CC BY
22
УДК 004.031.43 (004.451.7.031.43) + 612.014.421 + 577.352.52
П. Л. Александров, младший научный сотрудник,
О. В. Градов, младший научный сотрудник,
Институт энергетических проблем химической физики РАН, Москва
Конвенционные патч-кламп-автоматы с обратной связью для многофакторных лабораторий на чипе с использованием интерфейсов вычисительных машин реального времени
Ключевые слова: патч-кламп, ионные каналы, технология «SIMULINK REAL-TIME», лаборатория на чипе, машина реального времени, скрининг.
Keywords: patch-klamp, ionic channels, the SIMULINK REAL-TIME technology, laboratory on the chip, the car of real time, screening.
Необходимость одновременной регистрации множества каналов и синхронизации их корреляционной обработки в конвенционном патч-клампе на микроэлектродных матрицах или в лабораториях на чипах, содержащих множество точек сбора данных, для сопоставления с кинетическими процессами в моделях ионных каналов отдельных клеток приводит к мысли о невозможности адаптивного варьирования условий локальной фиксации потенциала на многоканальных устройствах без использования предобработки сигналов в реальном времени. Более того, целесообразность сопряжения прямой регистрации и прогонки моделей для кинетической идентификации процесса в патч-клампе реализуется только при их синхронизации. Нами предлагается система реального времени для подобных измерений.
Введение
Одной из наиболее весомых тенденций в технике и методологии локальной фиксации потенциала на клеточной мембране, общеизвестной как patch-clamp, является виртуализация каналов и синхронизация реального эксперимента с виртуальной прогонкой (симуляцией) процесса на ЭВМ. Если ранние техники 1980-х годов допускали только виртуализацию заземления или машинноопосредуемую стабилизацию уровня [1], то начиная с 2000-х годов просматривается тренд на совмещение динамической техники регистрации (dynamic clamp) одиночных
ионных каналов с их моделированием в режиме реального времени [2—4].
Создаваемые в ходе синхронных электрофизиологических и вычислительных экспериментов адекватные модели ионных каналов при различных воздействиях позволяют говорить о разработке на их основе «виртуальной реальности» для клинической нейрофизиологии, в рамках которой станет возможным моделировать состояния возбудимых клеточных мембранных структур под действием различных раздражителей [5] и, соответственно, изменять в эксперименте в режиме реального времени параметры воздействия, предсказывая наиболее вероятный, по данным предварительного моделирования, отклик. В ряде случаев виртуальный скрининг в совокупности с автоматизированным патч-кламп-регистрированием используют в целях изучения селективных ингибиторов ионных каналов [6] и других мембранно связываемых агентов, подробное рассмотрение которых в рамках ограниченного объема данной статьи не представляется возможным.
Однако для реализации скрининга и статистически репрезентативного анализа популяций клеток, как правило, используют массовые техники патч-клампа, такие как патч-кламп на планарных регистрирующих платформах (planar patch clamp) [7, 8] или же популяционный патч-кламп (population patch clamp) [9,10] в лабораториях на чипе и иных микрофлюидных устройствах [11]. В то же время сопряжение синхронного многоканального мониторинга с анализом в реальном времени при условии регистрации сомножества клеток-источников (т. е. множества регистрируемых ионных каналов), было проблематичным, в связи с чем в литературе фактиче-
биотехносфера
| № 3(333/2014
ски не было описано прецедентов построения установок регистрации с синхронной обработкой и численным моделированием для данного аддитивного метода (conventional patch-chlamp). Известные из литературы фармакологические подходы к скринингу в ходе патч-клампа (см., например, работы [12, 13]) являются качественными, призванными дать ответ на биомедицинский вопрос, но не предусматривающими аппроксимации форм сигнала с автоматическим фитированием в реальном времени. Результатом этого частью является то, что подходы к виртуализации нейрофизиологического патч-кламп-контроля вырождаются от создания виртуальной реальности с клеточно-машинным интерфейсом до чисто виртуального моделирования [14], отличающегося вычислительной сложностью, но не целью от тех методов ЭВМ-моделирования, которые применялись в 1970—1980-е годы [15, 16].
