CC BY
64
УДК 616.3
КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦИСТАТИНА С В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПЕЧЕНИ И ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С
Наталья Борисовна ВОЛОШИНА1, Татьяна Григорьевна ФИЛАТОВА2, Валентина Сергеевна КРАПИВКИНА2, 3, Юлия Валерьевна ЮЗЬКО2, Татьяна Александровна КОРОЛЕНКО2
1ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52
2ГУ НИИ физиологии СО РАМН,
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
3МУЗ городская клиническая больница № 7 630005, г. Новосибирск, ул. Ольги Жилиной, 90 а
Цистатин С — негликозилированный катионный белок с молекулярной массой 13,3 кДа, принадлежащий к суперсемейству цистатина, основная функция которого заключается в регуляции активности цистеиновых протеаз. Обнаружено достоверное повышение концентрации цистатина С в сыворотке крови у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (неалкогольным стеатозом и стеатогепатитом) и хроническим гепатитом С по сравнению с практически здоровыми донорами, что, по-видимому, является отражением повышенной секреции цистатина С стимулированными макрофагами. Достоверных различий в концентрации цистатина С у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени и хроническим гепатитом С не выявлено, что, вероятно, обусловлено единством патогенетической роли ингибитора протеаз в развитии воспаления.
Ключевые слова: цистатин С, неалкогольный стеатоз и стеатогепатит.
Морфологические изменения печени в виде стеатоза у пациентов, употребляющих большое количество алкоголя, описаны в середине прошлого столетия. В 1957 году Н. Thaler выявил стеатоз печени у больных сахарным диабетом, не употребляющих алкогольные напитки [1]. В 1980 году J. Ludwig предложил использовать термины «неалкогольный стеатоз» и «неалкогольный стеатогепатит» для того, чтобы подчеркнуть отсутствие связи наличия патологии печени и приема алкоголя [2]. Патогенез первичной неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) до конца не изучен; согласно современным представлениям о НАЖБП, включающей в себя стеатоз печени, неалкогольный стеато-гепатит (НАСГ), фиброз и цирроз печени, он связан с инсулинорезистентностью, которая является важной составляющей метаболического синдрома. В качестве современной модели патогенеза НАЖБП предложена теория «двух ударов», или этапов: инсулинорезистентность—пер-вый удар, приводящий к развитию стеатоза печени; второй удар — в виде окислительного стресса—ответственен за стеатогепатит [3].
НАСГ часто протекает «субклинически», не имеет четкой клинической картины, диагностируется после «случайного» обнаруже-
ния повышения активности аминотрансфераз сыворотки крови и исключения других заболеваний печени [4—6]. Однако несмотря на латентное течение НАСГ, маску «безобидного» заболевания, известно, что до 25% случаев криптогенного цирроза печени обусловлены стеатогепатитом [6]. Согласно исследованию А. Propst и соавт. 1995 года, ожидаемая продолжительность жизни у больных НАСГ не ниже, чем у здоровых лиц соответствующего возраста и пола [7]. Показано, что приблизительно у 50% больных НАСГ развивается фиброз печени и почти у 17% — цирроз печени [8].
В настоящее время не выявлены клинические, лабораторные, морфологические критерии, позволяющие прогнозировать течение НАСГ, выявлять пациентов с прогрессирующем течением заболевания. Подтверждением диагноза НАЖБП может служить пункционная биопсия печени, которая позволяет определить стадию развития заболевания, выявить наличие фиброза и цирроза печени. Тем не менее динамическое наблюдение за фиброзом с помощью биопсии затруднено ввиду ее инвазивности, ограничений, связанных с наличием у пациентов противопоказаний для проведения процедуры, зависимости от квалификации мор-
Волошина Н.Б. — д.м.н, проф. каф. пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, e-mail: navo@ngs.ru Филатова Т.Г. — зав. клинической лаборатории
Крапивкина B.C. — врач-терапевт, МУЗ ГКБ №7; аспирант, ГУ НИИ физиологии СО РАМН Юзько Ю.В. — канд.м.н., н.с. лаб. клеточной биохимии и физиологии Короленко Т.А. — д.м.н., проф., зав. лаб. клеточной биохимии и физиологии
фолога. В связи с этим все большее значение приобретает поиск неинвазивных маркеров развития фиброза печени [9, 10].
Из прямых методов оценки плотности печени наибольшее распространение получила ультразвуковая эластография печени (УЭП) с помощью аппарата FibrosScan (EchoSens, Франция), однако этот метод обладает низкой чувствительностью в разграничении стадий фиброза, особенно в верификации минимального фиброза [11].
