуляторов резко возрос в связи с их широким использованием в фундаментальной и прикладной науке, в частности, их стали применять при создании высокоактивных диагностических препаратов и конструировании вакцин нового поколения, особенно синтетических вакцин, так как синтетические иммуно-модуляторы позволяют значительно усилить имму-ногенность многих слабоиммуногенных природных антигенов. Таким образом, становится все более очевидной перспективность и научно-практическая значимость применения синтетических полимерных иммуномодуляторов в разработках диагностических и вакцинных препаратов.
В настоящее время в литературе имеются данные [13, 26, 32, 33] однозначно свидетельствующих о том, что, например, протективными антигенами вируса гриппа (ВГ) являются поверхностно расположенные гликопротеины - гемаг-глютинин (ГА) и нейраминидаза (НА). Именно благодаря им в ответ на введение ВГ в макроорганизме формируются вируснейтрализующие антитела. Разнообразие в структуре поверхностных антигенов ВГ определяет антигенную спе-
цифичность вируса. Благодаря своим протектив-ным свойствам, поверхностные актигены ВГ являются основой для так называемых субъединичных гриппозных вакцин. Следует отметить, что пи-рогенный и токсический эффекты цельновирион-ных инактивированных гриппозных вакцин обусловлены, в основном, М-белком и нуклеопротеи-дами [32]. Все остальные структурные компоненты ВГ рассматриваются как балластные вещества [13].
Известно, что индивидуальные, хорошо очищенные поверхностные антигены ВГ могут быть использованы в качестве иммуногенов при получении моноспецифических диагностических сывороток и лечебно - профилактических препаратов. Однако в изолированном виде они обладают слабой иммуногенной активностью, поэтому при получении различных вакцин и диагностических сывороток, используются различные адъ-юванты. За рубежом в качестве стимуляторов иммуногенеза, в основном, применяются масляные или минеральные адьюванты [13, 32], в том числе широко известный адьювант Фрейнда. В России некоторые авторы используют гель гид-роокси алюминия и искусственные полиэлектролиты [10, 11, 19, 20]. Однако, препараты, полученные на основе геля гидроокиси алюминия, обладают повышенной реактогенностью, а синтетические полиэлектролиты, используемые в работах [10, 11, 19, 20], достаточно токсичны. Исходя из этого ведется интенсивный поиск более "мягких" и эффективных иммуномодуляторов.
Задачей настоящего исследования являлась разработка схемы получения некоторых новых иммунобиологических препаратов различного состава и строения, их использование для усиления иммуногенности гемагглютинина ВГ путем
Таблица 1. Характеристика полученных гликопротеинов
Штамм вируса Кол-во опытов Белок ГП по методу Поури в м кг/мл Выход ГА по ГП в ОРИД в м кг/мл Выход ГП по ГА в ОРИД от исходного белка дезинтеграта в %
А/Ленинград/385/8(К 10 488(290-595) 193(112-352) 58,5(33,9-106,7)
Х-79 7 295(142-400) 91(54-149) 27,6(16,4-45,1)
А/Чили/83К-2 5 330(240-460) 161(130-192) 48,8(39,4-58,2)
А/Ленинград/624/86 2 190(180-200) 67,7(40,9-95,7) 20,5(12,4-29)
А/ЭилпеЛ976/31 3 473(460-500) - -
Таблица 2. Характеристика физико-химических параметров и иммуногенной активности
коньюгатов ГП с ИМ-5
№ коньюгата Белок: Егво Белок ГА Активность
иммуно-модулятор (мкг/мл) (мкг/мл) мышиных сывороток (титр в РТГА)
1 1:1 0,640 125 180 1:30
2 1:5 0,625 125 180 1:45
3 1:10 0,850 185 180 1:49
4 1:20 0,852 175 180 1:14,9
Контроль ИМ 0:10 0 0 0 0
Контроль ГП 1:0 0,800 165 171 1:104
ковалентного связывания его с различными синтетическими иммуномодуляторами, а также изучение их химических, технологических и иммунобиологических свойств.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Методы выделения и очистки различных антигенов из вирусных суспензий, их детерминантных групп, а также иммунофармакологическое изучение синтезированных конъюгированных антигенов подробно описаны в работах [1, 30, 6, 5, 2, 3, 7]. Поэтому в данной работе, в основном, представлены некоторые фрагменты исследования физико-химических и иммунобиологических показателей рассматриваемых конъюгированных антигенов.