В связи с этим обнаруживается насущная потребность в создании платформ для анализа данных конвенционного патч-кламп-эксперимента в совокупности с симуляцией моделей в режиме реального времени. Ниже описывается ряд подходов к построению подобных установок как апробированных авторами на практике, так и подлежащих оптимизации в каждом отдельном случае в зависимости от аппаратной оснащенности лабораторий.
Методы и конструкция установки
Работая исходно на МАТЬАВ/ЗШиЬШК, мы обеспечивали регистрацию сигнала на аудиокарту с использованием специально разработанного блока-преобразователя. Модели ионных каналов, используемые для сопоставления с реально фиксируемой кинетикой, должны были работать в реальном вре-
Рис. 1
Упрощенная схема установки конвенционного патч-клампа с использованием машины реального времени (блоки преобразования опущены):
1 — лаборатория на чипе (PCLoC); 2 — микроскоп («Zeiss Axiomat»); 3 — машина реального времени; 4 — компьютер с предустановленной MATLAB + SIMULINK
мени. Было показано, что при наличии блока ввода с аудиовхода ^udio input) модель работает в реальном времени; в альтернативных типах регистрации, перехватывая прерывания от процессора, можно также достигнуть реального времени в Windows. Однако любая звуковая карта имеет ограниченное число каналов, что противоречит условию задачи о многоканальном съеме данных в конвенционных методах патч-клампа с мультипозиционных носителей (arrays и т. п.), поэтому нужна аппаратная реализация многоканального сбора данных с обработкой в реальном времени, независимо от звуковой карты или эмуляции аудиовхода.
Известна, однако, технология «SIMULINK REALTIME», базирующаяся на машинах типа «xPC TargetBox», подключаемых к Windows-терминалу, выполняющему функцию хост-машины с предустановленной конфигурацией MATLAB + SIMULINK (+ xPC Target) для управления актуаторами и обработки («post-processingo-а) данных, получаемых с сенсоров с интерфейсной коммутацией через модули аналого-цифрового преобразования к машине реального времени (real time target machine/ targetbox); причем на последней установлена собственная операционная система реального времени (RTOS) типа FreeDOS и xPC Target kernel, а также используются утилита передачи пакетов на уровне ядра и пакет драйверов xPC Target. Вследствие этого данная конфигурация позволяет получать максимальный эффект от прогонки экспериментов с получением и обработкой данных в реальном времени.
Предлагается использование данных возможностей для программно-аппаратной реализации многоканального конвенционного патч-клампа. Для этого каналы регистрации коммутируются через блоки преобразования на интерфейсы машины реального времени. Это не представляет существенной проблемы, но ее реализация варьируется в зависимости от целевого компьютера реального времени. Так, модель «Modular» в стандартной модификации имеет семь слотов для установки модулей ввода—вывода, в минимальной (small) модификации — шесть, а в расширенной (large) — 13. Выбор модификации диктуется потребностями в количестве модулей ввода—вывода, зависящими от номенклатуры лабораторий на чипе / электродных матриц, а соответственно, регистрируемых образцов. Кроме того, подключение модулей ввода—вывода общего назначения возможно через RS232/422/485 (до 115 кбит/с), обычно используемый для сопряжения хост-машины и целевого компьютера. Нами также была апробирована в качестве машины реального времени компактная модель «Mobile» c SPP/EP/ECP-IEEE1284 — параллельным портом, но она несколько уступает по производительности стационарной модификации и поэтому при массированной работе не рекомендуется к применению.
Для упрощения взаимодействия пользователей-биологов (не владеющих навыками изменения
№ 3(33)/2014 |
биотехносфера
функционала в MATLAB и SIMULINK и предпочитающих не разбираться в технологиях реального времени) с организацией сбора данных и машиной реального времени была создана программная оболочка — графический интерфейс пользователя, которая автономизирована с выводом GUI в независимое окно. Несмотря на то что полный объем программного обеспечения после этого возрастает на несколько сотен мегабайт по сравнению с размером файла псевдокода (за счет необходимости переносить на машину без предустановленного продукта MathWorks соответствующие библиотеки), удобство на стадии управления системой оператором, не владеющим принципами высокоуровневого программирования, перекрывает этот недостаток. Схема описанной сборки приведена на рис. 1.