Среди сывороточных маркеров фиброза рассматриваются матриксные металлопротеазы-1, -2, -9 и их эндогенные ингибиторы—тканевые ингибиторы металлопротеаз (TIMP-1, TIMP-2), коллаген I, IV и VI типов, гиалуро-новая кислота, а2-макроглобулин, ингибиторы цистеиновых протеаз, росттрансформирующий фактор р (TGF-в), простагландин F (PGF), а также лизосомные ферменты сыворотки крови [10, 12]. Особое внимание привлекает новая, относительно недавно открытая группа эндогенных ингибиторов цистеиновых протеаз — цистатины [13—18].
Цель исследования. Изучение концентрации ингибитора цистеиновых протеаз—цистатина С— в сыворотке крови у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (стеатозом, сте-атогепатитом) и хроническим гепатитом С.
Материалы и методы
Концентрация цистатина С определена у 39 пациентов с НАЖБП (29 пациентов с неалкогольным стеатозом печени, средний возраст 59,6 ± 1,8 лет, и 10 пациентов с неалкогольным стеатогепатитом, средний возраст
56,5 ± 5,4 лет) и у 11 человек с хроническим гепатитом С (средний возраст 52 ± 6,3 лет). У 8 больных НАЖБП при ультразвуковом исследовании выявлены признаки, характерные для фиброза печени, у 3 из них фиброз печени подтвержден при пункционной биопсии печени. Контрольная группа состояла из 17 практически здоровых доноров. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинкской Декларации (2000 г.).
Всем больным произведено тщательное обследование для исключения других причин поражения печени — аутоиммунного гепатита, хронических холестатических заболеваний печени и пр.
Диагноз хронический гепатит с подтвержден на основании данных иммунофермент-ного анализа (ИФА) с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявле-
нием РНК вируса гепатита с методом полимеразной цепной реакции, в 3 случаях — при пункционной биопсии печени.
Активность аланиновой аминотрансфе-разы (АЛТ) и аспарагиновой аминотрансфе-разы (АСТ) определяли с помощью наборов ЗАО «Вектор-Бест» колориметрическим дини-трофенилгидразиновым методом по Райтману, Френкелю; содержание общего билирубина — с использованием модифицированного метода Йендрашека — Грофа. Активность щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтранспептидаза — с использованием наборов ЗАО «Вектор-Бест» кинетическим методом (спектрофотометр с проточной кюветой РМ-760, Германия).
Концентрацию цистатина С в сыворотке крови определяли методом ИФА с использованием коммерческих наборов Biovendor (Чехия) для количественного определения цистатина С человека. Экстинкцию образцов оценивали с помощью планшетного ридера (MULTISKAN EX Thermo Electron Corp., Финляндия) при 450 нм. Результаты представляли в виде общей концентрации циста-тина С в расчете на 1 мл биологического образца (нг/мл).
Индекс инсулинорезистентности рассчитывали по формуле НОМА IR: (концентрация инсулина мкЕД/мл * концентрация глюкозы ммоль/л):22,5. Значение больше 2,27 рассматривалось как наличие инсулинорези-стентности [19].
Диагноз НАЖБП подтвержден ультразвуковым исследованием печени. При ультразвуковом исследовании помимо стеатоза у 9 пациентов обнаружена умеренная гепато-мегалия (не более 2 см).
У всех пациентов НАЖБП диагностирован метаболический синдром согласно критериям, рекомендованным экспертами Национального института здоровья США (ATPin / NCEP 2001) [20]. У всех больных выявлен абдоминальный тип ожирения. Избыточная масса тела верифицирована у 19 человек (индекс массы тела ИМТ
28,5 ± 0,68 баллов); у 5 пациентов выявлено ожирение 1 степени (ИМТ 32,9 ± 0,45 баллов), у 8 — 2 степени (ИМТ 37,9 ± 0,9 баллов), у 7 — 3—4 степени (ИМТ 48,1 ± 1,9 баллов).
Уровень гликемии натощак у 29 пациентов не превышал 6 ммоль/л (4,8 ± 0,1 ммоль/л), у 10 человек уровень сахара в крови был несколько повышен (6,6 ± 0,2 ммоль/л). Средние показатели содержания инсулина натощак (норма 4—25 мкЕД/мл) составили 14,7 ± 6,08 мкЕД/мл, у 1 пациента уровень инсулина был повышен
(55,0 мкЕД/мл) и у 1 — снижен (1,8 мкЕД/мл). Значение НОМА IR были повышены у 18 человек, составив в среднем 4,1 ± 0,3, у 11 не превышали нормальных величин (1,7 ± 0,2).