Для конъюгирования с синтетическими полимерными иммуномодуляторами нами был использован гемагглютинин ВГ, полученный с помощью ферментативного гидролиза бромели-ном [34, 8] или методом изоэлектрофокусирова-ния [35, 16], а также гликопротеины (ГП), очищенные дифференциальным центрифугированием [2, 30].
В таблице 1 представлены обобщенные результаты по характеристике ГП, получаемых из дезинтегратов ВГ различных штаммов. Как видно из представленных данных, выход ГП колебался в зависимости от штамма вируса: минимальный выход ГП наблюдался для штамма А/Ленинг-рад/624/86, максимальный для штамма А/Лени-нград/385,801г
Электрофоретическое изучение полученных ГП в SDS-электрофорезе по Лемли [36, 32] выявило наличие только ГА1 - тяжелой цепи и ГА2 - лег-
кой цепи ГА (Рис. 1).
ГА, выделенный изоэлектрофокусировани-ем, по электрофоретической подвижности был таким же, как и ГП; ГА, выделенный ферментативным гидролизом, несколько отличался от них: его легкая цепь ГА2 имела меньшую молекулярную массу. Это наблюдение не противоречит широко известному факту [37, 40] отсутствия в гемагглютинине, выделенном обработкой бро-мелином, гидрофобного конца с молекулярной массой около 5000.
Конъюгирование ГА с различными иммуно-модуляторами осуществляли в основном тремя способами: 1. Активацией карбоксильных групп карбодиимидом; 2. Воздействием на SH-группы с помощью малеимидных звеньев; 3. Непосредственным замещением водорода в ^Н2 и -ОН групп в гемагллютинине.
Количество связанного ГА оценивали по данным ОРИД [38] и по методу Лоури [39, 34].
Образование коньюгатов подтверждали даннми ИК - и Уф-спектроскопии.
Синтез коньюгатов ГП с ИМ-5 и ИМ-22
Пример 1. Коньюгирование ГП с ИМ-5 и ИМ-22 проводили следующим образом: реакционную смесь, состоящую из ГП с детергентом и соответствующих иммуномодуляторов, перемешивали в течение 12 час при 4°С и диализировали против 0,01 М ФБР на физиологическом растворе (рН 7,27,4). Коньюгаты отделяли от несвязавшихся имму-номодуляторов и ГП центрифугированием при 105000д в течение 1 часа. Осадок коньюгата растворяли в физиологическом растворе и определяли его состав.
В таблице 2 представлены данные по опреде-
Таблица 3. Характеристика физико-химических параметров и иммуногенной активности
коньюгатов ГП с ИМ-22
№ Белок:им- Егво Белок ГА Выход, Активность мы-
коньюгата муномоду-лятор (мкг/мл) (мкг/мл) % шиных сывороток (титр в РТГА)
5 1:1 0,641 180-140 102,3 59,5 1:138
6 1:5 0,920 180-148 140,4 66,9 1:138
7 1:10 0,610 180-144 81,5 52,7 1:194
8 1:20 0,599 140-60 78,8 44:5 1:49
Контроль ГП с ПАФ 1:275
Таблица 4. Характеристики коньюгатов ИМ-22 с ГП из вируса гриппа разных штаммов
Штамм вируса Белок по Лоури в мг/мл ГА по ОРИД в мг/мл Выход по количеству включенного в коньюгаты ГА* в %
А/Ленинград/385/eOR 1,56 0,85 26,4
Х-79 1,07 0,67 44,2
A/4mhh/83R-2 0,27 9,9
А/Ленинград/624/86 0,84 0,53 26,5х
A/Swine/1976/31 0,72 9,1х
* Выход определен по количеству включенного в коньюгаты белка
лению содержания общего белка, ГА по ОРИД и им-муногенной активности коньюгатов в опытах на мышах на основе ИМ-5 и ГП из вируса гриппа штамма А/Ленинграg/385/80R. Судя по содержанию включенного в коньюгаты белка оптимальным соотношением между белком и ИМ-5 является соотношение 1:10-1:20.
Следует отметить, что гемагглютинирую-щая активность ГП в коньюгатах сохранялась, а иммуногенная активность этих коньюгатов была ниже активности контрольных диализованных ГП.
В таблице 3 представлены данные по определению общего белка и ГА в коньюгатах ГП из ВГ штамма А/Ленинграg/385/80R с ИМ-22, а также иммуногенной активности этих коньюгатов в опытах на мышах. Видно, что минимальный выход коньюгата (44,5% по количеству включенного в коньюгаты ГА) и самая низкая активность мышиных сывороток (титр в РТГА - 1:49) наблюдались при соотношении белка: ИМ 1:20. При отношении 1:10 в исходной смеси выход коньюгата был несколько выше и составлял 52,7%, что ниже, чем при соотношении 1:5 (66,9%). Активность сывороток, полученных против коньюгата с исходным соотношением 1:10, была максимальной (титр в РТГА -1:194) и почти такой же, как на ГП с адъювантом Фрейнда (титр в РТГА - 1:275). Ввиду этого, соотношение 1:10 было признано оптимальным.
Пример 2. Для получения различных серий кроличьих сывороток были получены коньюгаты ГП из различных штаммов ВГ с ИМ-22 в следующих условиях: 190 мл реакционной смеси, содержащей 62,27 мг белка ГП и 622,7 мг ИМ-22 перемешивали в течение 18 часов при 4°С. Очистку коньюгата проводили диализом против 5 смен 450 кратного объема ФБР рН 7,2-7,4 в течение 5 суток и центрифугированием, ротор SW-27, в течение 1 часа при 22000 об/мин и 4°С. Осадок растворяли в 6,4 мл физиологического раствора. Характеристики коньюгатов ИМ-22 с ГП из ВГ разных штаммов представлены в таблице 4.
Синтез коньюгатов ГА вируса гриппа с ИМ-6 и ИМ-49.
Иммуномодуляторы ИМ-6 и ИМ-49 содержат в своих макромолекулах карбоксильные группы. Поэтому коньюгирование их с ГА вируса гриппа было осуществлено путем активирования ацили-рованным водорастворимым 1-3-(3-диметил-аминопропил) карбодиимидом (КДИ).
Пример 3. К раствору 30 мг ИМ-6, был добавлен раствор 3 мг ГА (633 мкг/мг) в том же буфере. Весовое соотношение белок/ИМ составило 1:16.
Затем при перемешивании и охлаждении (2-4°С) добавляли раствор 20 мг КДИ в 0,5 мл ФБР. После завершения реакции (24 часа) коньюгат отделяли гельфильтрацией на колонке (сефадекс G-150, элю-энт - ФБР на физиологическом растворе (Табл. 5).
Раствор коньюгата диализовали против дистиллированной воды в течение 48 часов и лиофиль-но сушили (выход 24 мг). Количество связанного ГА определяли по ОРИД, выход 40 мкг/мл. Выход по ГА 50%. Профили элюции приведены на рисунке 2.
В ИК-спектрах синтезированных коньюгатов наблюдалось исчезновение полосы поглощения при 1710 см-1, соответствующей валентным колебаниям С=0 карбоксильной группы, и появление полосы поглощения при 1750-1760 см-1, которую, по-видимому, следует отнести к С=0 группе образовавшегося сложного эфира.
Соотношение интегральных интенсивностей полос поглощения при 1750-1760 см-1 и 1690 см-1 сравнимо с отношением интегральных интенсивностей полос 1710 см-1 и 1690 см-1 в исходном им-муномодуляторе и составляет 4,0-4,5, что соответствует содержанию белка в коньюгате ~ 2025% Мол.
В УФ-спектрах ГИМ-6 и его коньюгата ГИМ-6-Б-ГА наблюдается сдвиг максимума поглощения на 20 нм, и существование его при 270 нм свидетельствует об образовании сложно-эфирной связи между ГИМ-6 и белком.
Пример 4. К раствору 48 мг ИМ-49 в 0,05М нат-рийкалиевого фосфатного буфера на физиологическом растворе (рН7,2) прибавляли раствор 10 мг БГА (Х-79, 633 мкг/мг) в том же буфере. Затем при охлаждении (4°С) и перемешивании прибавляли
Таблица 5. Построение калибровочной кривой и составление ее уравнения по МНК для определения Мw гель-фильтрацией на колонке (V, 151,8), заполненной сефадексом 0-150
№ Препараты Ve Выход, мг/мл РН ММ (КДл)
1 Голубой декстран 49,9
2 Ferritine 51,1 0,012 5,66 450
3 Katalase (bov) 62,7 0,125 5,38 240
4 IgG 66,0 0,16 5,21 160
5 БСА 83,8 0,33 4,82 67
6 OA 94,1 0,43 4,65 44
7 B12 147,0 0,89 3,13 1,35
8 ИМ-6 58,1 0,08 5,36 220
9 ГИМ-6 55,6 0,056 5,41 260
10 ГИМ- 6-БГА 51,8 0,019 5,53 340
11 БГА 64,0 0,138 5,26 180-190
12 ИМ-49 66,4 0,162 5,20 160
13 ИМ-50
14 ИМ-50-ГП (Х-79) 52,8 0,03 5,45 280
15 ИМ-50-БГА (HswNI) 57,0 0,07 5,38 240
16 ИМ-50-БГА (H3N2) 56,4 0,07 5,38 240
17 ИМ-49-БГА (Х-79) 59,2 0,091 5,34 200
18 ИМ-49-ИГА (Х-79) 54,8 0,048 5,42 250
19 ИМ-50-ГП (HswNI) 52,9 0,03 5,45 280
раствор 20 мг КАИ в ФБР. Через 24 часа реакционную смесь подвергали гель-фильтрации на колонке, заполненной сефадексом G-150 (Табл. 5 и 6). Элю-ат диализовали против воды в течение 48 часов и лиофилизировали. Выход коньюгата 35 мг. Количество белка, определенное по методу Лоури (39), 70 мкг/мг (38% по ГА).
В ИК-спектре коньюгата ИМ-49-БГА, также как и в спектре ГИМ-6-БГА, наблюдается полоса поглощения 1760 см-1 (С=0 3,4 - дигидропиранового цикла) и 1670-1690 см-1 (С=0 в винилпирролидоно-вом звене), причем происходит уменьшение с таковым в ИМ-49 от 9,2 до 5,6.
Пример. 5. 40 мг ИМ-49 в ФБР (рН 7,2) смешивали с 2,31 мг ИГА (весовое соотношение ИМ/белок -17:1) и добавляли при охлаждении и перемешивании 20 мг КАИ в том же буфере. Реакционную смесь инкубировали при +4°С в течение 24 часов и далее поступали так же, как при выделении других конь-югатов. На рисунке 2 приведены профили элюции коньюгата ИМ-49-ИГА. Выход 35 мг, содержащий 2,1 мг ИГА.
Пример 6. Следует отметить, что ИМ-50 содержит в своем составе малеимидные фрагменты для специфического одноточечного коньюгиро-вания с белком. Это позволяет уменьшить гетерогенность полимерной составляющей по химической природе и дает возможность избавиться от использования токсичных КАИ в синтезе искусственных антигенов. Поэтому для синтеза конъю-гата ИМ-50-БГА к раствору 50 мг ИМ-50, содержащего 25°% малеимидных фрагментов, в 1 мл АМФА был прибавлен при перемешивании и охлаждении (2-4°С) раствор 2,2 мг ГА, выделенного из штамма Х-79, в 2,5 мл 0,01 МФБР (рН 7,2). Исходное соотношение ИМ/белок ~ 2:3. Анализ реакционной смеси методом тонкослойной хроматографии показал, что по мере протекания реакции образуется продукт, обладающий голубой флуоресценцией и находящийся на старте пластинки Silufol. Это свидетельствует об образовании связи между малеимидным фрагментом и SН-группами (40).
Затем реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку, заполненную сефадек-сом G-150, Ve 56,4 мл (Табл. 5). Раствор коньюгата после колонки диализовали и сушили лиофильно. Выход коньюгата 43 мг.
Пример 7. К раствору 30 мг ИМ-50, содержащего 25% мол малеимидных фрагментов, в 2мл
Таблица 6. Обработка данных по гельхроматографии методом наименьших квадратов (МНК)
Кем = X 1дМ>^ = Y
№ п/п X У ХкУк Х*к
1 5,66 0,012 0,068 32,03
2 5,38 0,125 0,67 28,94
3 5,21 0,16 0,78 27,14
4 4,82 0,33 1,50 23,33
5 4,65 0,43 1,86 21,62
XY = 0.98 X = 5.15
X2 = 26.61 Y = 0.2
(X)2 = 26.52 XY = 1.03
а = 0.55 0.55x = 3.03 - y
АМФА был добавлен раствор лиофилизированных ГП, выделенных из штамма A/Swine/1976/ 31 и содержащих 4 мг белка, в 3 мл ФБР (рН 7,2).
После завершения реакции в обычных условиях и гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150, раствор лиофилизировали. При этом было получено 166 мг коньюгата, содержащего по данным метода Лоури 14 мкг белка на 1 мг коньюгата. Выход по белку 58%.
Пример 8. К раствору 100 мг ИМ-50, содержащего 18% мол. малеимидных фрагментов, прибавлен раствор 20 мг ГП, выделенных из штамма Х-79, при комнатной температуре. Через 1 час реакционная смесь была разделена с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150. Ve 52,8. Выход коньюгата 30 мг.
Пример 9. Раствор 50 мг ИМ-50, содержащего 18% мол. звеньев 7-(2-малеимидэтокси)-2-Н-1-бен-зопиран-2-она, и 6 мг ГА, выделенным из штамма А^ею/1976/31, в смеси АМФА-ФБР (1:3) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. После гель-фильтрации и лиофилизирования получено 220 мг коньюгата, содержащего 20 мкг белка в 1 мг.
Следует заметить, что все конюьгаты на основе ИМ-50 растворимы в водных растворах в отличие от самого ИМ-50. Аанные по содержанию белка в коньюгатах приведены в таблице 7.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В результате проведенных исследований разработана технология получения некоторых иммунобиологичес-
Таблица 7. Характеристика коньюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими иммуномодуляторами
Коньюгаты Данные Содержание белка в коньюгатах
ИК-спектров, По По По составу По данным
см 1 методу Лоури, % вес данным ОРИД, % вес исходных иммуномодуля-торов, % мол. ИК-спектров коньюгатов, % мол
ГИМ-6-БГА 1750-1760, 1690 11 4 20-25 18-20
ГИМ-6-ИГА 1750-1760, 1690 - 4 - 15-18
ИМ-49-БГА 1760, 1670-1690 7-8 - 8-15 8-11
ИМ-49-ИГА 1760, 1670-1690 6-7 - 8-15 -
ИМ-50-БГА - - 4-5 18 -
ИМ-50-ГП 1720-1780, 1660-1670, 1170, 1080 7-8 25
е™">г — — — - III •
0в -
• б
— а — • — ^ • •
1234 56 789 Рис. 1. Электрофорез В ПААГ в восстанавливающих условиях
1 - маркеры: а - каталаза, б - БСА, в - овальбумин, г - РНК-
аза; 2 - ГП, дезинтегрированные ЦТАБ-ом; 3 - ИГА после диализа и ультрацентрифугирования; 4 - БГА после диализа и ультрацентрифугирования; 5 - ИГА; 6 - БГА; 7 - конъюгат ГП с ИМ-22; 8 - конъюгат ИГА с ИМ-22; 9 - конъюгат БГА с ИМ-5
ких диагностических препаратов, в частности, моноспецифических диагностических сухих кроличьих сывороток к гемагглютинину ВГ. При этом обоснованы оригинальные приемы, использованные при выполнении указанных разработок, которые защищены многими авторскими свидетельствоми, патентами и освещены в печати в многочисленных публикациях. Эти приемы обеспечивают высокую эффективность полученных образцов гемагглютинина.