Кластерный флуоресцентный контроль в режиме реального времени
Так как в процессе конвенционного патч-клампа под микроскопом необходимо знать о том, какие клетки являются источником сигнала, можно использовать флуоресцентные метки, эффективность высвечивания которых пропорциональна активности каналов. Нами была разработана система идентификации образов меченых клеток при патч-клампе под управлением одноплатного компьютера «Raspberry Pi» c операционной системой реального времени Windows CE на базе интерфейса прикладного программирования Win32 API при использовании динамически подключаемых библиотек. Впоследствии была осуществлена попытка «портирования» на Arduino; в частности, использовали таймер реального времени типа DS1307, использующий протокол 12С, с выходным каналом на 1 Гц. Однако в силу низкой производительности по сравнению с требуемой данный проект не был внедрен в лабораторную практику. В общем случае для пользователя флуоресцентный контроль за процессом выглядел так: система выделяла светящиеся клетки геометрической фигурой-меткой (маркером). Зная соответствие расположения меток на микроскопической картине с расположением сенсорных элементов в матрицах конвенционного патч-клампа, можно было реализо-вывать селективный выбор канала морфо-электро-физиологического анализа по автоматически детектируемым точкам светимости.
Преимуществом означенного подхода, помимо пользовательского удобства, является наличие обратной связи, позволяющей автоматически регулировать параметры установки в зависимости от состояния флуоресцирующих и дающих патч-кламп-сигнал клеток. Как следствие, возможна верификация системы не только фитингом к модели, прогоняемой с использованием некоторой машины реального времени, но и по флуоресцентному сигналу клеток; таким образом, реализуется кросс-
контроль процессов в патч-кламп-чипе. Так как зачастую предпочтение отдается комбинированию патч-клампа и оптических методов [17,18] (причем наиболее современным является флуоресцентный метод целевого поиска координат локальной фиксации потенциала микропипеткой [19]), использование на практике режима реального времени при синхронном оптическом детектировании и патч-клампе является более чем оправданным, поскольку задача создания оптического патч-клампа [20] при условии синхронизации оптической и электрофизиологической прогонки (патч-кламп) с виртуализацией может быть решена на практике только при использовании машин реального времени.
При использовании монтажа на основе «Raspberry Pi» можно создать обрабатывающий кластер на базе нескольких одноплатных компьютеров данного класса, который позволил бы одновременно обрабатывать данные со множества лабораторий на чипе и транслировать данную информацию по шинам на оконечное устройство (следует отметить, что наличие Ethernet и двух последовательных интерфейсов передачи данных в виде универсальных серийных шин USB 2.0 в В-версии платформы позволяет передавать данные в обе стороны в оптимальное для проведения измерений на клетках время, в том числе в ходе длительных мониторинговых экспериментов в удаленном доступе). Группа сопрягаемых при едином (синхронизируемом с вычислительной про-
б)
Рис. 2
Кластер «Raspberry Pi» с выведенными шинами (а) и возможная форма корпусной сборки усилителя биопотенциалов c АЦП, одноплатной ЭВМ типа «Raspberry Pi» и концентратора (б)
биотехносфера
| № 3(333/2014
гонкой) эксперименте платформ «Raspberry Pi» с выведенными шинами представлена на рис. 2, а, а корпусная гибридизация схемы усилителей и «Raspberry Pi» — на рис. 2, б.
Впоследствии нами были осуществлены НИОКР в области микроминиатюризации и эргономической оптимизации конструкции установки. В результате произведенных таким образом преобразований система получила модульный характер и возможность внешней синхронизации при подключении к кластеру, смонтированному из серверов в аппаратной стойке. Не считая выносной камеры, вся система была собрана в едином корпусе. В целях распределения вычислительных потоков при работе со множественными конвенционными чипами была смонтирована кластерная стойка с несколькими серверами, используемыми как хост-машины и системы расширенной математической обработки данных (вне режима реального времени). Следует отметить, однако, что сборка эквивалентной системы на одноплатных компьютерах без вышеизложенных технических решений невозможна, так как «Raspberry Pi» (равно как и «Arduino») не имеет встроенного таймера реального времени (RTC) на плате [21]. Модульная стандартизация при сборке подобных DIY-установок позволяет дифференцировать их по назначению без использования множественных дублируемых технологических узлов, что является весьма удобным для построения гибких экспериментальных программно-аппаратных комплексов реального времени.