Средние показатели систолического артериального давления составили 150,6 ± 3,9 мм рт. ст., диастолического — 92,0 ± 1,8 мм рт. ст.
Синдром цитолиза выявлен у 10 человек с НАЖБП (активность ферментов цитолиза не выше 3 норм): активность АЛТ у них в среднем составила 1,13 ± 0,12 мкмоль/л (норма 0,1—0,68 мкмоль/л), АСТ — 0,77 ± 0,05 мкмоль/л (норма 0,1—0,45 мкмоль/л), то есть имелись признаки стеатогепатита. Маркеры холестаза—активность щелочной фосфатазы (норма 70—200 ЕД/л) и гамма-глутамилтранспептидазы (норма 0,25—1,77 ЕД/л) были незначительно повышены соответственно у 7 (243,6 ± 36,8 ЕД/л) и у 3 человек (13,1 ± 1,9 ЕД/л).
Активность АЛТ в сыворотке крови у 8 больных хроническим вирусным гепатитом с была повышена (1,08 ± 0,40 мкмоль/л), у 3 пациентов — не изменена (0,45 ± 0,15 мкмоль/л).
Статистическая обработка материала производилась при помощи пакета программ SPSS 11,5. Вычисляли среднее арифметическое значение M, ошибку среднего арифметического m (результаты представлены в виде M ± m), коэффициент корреляции Спирмена, 95%-й доверительный интервал (95% CI).
Результаты исследования. Выявлена прямая достоверная корреляционная зависимость концентрации цистатина С в сыворотке крови от наличия у пациентов НАЖБП (коэффициент корреляции Пирсона r = 0,554; р = 0,0001). У больных со стеатозом печени и стеатогепа-титом концентрация цистатина С в сыворотке крови достоверно выше, чем у практически здоровых доноров. Так, у пациентов со стеа-тозом печени концентрация цистатина с сыворотки крови составила 1728,9 ± 118,3 нг/мл, в то время как у доноров — 1000,0 ± 125,6 нг/мл (95% CI 361,7-1096,2; p = 0,0001). Подобная закономерность прослежена и у пациентов со стеатогепатитом, концентрация цистатина С
у которых составила 1553,0 ± 147,1 нг/мл (95% С1 147,1-963,0; р = 0,01) (табл.). Методом логистического регрессионного анализа определен высокий шанс повышения концентрации цистатина с в сыворотке крови у пациентов НАЖБП (отношение шансов OR 15,5; 95% С1 3,6-66,5; х2 = 13,7; р = 0,00001).
Обнаружена прямая достоверная корреляционная зависимость концентрации цистатина С в сыворотке крови от наличия у пациентов с НАЖБП фиброза печени (коэффициент корреляции Пирсона г = 0,338; р = 0,015). У пациентов с признаками фиброза печени концентрация цистатина с сыворотки крови была достоверно выше, чем у больных без фиброза, соответственно 2134,4 ± 204,3 и 1567,6 ± 99,3 нг/мл (95% С1 64,2-1069,3; р = 0,03)
Подобные закономерности получены при исследовании концентрации цистатина С у пациентов с хроническим гепатитом С. Обнаружено повышение содержания цистатина С в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С по сравнению с донорами, соответственно 1914,5 ± 309,9 и 1000,0 ± 125,6 нг/мл (95% С1 194,0-1635,1; р = 0,004). Отмечена прямая достоверная корреляционная зависимость между повышенной концентрацией цистатина С в сыворотке крови и наличием у них хронического гепатита С (коэффициент корреляции Пирсона г = 0,815; р = 0,001).
Сопоставление концентрации цистатина С в сыворотке крови у пациентов НАЖБП и хроническим гепатитом С не выявило достоверных отличий (р = 0,345).
Известно, что функция цистатина С, низкомолекулярного белка, обнаруженного в различных типах клеток (макрофагах, гепатоцитах и пр.), заключается в регуляции активности цистеиновых протеаз — катепсинов В, L, Н, S и К, ответственных за обеспечение защиты клеток и тканей от повреждающего действия лизосомных протеаз. Лизосомные протеазы освобождаются во внешнюю среду при гибели клеток или при секреции опухолевыми клетками в процессе инвазии опухолей [17].