В итоге проведенных исследований были разработаны биотехнологические схемы получения целого ряда конъюгированных антигенов на основе синтетических иммуномодуляторов полимерного характера, определены условия конъюгирования гемагглютинина ВГ, различного происхождения с полимерными иммуномодуля-торами. Отработаны условия очистки полученных конъюгатов, определены физико-химические параметры, позволяющие охарактеризовать их структуры, химические и медико-биологические свойства. В итоге полученные иммуногены ха-
рактеризуются высокой степенью гомогенности, стабильности и стандартностью химического состава. Иммунизация животных разработанными иммуногенами позволяет получить высокоактивные моноспецифические диагностические нативные сыворотки, титры которых в РТГА с гомологичными штаммами вируса гриппа 1:1000 - 1:262000, а гетерологичными штаммами не более 1:320. После очистки с помощью ионообменной хроматографии получены антитела (иммуноглобулины), имеющие титры в РТГА с гомологичными штаммами вируса не менее 1:640 для Н3 N2 и не менее 1:320 для HSwN 1, с гетерологичными штаммами не более 1:10. Эти данные свидетельствуют о высокой степени очистки полученных антител. Последние служили сырьем для получения меченных флюоресцентными реагентами антител, необходимых для разработки иммунофлюоресцентного метода обнаружения вируса гриппа и количественного определения гемагглютинина в вакцинных препаратах. Полученные меченные антитела имеют титр в РТГА с гомологичными штаммами не менее 1:64, а с гетерологичными штаммами не более 1:10, интенсивно флюоресцируют при длинах волн X =340, Хэм =400 нм, что позволяет определить ге-магглютинин в вируссодержащих жидкостях до 10 нг/мл.
К настоящему времени на основе указанных разработок оформлены проекты следующих научно-технических нормативных документов: инструкции по изготовлению и контролю, экспериментально-производственный регламент, Фармокопейные статьи предприятия и инструкции по применению моноспецифических диагностических сухих кроличьих сывороток к гемаг-глютинину вируса гриппа и очищенных антител к гемагглютинину вируса гриппа, меченных новым флюоресцентным реагентом, синтезированным в НПК ХТЛП/СПб/НИИВС.
Таким образом, из всего изложенного выте-
Рис. 2. Профили элюции при гельфильтрации
а - конъюгат ГИМ-6-БГА (Н3Ы2) __ и ГИМ-6---- ; б - конъюгат ИМ-49-ИГА__и ИМ-49—
кает, что весьма важен и перспективен синтез и исследование коньюгированных антигенов, полученных на основе синтетических полимерных иммуномодуляторов, к которым ковалентно присоединены различные протективные антигены вируса гриппа, а также их уникальные молекулярные структуры (детерминантные группы), каждая из которых характерна для того или иного возбудителя инфекционной болезни. По-видимому, из нескольких таких фрагментов можно будет сконструировать определенные макромолекулы, которые являются синтетическим аналогом поливалентной вакцины, действующей сразу против нескольких инфекций.
Следовательно, открывается перспектива получения синтетических вакцин, содержащих искусственные антигенные детерминанты различных инфекционных болезней. Кроме того, преимущество синтетического подхода создания вакцин заключается еще в том, что получаемые препараты не содержат балластные белки, загрязняющие все без исключения, нынешние вакцины. Действительно, убитые микробы (или выделенные из них белки, полисахариды и др.) включают в себя очень много балластных белков и, очевидно, что последние обуславливают различные осложнения (например, аллергию) при вакцинации (12).
ЛИТЕРАТУРА
1. Абышев А.З. - В кн.: Акт. вопросы получения и использования биополимеров в биотехнологии. Деп. в ВИНИТИ., 1987, N.7033-8-87, с. 2-22; 2. Абышев А.З. - В кн.: Пробл. мед. иммунобиотехно-логии. Л., 1990, с. 99-102; 3. Абышев А.З., Нежинская Г.И., Егоров К.Н. - В кн.: Труды ЛСГМИ, Л, 1989, с. 12-16; 4. Абышев А.З., Агаев Э.М., Марищенко О.В., Абдулла-заде А.А. - Азерб. мед.Ж., 2002, N.1, с. 119-124; 5. Абышев А.З., Нежинская Г.И., Егоров К.Н., Денисенко П.П. - В кн.: Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Челябинск, 1988, с.69-70; 6. Абышев А.З., Эн-тина Н.Н., Колонтинская Т.М. и др. А.с. СССР N.1470061 (1987). 7. Абышев А.З., Энтина Н.Н., Сухинин В.П. и др. - В кн.: Труды ВНИИ гриппа. Л., 1989, с. 127-135; 8. Арбатский Н.М., Лихоше-рстов Л.М., Медведев С.А. и др. - Докл.АН СССР, 1983, N.5, с.1257-1260; 9. Иванов В.Т., Хаитов Р.М., Андронова Т.М. и др. -Иммунология, 1996, N.2, с.4-6; 10. Кабанов В.А., Евдаков В.П., Мустафаев М.И. и др. - Мол. биология, 1977, т.11, с. 582-597; 11. Кабанов В.А., Мустафаев М.И., Норимов А.Ш. и др. - Докл. АН СССР, 1978, N.5, с.1330-1333; 12. Кабанов В.А., Петров Р.В., Ха-
итов P.M. - Новое в жизни, науке, технике (серия химия), 1986, N.4, c.3-47; 13. Карпухин Г.И., Галитаров С.С. Профилактика гриппа. 2-е изд. перераб. и доп. Л.: Медицина, 1981; 14. Катаев В.А., Садыков Р.Ф., Халиуллин Ф.А. и др. - Хим.-фарм. Ж., 1996, N.7, с. 22-24; 15. Кондратенко И.В., Ярилин А.А., Хахалин Л.Н. -Иммунология, 1991, N.5, с.68-70; 16. Криворутченко Ю.Л., Криво-шеин Ю.С., Ажицкий Г.Ю. и др. - Микробиол. Ж., 1987, N.3, с. 72-75; 17. Наджитмитдинов А.М., Хаитов P.M., Норимов А.Ш. и др. - Ж. микробиол., 1979, N.9, с.14-18; 18. Нежинская Г.И., Егоров К.Н. Абышев А.З. - В кн.: Труды ВНИИ гриппа. Л., 1989, с. 136-140; 19. Петров В.В., Жданов В.М., Хаитов P.M. и др. - В кн.: Актуальн. проблемы мед. М., 1985, с.183-185; 20. Петров Р.В., Жданов В.М. Кабанов В.А. и др. - Иммунология, 1984, N.4, c.50-52; 21. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И. Иммуноге-нетика и исукусственные антигены. М.: Медицина, 1983; 22. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Норимов А.Ш. и др. - Докл. АН СССР, 1979, N.1, с.249-252; 23. Петров Р.В., Жданов В.М., Хаитов Р.М. и др. - Там же, 1984, N.3, с.720-722; 24. Петров Р.В., Жданов В.М., Кабанов В.А. и др. - Бюлл. эксперим. биол. и медицины, 1985, N.2, с.184-186; 25. Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Сунцова Н.С и др. - Хим.-фарм. Ж., 1997, N.2, с. 28-30; 26. Смородинцев А.А. - В кн.: Мат-лы 3-го сов.-франц. симпозимума. Л., 1980, с.66; 27. Чекановская Л.А., Сивук Н.Е., Козлов Р.И. и др. - Иммунология, 1991, N.5, с.44-46; 28. Черняк А.Я. - В кн.: Прогресс химии углеводов. М.:Наука, 1985, с.21-30; 29. Шилд Д., Вуд Д., Р. Ньюлеэн Р. - Бюлл. ВОЗ, 1976, N.2, р.220-228; 30. Энтина Н.Н., Абышев А.З., Сухинин В.П. и др. - В кн.: Акт. вопр. биотехнологии. М., 1987, с. 74-75; 31. Kanaoka M., Machida K., Ando T. -Secino Biochim. Biophis. Acta, 1970, v.207, p.269-277; 32. Lamly V.
- Nature, 1970, v,.227, p.680-685; 33. Lederer N.- In: Progr. Immunol. Eds. M. Fougerau, J. Deusset. NY-London: Acad. press., 1988, p. 1194-1211; 34. Lowry O., Rosebreugh H., Farr A., Raudall R. - J.Biol. Chem., 1951, v.193, p.265; 35. Moses E., Sela M., Chedid L. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p.4933-4937; 36. Sela M.
- Science, 1969, v. 166, p.1365-1374; 37. Sela M., Fuchs S. - In: Handbook of experimental immunology. Eds. D.Weir. OxfordLondon, 1973, v.1, p.1-10; 38. Sela M. - In: Antiviral mechanisms. Ed. M.Follard. NY: Acad. press, 1975, v.9. p.91-103; 39. Sela M. -Bipolymers, 1985, v.22, N.1, p.415-424; 40. Shekel J., Bayley P., Broun E. et al - Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, v.79, p.968-972.
SUMMARY
Conjugated antigens on the base of synthetic immunomodulators A.Abyshev, E.Agayev
In the article principles and methods of preparations of some novel immunobiological substances with different content and structure are inspected. The authors analyzed the possibility of these application for enchancing immunogeniticy of influenzavirus.
Поступила 30.10.2003