Заключение
Таким образом, создана система, которая, в отличие от ранее известных разработок для патч-клампа в режиме реального времени на чипе, допускает не только регистрацию и скрининг [22] либо совместную оптическую и электрофизиологическую регистрацию [23], но и сопоставление с моделью SIMULINK с передачей данных регистрации и результатов моделирования как на хост-машину, так и по Ethernet.
Пользуясь случаем, выражаем благодарность студентам МФТИ и МГТУ им. Н. Э. Баумана за апробацию собранных установок и помощь в обеспечении работы систем на основе «Raspberry Pi», «Arduino» и «xPC TargetBox», а также нашим английским коллегам за любезное предоставление на временных условиях машин реального времени и лицензионного программного обеспечения.
Литература
1. Lopez-Barneo J., Matteson D. R., Armstrong C. M. Currents recorded through small areas of squid axon membrane with an internal virtual ground voltage clamp // Biophys. Journ. 1981. Vol. 36, N. 3. P. 811-815.
2. Dorval A. D., Christini D. J., White J. A. Real-Time linux dynamic clamp: a fast and flexible way to construct virtual ion channels in living cells // Ann. Biomed. Eng. 2001. Vol. 29. N. 10. P. 897-907.
3. Wheeler D. W., Kullmann P. H., Horn J. P. Estimating use-dependent synaptic gain in autonomic ganglia by computational simulation and dynamic-clamp analysis // Journ. Neu-rophysiol. 2004. Vol. 92. N. 5. P. 2659-2671.
4. Bettencourt J. C., Lillis K. P., Stupin L. R., White J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results // Journ. Neurosci. Meth. 2008. Vol. 169. N. 2, P. 282-289.
5. Economo M. N., Fernandez F. R., White J. A. Dynamic clamp: alteration of response properties and creation of virtual realities in neurophysiology // Journ. Neurosci. 2010. Vol. 30. N. 7. P. 2407-2413.
6. Wacker S. J., Jurkowski W., Simmons K. J. et. al. Identification of selective inhibitors of the potassium channel Kv1.1-1.2(3) by high-throughput virtual screening and automated patch clamp // Chem. Med. Chem. 2012. Vol. 7. N. 10. P. 17751783.
7. Trepakova E. S., Malik M. G., Imredy J. P. et. al. Application of PatchXpress planar patch clamp technology to the screening of new drug candidates for cardiac KCNQ1/KCNE1 (/ks) activity // Ass. Drug Dev. Techn. 2007. Vol. 5. N. 5. P. 617-627.
8. Farre C., Fertig N. HTS techniques for patch clamp-based ion channel screening-advances and economy // Exp. Opin. Drug Discov. 2012. Vol. 7. N. 6. P. 515-524.
9. Hollands E. C., Dale T. J., Baxter A. W. et. al. Population patch-clamp electrophysiology analysis of recombinant GABAa a1p3y2 channels expressed in HEK-293 cells / / Journ. Biomol. Screen. 2009. Vol. 14. N. 7. P. 769-780.
10. John V. H., Dale T. J., Hollands E. C. et. al. Novel 384-well population patch clamp electrophysiology assays for Ca2+-ac-tivated K+ channels // Journ. Biomol. Screen. 2007. Vol. 12. N. 1. P. 50-60.
11. Xu J., Guia A., Rothwarf D. et. al. A benchmark study with sealchip planar patch-clamp technology // Ass. Drug Dev. Technol. 2003. Vol. 1. N. 5. P. 675-684.
12. Schroder R. L., Friis S., Sunesen M. et. al. Automated patch-clamp technique: increased throughput in functional characterization and in pharmacological screening of small-conductance Ca2+ release-activated Ca2+ channels // Journ. Biomol. Screen. 2008. Vol. 13. N. 7. P. 638-647.
13. Asmild M., Oswald N., Krzywkowski K. M. et. al. Upscaling and automation of electrophysiology: toward high throughput screening in ion channel drug discovery // Recept. Channels. 2003. Vol. 9. N. 1. P. 49-58.
14. Tchaptchet A., Schneider H., Braun Y. F. Virtual neurophysi-ology laboratories for life science education: action potentials and voltage-patch-clamp recordings. BMC Neurosci. 2013. Vol. 14. Suppl. 1. P 381.
15. Moore J. W., RamYn F., Joyner R. W. Axon voltage-clamp simulations. I. Methods and tests // Biophys. Journ. 1975. Vol. 15. N. 1. P. 11-24.
16. Chay T. R. Kinetic modeling for the channel gating process from single channel patch clamp data // Journ. Theor. Biol. 1988. Vol. 132. N. 4. P. 449-468.
17. Augustine G. J. Combining patch-clamp and optical methods in brain slices // Journ. Neurosci Meth. 1994. Vol. 54. N. 2. P. 163-169.
18. Park M. K., Tepikin A. V., Petersen O. H. What can we learn about cell signalling by combining optical imaging and patch clamp techniques? // Pflugers Arch.: Eur. Journ. Physiol. 2002. Vol. 444. N. 3. P. 305-316.
19. Ishikawa D., Takahashi N., Sasaki T. et. al. Fluorescent pipettes for optically targeted patch-clamp recordings // Neur. Net. 2010. Vol. 23. N. 6. P. 669-672.
№ 3(33)/2014 I
биотехносфера
20. Demuro A., Parker I. «Optical patch-clamping»: single-channel recording by imaging Ca2+ flux through individual muscle acetylcholine receptor channels // Journ. Gen. Physiol. 2005. Vol. 126. N. 3. P. 179-192.
21. Bell S. Beginning Sensor Networks with Arduino and Raspberry Pi. New York: Springer Sci. + Bus. Media-Apress Media (California). 2013. 345 p.
22. Pathak P., Zhao H., Gong Z. et. al. Real-time monitoring
of cell viability using direct electrical measurement with a patch-clamp microchip // Biomed. Microdevices. 2011. Vol. 13. N. 5. P. 949-953.
23. Blunck R., Starace D. M., Correa A. M. et. al. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells // Biophys. Journ. 2004. Vol. 86. N. 6. P. 3966-3980.
УДК 616-073.75:681.32
A. Ю. Грязнов, д-р техн. наук, профессор, К. К. Жамова, аспирант,
B. Б. Бессонов, ассистент, А. О. Лившиц, ассистентка, Е. С. Кунашик, ассистентка,
ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет „ЛЭТИ" им. В. И. Ульянова (Ленина)»
Методика получения псевдоцветных рентгеновских изображений в двухэнергетичной рентгенографии
Ключевые слова: псевдоцветное изображение, цветовое пространство, рентгеновские снимки. Keywords: pseudo-color image, color space, x-ray image.
Рассмотрен метод формирования псевдоцветных рентгеновских изображений. Показано, что использование двухэнергетичной съемки позволяет значительно облегчить работу врача-рентгенолога и повысить информативность снимков, что дает возможность их анализа со значительно меньшей вероятностью ошибок.
Введение
Как известно, рентгеновская съемка представляет собой процесс получения теневого изображения, формирующегося при прохождении потока рентгеновского излучения через неоднородный объект. Приемник рентгеновского излучения визуализирует информацию, представляя полученное изображение в градациях серого цвета.
Как известно, метод двухэнергетичной рентгенографии может быть реализован одним из двух способов:
• производятся две экспозиции одного и того же объекта при различных режимах работы источника рентгеновского излучения — с более «жестким» и более «мягким» спектральным составом, и по-
лученные одно за другим изображения передаются с одного приемника (например, с рентгеночув-ствительной ПЗС-матрицы) для последующей обработки;
• производится одна экспозиция исследуемого объекта, но используется двухслойный цифровой приемник излучения, верхний слой которого регистрирует «мягкую» составляющую спектра, нижний — более «жесткую», и оба полученных снимка также используются для формирования псевдоцветного изображения [1].
Псевдоцветное изображение формируется на основе единого цветового пространства [2], в котором представлен диапазон видимых цветов, характерный для среднестатистического человека. На рис. 1 (также см. обложку с. 3) приведен так называемый цветовой треугольник в координатах xy и выделена та его часть, которая воспроизводится цветными мониторами.
Набор основных цветов можно представить в модели XYZ, где параметры X, У и Z представляют каждый основной цвет, требуемый для получения выбранного цвета. Таким образом, в трехмерном пространстве цветов XYZ любой цвет С(Х) представляется как
С(А) = (Х,Y,Z).
биотехносфера
| № 3(33)/20l4