Таблица
Концентрация цистатина С в сыворотке крови у больных НАЖБП, хроническим гепатитом С и доноров
Группы обследованных пациентов Концентрация цистатина С (нг/мл) 95 % а p (сравнение с группой доноров)
Доноры (n = 17) 1000,0±125,6
Стеатоз печени (n = 29) 1728,9±118,3 361,7-1096,2 0,0001
Стеатогепатит (n = 10) 1553,0±147,1 147,1-963,0 0,01
Хронический гепатит С (n = 11) 1914,5±309,9 194,0-1635,1 0,004
Биологическая роль цистатинов в патологии печени изучена недостаточно [17, 21-23]. Согласно гипотезе, нарушения соотношения «протеазы и их ингибиторы» и следующий за этим неконтролируемый протеолиз наблюдаются при ряде поражений печени, при гепатитах В и С человека, а также в эксперименте у животных с токсическим гепатитом. Выявлено повышение концентрации цистатина С в сыворотке крови больных с гепатитами В и С, более значительное при развитии фиброза печени, что позволяет рассматривать показатель среди возможных неинвазивных сывороточных маркеров фиброза, связанных с функционированием клеток соединительной ткани [18].
Основным местом катаболизма белка и действия цистатина с являются почки, так как более 99% белков выводится из циркуляции при гломерулярной ультрафильтрации и реабсорбции в трубочках. Интенсивно изучается диагностическая роль цистатина С как раннего показателя нарушения функции почек. Определение концентрации цистатина С в сыворотке крови предлагается в качестве более надежного критерия при выявлении нарушений клубочковой фильтрации при различных заболеваниях почек (отмечены преимущества по сравнению с оценкой по уровню креатинина). У всех пациентов обследованной группы с НАЖБП и ХВГ с биохимических и клинических признаков почечной недостаточности не было, уровень креатинина сыворотки крови был в пределах нормы.
Выявленное нами повышение концентрации цистатина С в сыворотке крови у больных НАЖБП по сравнению с практически здоровыми донорами отражает участие этого ингибитора цистеиновых протеаз в процессе воспаления в печени, что, по-видимому, является отражением повышенной секреции цистатина с стимулированными макрофагами. Отсутствие достоверных различий в концентрации цистатина С у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени и хроническим гепатитом С, вероятно, обусловлено единством патогенетической роли ингибитора протеаз в развитии воспалительных процессов в печени и не позволяет провести дифференциальную диагностику между этими заболеваниями. Представляется перспективным дальнейшее исследование концентрации цистатина С у пациентов с НАЖБП в различные стадии ее развития (стадии фиброза и цирроза печени).
Литература
1. Thaler H. Leberkrankheiten: Histologie; Klinik. Berlin; Heidelberg; N. Y.: Springer-Verlag, 1982. 456 s.
2. Ludwig J., Viggiano T.R., McGill D.B., Oh B.J. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease // Mayo Clin. Proc. 1980. 55. 434-438.
3. Perez-Fguilar F. Ethiopathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis // Gastroenterol. Hepatol. 2005. 28. (7). 396-406.
4. Bloomgarden Z.T. Insulin resistance syndrome and nonalcoholic fatty liver disease // Diabetes Care. 2005. 28. 1518-1523.
5. де Мура М.К Неалкогольный стеатогепатит // Клин. перспект. гастроэнтерол., гепатол. 2001. (3). 12-16.
de Mura M.K. Nonalcoholic steatohepatitis// Klin. perstpekt. gastroenterol., hepatol. 2001. (3). 12-16.
6. Yu A.S., Keeffe E.B. Nonalcoholic fatty liver disease // Rev. Gastroenterol. Disord. 2002. 2. (1). 11-19.
7. Propts A., Propts T. Judmaier G., Vogel W. Prognosis in nonalcoholic steatohepatitis // Gastroenterology. 1995. 108. 1607-1615.
8. Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит // Болезни органов пищеварения. 2000. (2). 41-45.
Ivashkin V.T., Shulpekova Y.O. Nonalcoholic steatohepatitis // Bolezni organov pishchevariniya. 2000. (2). 41-45.
9. Takahata T. et al. Cotreatment with interferon-alpha and -gamma reduces liver fibrosis in a rat model // Hepatol. Res. 2004. 28. (3). 146-154.
10. Leroy V., Monier F., Bottari S. et al. Circulating matrix metalloproteinases 1, 2, 9 and their inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 as serum markers of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C: comparison with PIIINP and hyaluronic acid // Am. J. Gastroenterol.
2004. 99. 271-279.
11. Павлов Ч.С., Ондос Ш.А., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Эластометрия в оценке динамики фиброза печени у больных хроническим гепатитом С, леченным пег-интерфероном альфа и рибавири-ном // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрок-тол. 2008. 18А. 127.
Pavlov Ch.S., Ondos Sh.A., Glushenkov D.V., Ivashkin V.T. Elastography in the evaluation of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C cotreatment with peg-interferon-alpha and ribavirin // Ros. zhurn. gastroenterol., gepatol., koloproctol. 2008. 18А. 127.
12. Forns X., Bataller R. Can we indentify liver fibrosis in HCV-infected patients without a liver biopsy? // Curr. Hepatitis Rep. 2003. 2. 146-154.
13. Keppler D. Towards novel anti-cancer strategies based on cystatin functions // Cancer Lett. 2006. 235. 159-176.
14. Turk B., Turk D., Salvesen G.S. Regulating cysteine protease activity: essential role of protease inhibitors as guardians and regulators // Curr. Pharm. Des. 2002. 8. 1623-1637.
15. Shi G.-P., Sukhova G.K., Grubb A. et al. Cystatin C deficiency in human atherosclerosis and aortic aneurysms // J. Clin. Invest. 1999. 104. (9). 1191-1197.
16. Stoka V., Turk B., Turk V. Lysosomal cysteine proteases: structural features and their role in apoptosis // Life. 2005. Vol. 57 (4/5). P. 347-353.
17. Короленко Т.А., Филатова Т.Г., Черканова М.С. и др. Цистатины: регуляция цистеиновых протеаз и нарушения при опухолевых и воспалительных заболеваниях // Биомед. химия. 2008. 54/2. 210-217.
Korolenko Т.А., Filatova T.G., Cherkanova M.S. et al. Cystatins: cysteine proteases regulation and disturbances in tumors and inflammation // Biomed. khimiya. 2008. 54/2. 210-217.
18. Юзько Ю.В. Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим гепатитом С: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Новосибирск, 2007.
Yuzko Y.V. Changes of different proteases classes and inhibitors proteases as a fibrosis seromarker of chronic HCV: Avtoreferat, thesis, Candidate of Medical Science. Novosibirsk, 2007.
19. Matthews D.R., Hosker J.P., Rudenski A.S. et al. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man // Diabetologia. 1985. 28. 412-419.
20. Executive summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) // JAMA. 2001. 285. (19). 2486-2497
21. Abrahamson M., Alvares-Fernandez M., Nathan-son C.-M. Cystatins // Biochem. Soc. Symp. 2003. 70. 179-199.
22. Filler G., Bokenkamp A., Hofmann W. et al. Cystatin C as a marker of CFR — history, indications, and future research // Clin. Biochem. 2006. 38. 1-8.
23. Sarnak M.J., Katz, R., Stehman-Breen C. et al. Cystatin C concentration as a risk factor for heart failure in older adults // Ann. Intern. Ned.
2005. 142. 497-505.
CYSTATIN C CONCENTRATION IN SERUM OF PATIENTS WITH NONALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
Natalia Borisovna VOLOSHINA1, Tatyana Grigorjevna FILATOVA2, Valentina Sergeevna KRAPIVKINA2,3, Julia Valerevna YUZKO2, Tatyana Aleksandrovna KOROLENKO2
1Novosibirsk State Medical University 52, Krasniy prospect, Novosibirsk, 630091
2Research Institute for physiology SB RAMS
4, Timakov str., Novosibirsk, 630117
3Municipal Health Care Institution City Clinical Hospital № 7 90 а, Ol'ga Zhilina str., Novosibirsk, 630005
Cystatin C is endogenous cysteine protease inhibitor belonging to cystatin family, playing the important role in regulation of cysteine protease activity (cathepsins B, L, H, S). Serum cystatin C concentration was measured by ELISA kits for human cystatin C (Biovendor, Czechia) in patients with non-alcoholic steatosis and steatohepatitis (NASH). Comparatively to data obtained in healthy donors increased serum cystatin C level was registered in patients with NASH as result of inflammation and macrophage stimulation.
Keywords: cystatin C , non-alcoholic steatosis and steatohepatiti.
Voloshina N.B. — Doctor of Medical Science, prof., Novosibirsk State Medical University Filatova T.G. — Head Lab Cell Biochem
Krapivkina V.S. — internist, Municipal Health Care Institution of City clinical Hospital № 7; postgraduate student, State Institute of Physiology Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences
Yuzko Ju.V. — resident, State Institute of Physiology Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences Korolenko T.A. — Doctor of Medical Science, prof., Head Lab Cell Biochemistry and Physiology, State Institute of Physiology Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences
