CC BY
19
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 504.064.36:574:574.635
КОНЦЕНТРАЦИЯ ИЛИ ДОЗА ТОКСИКАНТА В БИОТЕСТИРОВАНИИ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
1 2 Валентина Ивановна Ипатова , Анна Максимовна Лазарева
1 2
' Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра общей экологии и гидробиологии Автор, ответственный за переписку: Валентина Ивановна Ипатова, viipatova@ hotmail.com
Аннотация. Исследовано влияние солей тяжелого металла хрома и легкого металла алюминия при разных режимах токсической экспозиции для тест-объектов - культур пресноводной зеленой микроводоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. и морской диатомовой микроводоросли Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell et Hastie. С помощью экспериментальной модели проанализировано выживание культур в экстремальных условиях среды при изменении начальной плотности популяции, возраста культуры на момент добавки токсиканта в растущую культуру, концентрации токсикантов в среде и дозы на одну клетку. Показано, что периодическое добавление хрома в течение эксперимента в условиях сохранения его постоянной дозы мало меняет картину развития токсического эффекта во времени по сравнению с традиционно принятой однократной добавкой токсиканта в начале опыта. Установлено, что с увеличением срока добавления алюминия в растущую культуру, совпадающего с ее возрастом, токсичность падает. Для проведения процедуры биотестирования необходимо брать молодую 5-7-суточную тест-культуру, находящуюся на логарифмической стадии роста, а в случае зрелой (14-суточной) и старой (28-су-точной) культуры можно существенно недооценить токсичность тестируемого вещества. С увеличением начальной плотности популяции от 25 тыс. кл./мл до 1-2 млн кл./мл токсичность солей металлов снижается. Начальная плотность популяции 25 тыс. кл./мл при проведении биотестирования позволяет более адекватно оценивать токсичность исследуемых веществ.
Ключевые слова: биотестирование, Scenedesmus quadricauda, Thalassiosira weissflogii, начальная плотность популяции, возраст культуры, бихромат калия, хлорид алюминия, токсичность, концентрация, доза
Финансирование. Работа выполнена в рамках Государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова (тема № 121032300131-9) при поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы МГУ имени М.В. Ломоносова «Будущее планеты и глобальные изменения окружающей среды».
Для цитирования: Ипатова В.И., Лазарева А.М. Концентрация или доза токсиканта в биотестировании с использованием микроводорослей // Бюл. МОИП. Отд. биол. 2022. Т. 127. Вып. 5. С. 54-65.
© Ипатова В.И., Лазарева А.М., 2022
ORIGINAL ARTICLE
CONCENTRATION OR DOSE OF TOXICANT IN BIOASSAY USING MICROALGAE
1 2 Valentina I. Ipatova , Anna M. Lazareva
1 2
' Biology Faculty of Lomonosov Moscow State University Corresponding author: Valentina I. Ipatova, viipatova@hotmail.com
Abstract. The effect of salts of heavy chromium metal and light aluminum metal was studied under different modes of toxic exposure for test objects - cultures of the freshwater green microalgae Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. and marine diatom microalgae Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell et Hastle. An experimental model was used to analyze the survival of cultures under extreme environmental conditions with a change in the initial density of the population, the age of the culture at the time of the toxicant addition to the growing culture, the concentration of toxicants in the medium, and the dose per cell. It has been shown that the periodic addition of chromium during the experiment, while maintaining its constant dose, the toxic effect changes little of over time compared to the traditionally accepted single addition of the toxicant at the beginning of the experiment. It has been established that with an increase in time of adding aluminum to a growing culture, which corresponds to the age of the culture, its toxicity decreases. To carry out the bioassay procedure, it is necessary to take a young 5-7 day old test culture that is at the logarithmic stage of growth, and a mature 14-day and old 28-day culture can significantly underestimate the toxicity of the test substance. With an increase in the initial density of the population from 25 thousand cells/ml to 1-2 million cells/ml, the toxicity of metal salts decreased. The initial population density of 25 thousand cells/ml, during bioassay, allows a more adequate assessment of the toxicity of the substances.
Keywords: bioassay, Scenedesmus quadricauda, Thalassiosira weissflogii, initial population density, culture age, potassium dichromate, aluminum chloride, toxicity, concentration, dose
Financial Support. This study was performed under the state assignment of Moscow State University, project number 121032300131-9 and funded by Russian the Interdisciplinary Scientific and Educational School of Moscow State University «The future of the planet and global environmental change».
For citation: Ipatova V.I., Lazareva A.M. Concentration or dose of toxicant in bioassay using microalgae // Byul. MOIP. Otd. biol. 2022. T. 127. Vyp. 5. S. 54-65.
Метод биотестирования широко используется в мировой практике для оценки качества природной водной среды, токсичности сточных вод предприятий, загрязняющих веществ и материалов разной природы, почвы, донного грунта. Такую оценку с применением микроводорослей в качестве тест-объектов проводят в стандартных лабораторных условиях с рекомендуемыми составом питательной среды, температурой, освещенностью, начальной плотностью популяции клеток и однократной добавкой токсиканта в день постановки опыта в исследуемом диапазоне концентрации.
Культуры пресноводных зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda, Chlorella
vulgaris, Selenastrum capricornutum и морских диатомовых микроводорослей Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira weissflogii являются чувствительными тест-объектами и отвечают необходимым требованиям, предъявляемым к ним при проведении процедуры биотестирования (Терехова и др., 2014, 2017; Филенко и др., 2015).
При токсическом воздействии в процессе роста лабораторной популяции микроводорослей происходит изменение численности клеток; изменение дозы токсиканта, приходящейся на одну клетку водоросли; одновременно меняется и концентрация токсиканта вследствие его накопления клетками, а также в результате раз-
личных его превращений при повышении рН и уровня метаболитов в культуральной среде.
Внешние условия и экспериментальные факторы, такие как исходная плотность популяции (количество начального инокулята) и доза токсиканта на одну клетку в процессе роста культуры, также должны приниматься в расчет при проведении биотестирования и оценке полученного результата. В процессе роста тест-культуры плотность популяции увеличивается, при этом доза токсиканта на одну клетку уменьшается, поскольку токсикант традиционно добавляется однократно в начале опыта.
Для биоанализа токсичности веществ протоколы EEC, ISO, OECD и др. обычно включают исследования в культуре микроводорослей с диапазоном значений исходной концентрации токсиканта, дают оценку числа клеток для определения значения EC50 рассматриваемого токсиканта и не учитывают его меняющуюся дозу в процессе роста культуры.
В литературе есть работы по влиянию биогенов, температуры, света на поглощение и токсичность тяжелых металлов для тест-объекта микроводоросли Selenastrum capricornutum (Vasser et al., 1988; McLarnon-Riches et al., 1998). Сравнение четырех сред, рекомендованных различными стандартными методами (Международная организация по стандартизации, Агентство по охране окружающей среды США, Организация экономического сотрудничества и развития, AFNOR), показало, что на чувствительность водорослей в экспоненциальной фазе роста не влияет концентрация макроэлементов в питательных средах (Vasser et al., 1988). Поглощение кадмия микроводорослями Selenastrum capricornutum Printz увеличивается при уменьшении количества питательных веществ, температуры и освещения (Simones Gonáalves et al., 1988).
Начальная плотность популяций клеток микроводорослей является важным экспериментальным фактором, который часто не учитывают (Kinley et al., 2017). Для биотестирования иногда используют значения стартовой клеточной плотности необоснованно высокие по сравнению с природными, что может повлиять на оценку токсичности, особенно сильнодействующих веществ в малых концентрациях. Высокая плотность клеток в длительных опытах может приводить к химическим превращениям самого токсиканта при повышении рН и экзометаболитов в среде, изменениям его биодоступности и ток-
сичности. Кроме того, при повышенной плотности, особенно для высших растений, свет становится ограничивающим фактором роста, что может приводить к усилению их чувствительности к токсикантам (Dosnon-Olette et al., 2010).
Было показано, что исходное число клеток водорослей оказалось определяющим, так как токсичность кадмия, меди и цинка снижалась при увеличении количества инокулята, что подтверждалось рассчитанными величинами ЕС50 для разных значений начальной плотности. Снижение токсичности авторы объясняют, в частности, изменением форм соединений металла, вызванных быстрым повышением pH (Vasser et al., 1988).
Показана обратная зависимость фотосинтеза при световом насыщении, скорости клеточного деления и содержания фосфора в клетках от плотности популяции водорослей (Бурлакова и др., 1979). Скорость роста и способность к накоплению металлов у высшего водного растения ряски Lemna gibba существенно менялась в зависимости от плотности популяции (Demirezen et al., 2007). При высокой плотности наблюдалось уменьшение накопления никеля ряской в расчете на одно растение.
Сведений по влиянию плотности популяции на накопление токсических веществ клетками водорослей сравнительно мало (Franklin et al., 2002).
Токсичность тяжелых металлов Cd, Cu, Zn снижается с увеличением начальной плотности клеток цианобактерии Microcystis aeruginosa (Kinley et al., 2017) в связи с уменьшением ко -личества сорбированного металла на клетку. А токсичность легкого металла алюминия для морских диатомовых водорослей Ceratoneis closterium и Minutocellus polymorphus, наоборот, повышается при увеличении начальной плотно-
3 5
сти от 10 до 10 кл./мл (Gillmore et al., 2016), что может быть связано с быстрым истощением питательной среды при высокой плотности клеток. В диапазоне 100-400 тыс. кл./мл токсичность стрептомицина не зависит от начальной плотности клеток Scenedesmus quadricauda, а с ее увеличением существенно уменьшается (Ипа-това и др., 2011).
Термин «доза» чаще используется в медицинских исследованиях и в биоиспытаниях на животных. Традиционная оценка лекарственной токсичности ориентирована на дозу. Доза препарата является основой для проявления токсичности, что делает важным правильное
установление его максимально переносимой дозы. Это верно для системной внутрисосуди-стой доставки препарата. При местной доставке препарата достигается высокая концентрация в местной ткани. Было показано, что для некоторых химиопрепаратов местного применения токсичность следует оценивать исходя из концентрации, а для препаратов внутривенного применения ориентироваться на их дозу. Таким образом, максимально переносимая концентрация может быть даже более важной, чем максимально переносимая доза (Zhang et al., 2014).
Понятие дозовая нагрузка широко используется в литературе и при оценке риска (Kaplan, 2009). Эта концепция основана на экспериментах, в которых животные подвергались воздействию постоянной концентрации в течение установленного периода времени. Однако чаще организмы подвергаются воздействию токсичных материалов с изменяющейся во времени концентрацией.
Среди загрязняющих веществ водных экосистем металлы наиболее приоритетны и опасны. Тяжелый металл хром и легкий металл алюминий как компоненты загрязнения водной среды попадают в окружающую среду в результате природных процессов и антропогенного загрязнения.
Цель настоящего исследование - оценка токсичности тяжелого металла хрома и легкого металла алюминия при разных режимах токсической экспозиции для тест-объектов - культур пресноводной зеленой микроводоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. и морской диатомовой микроводоросли Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell et Hastle. С помощью экспериментальной модели проанализировано выживание культур в экстремальных условиях среды при изменении начальной плотности популяции, возраста культуры, концентрации и дозы токсикантов.
Материал и методы
Альгологически чистую культуру зеленой хлорококковой водоросли Scenedesmus qudricauda (Turp.) Breb. (strain S-3) выращивали на среде Успенского № 1 (состав, г/л: 0,025 KNO3; 0,025 MgSO4; 0,1 KH2PO4; 0,025 Ca(NO3)2; 0,0345 K2CO3; 0,002 Fe2(SO4)3; pH 7,0-7,3) в конических колбах в люминостате при периодическом освещении лампами дневного света (12:12 ч). Альгологически чистую культуру диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii
(Grunow) Fryxell et Hastle выращивали на среде Гольдберга-Кабановой (состав, г/л: 0,2024 KNO3; 0,007105 Na2HPO4; мг/л: 0,1979 MnCl2; 0,2379 CoCl2, 0,2703 FeCl3). Эти виды широко используются в мировой практике в качестве тест-организмов для биоанализа токсичности различных веществ или соединений.
Были поставлены четыре серии экспериментов с разными контролями сравнения.
Тест на токсичность хрома в условиях постоянной дозы. Исследовали токсическое действие хрома в форме бихромата калия (K2Cr2O7), известного как международный стандартный токсикант (Wang 1997), в долгосрочных экспериментах. Культуры водорослей подвергали действию токсиканта в условиях повышения его концентрации в течение экспериментов при сохранении постоянной дозы на одну клетку, чтобы перейти от концентрационной зависимости к дозовой. Опыты проводили как с однократным добавлением токсиканта на исходный день постановки эксперимента, так и с множественными добавками в течение времени экспозиции. Периоды между добавками соответствовали времени удвоения численности, так чтобы доза токсиканта на одну клетку была такой же, как и на начальный день эксперимента.
Для экспериментов с S. quadricauda испытывали концентрации бихромата калия 0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 5,0 и 10,0 мг/л (в расчете на хром). Исходная численность после инокуляции составляла 25 тыс. кл./мл. Токсикант добавляли в культуру на 0-е сутки эксперимента (однократная добавка) и в дальнейшем на 3-, 6-, 10- и 17-е сутки до достижения необходимых концентраций (многократные добавки). Частота добавления токсиканта определялась скоростью клеточного деления. Средняя скорость роста культуры (без хрома) составляла 0,33 деления в сутки.
В экспериментах с T. weissflogii применяли следующие концентрации хрома: 0,001; 0,01; 0,1 и 1,0 мг/л. Начальная численность клеток составляла 5 103 кл./мл. Токсикант добавляли на 0-е сутки эксперимента (однократное добавление). В дальнейшем в одной серии опыта (условно названной нами контрольной) токсикант больше не добавляли, а в другой (многократные добавки) - добавляли на 3-, 6-, 10- и 13-е сутки. Средняя скорость роста культуры (без токсиканта) составляла 0,33 деления/сутки.
Все изменения в процессе роста культур сравнивали с их ростом в среде при однократном добавлении соответствующей концентрации хрома
в начале эксперимента, а также с ростом культур в среде без хрома (чистый контроль).
Тест на токсичность хрома в зависимости от исходной плотности популяции. Провели четыре варианта опыта с разными значениями исходной плотности культуры S. quadricauda 200 тыс. кл./мл, 500 тыс. кл./мл, 1 млн кл./мл, 2 млн кл./мл. Опыты проводили с однократным добавлением хрома 1 мг/л на исходный день постановки эксперимента длительностью 21 сутки. Развитие культуры в опыте сравнивали с ее ростом с тем же исходным числом клеток, но без добавления токсиканта.
Тест на токсичность алюминия в зависимости от исходной плотности популяции. Влияние начальной плотности популяции 25, 100, 500 и 1000 тыс. кл./мл на токсичность алюминия в форме AlCl3 при концентрации 50 мг/л в расчете на соль, что соответствует концентрации 5,6 мг/л алюминия в расчете на ион Al3+, на культуру S. quadricauda оценивали в течение 21 суток. Развитие культуры в опыте сравнивали с ее ростом с тем же исходным числом клеток, но без добавления токсиканта.
Тест на токсичность алюминия в зависимости от времени добавки алюминия в культуру в процессе ее роста. Добавки токсиканта в концентрации 50 и 100 мг/л AlCl3 проводили на 0-, 7-, 14-, 21- и 28-е сутки развития культуры S. quadricauda без регулирования численности клеток на момент внесения токсиканта. Контролем служил рост культуры без токсиканта с момента его добавки в опытные культуры. Общая длительность опыта составляла 49 суток.
Все опыты проводили в колбах с 50 мл питательной среды в трех повторностях для каждой концентрации токсиканта, каждой серии опытов с начальной плотностью клеток, с разным возрастом культур на момент добавки токсиканта и соответствующего контроля. В экспериментах эффект токсиканта на S. qudricauda и T. weissflogii оценивали по показателям численности клеток, доле живых и мертвых клеток в течение времени экспозиции. Клетки подсчитывали в камерах Горяева и Нажотта под световым микроскопом. Долю живых и мертвых клеток оценивали с помощью люминесцентного микроскопа «Axioskop 2FS» («Carl Zeiss», Германия). Оценку токсичности проводили с использованием критерия Стъю-дента для уровня значимости 0,05.
Результаты и их обсуждение
Эффект воздействия хрома на популяцион-ный рост в условиях постоянной дозы. Исполь-
зуя экспериментальную модель, изучали развитие токсического эффекта во времени при сохранении постоянной дозы хрома на одну клетку в течение всего срока биотестирования.
Бихромат калия вносили в ростовые среды пропорционально увеличению численности quadricauda и T. weissflogii так, чтобы его доза сохранялась в течение эксперимента постоянной. В результате значения начальной концентрации и суммарные значения конечной концентрации хрома в конце эксперимента составляли 0,001-0,0033; 0,01-0,034; 0,1-0,3; 1,0-2,7; 5,0-7,0; 10,0-17,5 мг/л для ^ quadricauda и 0,001-0,0055; 0,01-0,054; 0,1-0,55; 1,0-2,6 мг/л для T. weissflogii.
Представленные на рис. 1 данные показывают, что в присутствии высокой концентрации хрома (1 мг/л и выше) численность клеток quadricauda слегка варьирует или уменьшается с момента первой добавки хрома и вплоть до конца 28 суток эксперимента по сравнению с исходной и значительно уменьшалась по сравнению с контролем без хрома. При токсическом влиянии такой интенсивности доза хрома на клетку оставалась постоянной в течение всего опыта, а конечные значения концентрации хрома увеличились всего лишь в 1,4-1,7 раза. Поэтому в отношении высоких значений концентрации вещества можно говорить о совпадении понятий концентрация и доза.
При средней концентрации хрома 0,1 мг/л численность клеток, по сравнению с исходной, в целом увеличивается, но скорость роста культуры замедляется, по сравнению с кон -тролем без хрома. При низких концентрациях хрома (0,001 и 0,01 мг/л) численность клеток
quadricauda соответствовует контрольным параметрам вплоть до 10 суток эксперимента, затем уменьшается, а к концу опыта становится близкой к уровню контроля. Таким образом, наиболее чувствительной стадией культуры при повторных добавках хрома является вторая половина логарифмической фазы роста (10-14-е сутки эксперимента). Поскольку значения концентрации хрома 0,001 и 0,01 мг/л достаточно низкие, маловероятно, что они провоцируют отбор резистентных клеток. В этом случае токсикант может вызывать асинхронизацию культуры (полную или частичную) путем задержки клеточного деления на 7-10-е сутки эксперимента, после чего синхронность деления восстанавливается и культура в дальнейшем достигает контрольного уровня численности клеток.
Рис. 1. Изменение относительной (% от контроля) численности клеток (а, б) и доли живых клеток (в, г) Scenedesmus quadricauda в условиях однократной (б, в) в начале опыта и многократной (а, г) добавки хрома в течение эксперимента
Данные по численности клеток при однократной добавке хрома в культуру & quadricauda в начале эксперимента приведены на рис. 1 (б, в).
Таким образом, при низких значениях концентрации хрома (0,001 и 0,010 мг/л) в течение эксперимента с периодическими добавками хрома скорость роста & quadricauda близка как к уровню контроля без хрома, так и к уровню контроля с однократным добавлением хрома в начале эксперимента, хотя суммарные концентрации хрома в конце эксперимента были в 3,3-3,4 раз выше, чем при однократном его добавлении.
Следовательно, периодическое добавление хрома в течение эксперимента при сохранении его постоянной дозы на всех испытанных уровнях токсического воздействия практически мало меняет картину развития токсического эффекта
во времени по сравнению с однократной добавкой токсиканта в начале опыта.
Доля мертвых и отмирающих клеток в большинстве случаев лишь немного выше в ходе эксперимента с многократным добавлением токсиканта (рис. 1, г) по сравнению с однократным внесением (рис. 1, в).
Число клеток Т. weissflogii в присутствии 0,001 и 0,010 мг/л хрома незначительно ниже только в самом конце опыта и достоверно ниже в присутствии 0,1 мг/л хрома в половине случаев из всех дат счета клеток в течение эксперимента при многократной интоксикации по сравнению с однократной (рис. 2). В присутствии 1 мг/л хрома рост культуры был сходен в обоих случаях при разных режимах добавок токсиканта, за исключением кратковременного подъема численности ближе к концу эксперимента при однократном его добавлении.
Рис. 2. Изменение относительной численности клеток (а) и доли живых клеток (б) Тка1сич'ю&1га weissflogii в условиях однократной в начале опыта и многократной (*) добавки хрома в течение эксперимента
Как и в случае с культурой ^ quadricauda, доля мертвых и отмирающих клеток в культуре Т. weissflogii (рис. 2) была немного выше при многократной добавке токсиканта по сравнению с однократной.
Эффект воздействия хрома на рост культуры Б. цаайпсаайа в зависимости от исходной плотности популяции (200 и 500 тыс. кл./мл, 1 и 2 млн кл./мл). Как видно из рис. 3, а (относительной численности в % по отношению к соответствующему контролю без токсиканта), с увеличением исходной плотности популяции клеток токсичность 1 мг/л хрома снижается. Таким образом, наибольшая токсичность выявлена при наименьшей исследованной плотности клеток 200 тыс. кл./мл, при которой начальная доза токсиканта на одну клетку максимальна.
Эффект воздействия алюминия на рост Б. цаайпсаайа в зависимости от исходной плотности популяции (25, 100, 500 тыс. кл./мл и 1 млн кл./мл). Действие 50 мг/л А1С13 (5,6 мг/л А13). на культуру quadricauda оценивали при разных значениях начальной плотности популяции (25, 100, 500 и 1000 тыс. кл./мл) в день
постановки эксперимента (рис. 3, б). При этом дозы токсиканта в расчете на одну клетку при указанных значениях исходной плотности попу-
7 7
ляции составляли соответственно 2010 , 510 , 110-7 и 5 10-8 мг/кл.
Самая высокая токсичность хлорида алюминия наблюдалась при начальной плотности 25 тыс. кл./мл. При ее увеличении до 1 млн кл./мл доза токсиканта на одну клетку уменьшалась, а токсичность, соответственно, снижалась. Следовательно, численность 25 тыс. кл./мл, согласно методическим указаниям при проведении биотестирования (Методические указания ..., 2001), позволяет более адекватно оценивать токсичность металла.
Эффект воздействия алюминия на рост Б. цаайпсаайа в зависимости от возраста культуры на момент внесения токсиканта. Чтобы оценить токсичность хлорида алюминия при его концентрации 50 и 100 мг/л (5,6 и 11,2 мг/л А13) в зависимости от возраста культуры в процессе ее развития (без изменения плотности популяции на момент его добавки в разные сроки развития культуры), добавки А1С13 в растущую
Рис. 3. Изменение относительной численности клеток Scenedesmus quadricauda в присутствии бихромата калия (а) и хлорида алюминия (б) в зависимости от начальной плотности клеток и от срока добавления (на 0-, 7-, 14-, 21- и 28 -е
сутки) хлорида алюминия в культуру (в)
культуру проводили однократно на 0-, 7-, 14-, 21- и 28-е сутки (рис. 3, в). Дозы токсиканта составляли соответственно 20 10 ; 1,2 10 ; 2,7 • 10-8; 1,4 • 10-8; 1,210-8 мг/кл для 50 мг/л А1С13 и 40 • 10-7; 2,810-7; 5,410-8; 2.810-8; 2.810-8 мг/кл для 100 мг/л А1С13.
При внесении хлорида алюминия в концентрации 50 мг/л в день постановки опыта (на 0-е сутки) рост культуры достоверно отличался от контроля на протяжении всего опыта длительностью 28 суток. А при концентрации А1С13 100 мг/л культура не росла совсем (рис. 3, в).
С увеличением срока внесения А1С13 в растущую культуру, совпадающего с ее возрастом, доза токсиканта на клетку и его токсичность снижались. Уже для 14-суточной культуры кон -центрация 50 мг/л становилась нетоксичной, а при 100 мг/л токсичность с увеличением возраста культуры постепенно снижалась. Начиная с 28 суток роста культура переходила в стационарную фазу, а с 35 суток - в фазу отмирания. Поэтому при добавках токсиканта в культуру в эти сроки ее роста токсичность А1С13 была незначительной, при этом разница в численности клеток по сравнению с чистым контролем соответствующего возраста культуры составляла около 20% и менее.
Результаты этого эксперимента по изучению токсичности алюминия в зависимости от срока добавления его в культуру в процессе ее роста свидетельствуют о том, что с увеличением срока добавления токсиканта в растущую культуру, совпадающего с ее возрастом, токсичность соли алюминия падает. Следовательно, возраст тест-культуры является определяющим фактором, влияющим на оценку токсичности исследуемого вещества. В случае зрелой (14-суточной) и старой (28-суточной) культур можно существенно недооценить токсичность тестируемых веществ.
Заключение
Режим токсической нагрузки в условиях меняющейся концентрации токсиканта в среде или его дозы на одну клетку, разного возраста культуры, разной начальной плотности популяции клеток и сроков добавки токсиканта в процессе роста имеет важное значение в оценке полученного результата при проведении биотестирования на микроводорослях. Высокая плотность клеток и увеличение длительности теста могут приводить к химическим превращениям токсиканта в среде, изменениям его биодоступности и токсичности, быстрому истощению питательных веществ в среде.
Сравнительный анализ полученных нами данных с однократной и многократными добавками хрома в культуры пресноводного вида S. quadricauda и морского вида T. weissflogii по показателю численности клеток при всех испытанных уровнях токсического воздействия свидетельствует о том, что периодическое добавление хрома в течение всего эксперимента в условиях сохранения его постоянной дозы на клетку мало меняет картину развития токсического эффекта во времени по сравнению с традиционно принятой однократной добавкой токсиканта в начале опыта. Это может быть связано со снижением токсичности металла в процессе роста культуры вследствие увеличения рН, изменения формы самого металла в среде, связывания его клетками и экзометаболитами, накопленными в среде культивирования, а также с различными внутриклеточными механизмами детоксикации металла в процессе адаптации культуры к нему.
Таким образом, в токсикологических исследованиях с использованием в качестве тест-объекта микроскопических одноклеточных или ценобиальных водорослей уместно ориентироваться на концентрацию токсиканта, в отличие от биотестирования на животных, где необходимо учитывать и дозу, особенно для медицинских препаратов, используемых внутривенно. В реальных условиях аварийных ситуаций загрязнения окружающей водной среды, когда живые организмы подвергаются воздействию токсичных соединений и материалов с изменяющейся во времени концентрацией, именно концентрация токсиканта имеет решающее значение.
В то же время начальную плотность популяции клеток микроводорослей следует учитывать при проведении процедуры биотестирования. При повышении начальной плотности культуры клетки связывают меньшее количество металла, что приводит к уменьшению поглощения его внутрь клеток и снижению токсичности (Franklin et al., 2002). Высокие значения клеточной плотности создают большую площадь поверхности с большим числом связывающих отрицательно заряженных функциональных групп с высоким сродством к металл-ионам, при этом каждая отдельная клетка получает меньшее количество металла, что и определяет снижение его токсичности. Следовательно, в начале опыта доза токсиканта на клетку является важным экспериментальным фактором, который необходимо учитывать. От начальной плотности популяции зависит и величина полуэффективной
концентрации (ЭК50) испытываемых веществ, которую рассчитывают по результатам острого опыта с токсикантом, поэтому рекомендуется не превышать исходную численность клеток микроводорослей. Начальная плотность популяции 25 тыс. кл./мл, согласно нашим данным и методическим указаниям при проведении биотестирования (Методические указания ... , 2011; Терехова и др., 2014), позволяет более адекватно оценивать токсичность металла и других веществ. Полученные нами результаты биотестирования с разными значениями начальной клеточной плотности согласуются с данными других работ (Franklin et al., 2002; Ипатова и др., 2011).
Как показали наши исследования, возраст культуры и плотность популяции на момент добавки токсиканта в процессе ее роста в накопительном режиме культивирования также вли-
яют на результаты биотестирования в сторону снижения токсичности, поскольку при развитии культуры с возрастом меняется ее физиологическое состояние, а следовательно, и ее чувствительность к токсикантам, что и приводит к недооценке токсичности исследуемого вещества при использовании для опыта старой культуры. Поэтому для проведения процедуры биотестирования необходимо брать только молодую 5-7-су-точную тест-культуру, находящуюся на логарифмической стадии роста.
Подобные исследования и полученные в работе результаты имеют важное значение для совершенствования методик биотестирования в целях более адекватной и реалистичной оценки токсичности, опасности загрязняющих веществ и охраны окружающей водной среды от загрязнения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бурлакова З.П., Крупаткина Д.К., Ланская Л.А., Яфаро-ва Д. Л. Влияние плотности популяции морских одноклеточных водорослей на потребление фосфора и основные физиологические показатели клеток // Взаимодействие между водой и живым веществом: Тр. Междунар. симпоз., Одесса, 6-10 октября 1975 г. М., 1979. Т. 1. С. 231-235.
Ипатова В.И., Прохоцкая В.Ю., Коломенская Е.Е. Влияние начальной плотности популяции на проявление токсичности веществ в испытаниях с использованием микроводорослей // Токсикологический вестник. 2011. № 2. С. 51-55.
Методические указания по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения / Под ред. С. А. Соколовой. М., 2011. 165 с.
Терехова В. А., Воронина Л.П., Гершкович Д.М., Ипатова В.И., Исакова Е.Ф., Котелевцев С.В., Попут-никова Т.О., Рахлеева А. А., Самойлова Т.А., Филенко О.Ф. Биотест-системы для задач экологического контроля: Методические рекомендации по практическому использованию стандартизованных тест-культур. М., 2014. 48 с.
Терехова В.А., Гершкович Д.М., Гладкова М.М., Ипатова В.И., Исакова Е.Ф., Николаева О.В., Рахлеева А.А., Федосеева Е.В. Биотестирование в экологическом контроле / Под ред. В.А. Тереховой. М.: ГЕОС, 2017. 70 с.
Филенко О.Ф., Исакова Е.Ф., Гершкович Д.М., Ипатова В.И., Дмитриева А.Г. Биотестирование качества среды с использованием гидробионтов. Раздел больного практикума по гидробиологии: Учебно-методическое пособие. М., 2015. 44 с.
Demirezen D., Aksoy A., Uruc K. Effect of population
density on growth, biomass and nickel accumulation capacity of Lemna gibba (Lemnaceae) // Chemosphere, 2007. Vol. 66. P. 553-557.
Dosnon-Olette R., Couderchet M., Arfaoui A., Sayen S., Eullaffroy Ph. Influence of initial pesticide concentrations and plant population density on dimethomorph toxicity and removal by two duckweed species // Sci. Total Environ. 2010. Vol. 408. P. 2254-2259.
Franklin N.M., Stauber J.L., Apte S.C., Lim R.P. Effect of initial density on the bioavailability and toxicity of copper in microalgal bioassays // Environ. Toxicol. Chem. 2002. Vol. 21. P. 742-751.
Gillmore M., Golding L., Angel Br., Adams M., Jolley D. Toxicity of dissolved and precipitated aluminium to marine diatoms // Aquat. Toxicol. 2016. Vol. 174. P. 82-91.
Kaplan H. A model for the toxic dose under time-varying concentration // J. Hazard. Mater. 2009. Vol. 167. N 1-3. P. 351-356.
Kinley C.M., Iwinski K.J., Hendrikse M., Geer T.D., Rodgers J.H. Jr. Cell density dependence of Microcystis aeruginosa responses to copper algaecide concentrations: Implications for microcystin-LR release // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2017. Vol. 145. P. 591-596.
McLarnon-Riches C.J., Rolph C.E, Greenway D.L.A., Robinson P.K. Effects of environmental factors and metals on Selenastrum capricornutum lipid // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. N 5. P. 1241-1247.
Simöes-Gongalves M.L.S., Vilhena M.F.C., Sampayo M.A. Effect of nutrients, temperature and light on uptake of cadmium by Selenastrum capricornutum Printz // Water Res. Vol. 22. N 11. P. 1429-1435.
Vasseur P., Pandard P., Burnel D. Influence of some experimental factors on metal toxicity to Selenastrum capricornutum // Envir. Toxicol. 1988. Vol. 3. N 3. P. 331-343.
Zhang R., Saito R., Mano Y., Kanamori M., Sonoda Y, Kum-
abe T., Tominaga T. Concentration rather than dose de- distributed by convection-enhanced delivery // J. Neurofines the local brain toxicity of agents that are effectively sci. Methods. 2014. Vol. 222. P. 131-137.
REFERENCES
Burlakova Z.P., Krupatkina D.K., Lanskaya L.A., Ya-farova D.L. Vliyanie plotnosti populyatsii morskikh odnokletochnykh vodoroslei na potreblenie fosfora i osnovnye fiziologicheskie pokazateli kletok // Vzaimodeistvie mezhdu vodoi i zhivym veshchestvom: Tr. Mezhdunar. simpoz., Odessa, 6-10 okt. 1975 g. M., 1979. T. 1. S. 231-235.
Ipatova V.I., Prokhotskaya V.Yu., Kolomenskaya E.E. Vliyanie nachal'noi plotnosti populyatsii na proy-avlenie toksichnosti veshchestv v ispytaniyakh s ispol'zovaniem mikrovodoroslei // Toksikologicheskii vestnik. 2011. № 2. S. 51-55.
Metodicheskie ukazaniya po razrabotke normativov kachestva vody vodnykh ob"ektov rybokhozyaist-vennogo znacheniya, v tom chisle normativov predel'no dopustimykh kontsentratsii vrednykh veshchestv v vodakh vodnykh ob"ektov rybokho-zyaistvennogo znacheniya / Pod red. S.A. Sokolo-voi. M., 2011. 165 s.
Terekhova V.A., Voronina L.P., Gershkovich D.M., Ipatova V.I., Isakova E.F., Kotelevtsev S.V., Poputnikova T.O., Rakhleeva A.A., Samoilova T.A., Filenko O.F. Biotest-sistemy dlya zadach ekologicheskogo kon-trolya: Metodicheskie rekomendatsii po praktiches-komu ispol'zovaniyu standartizovannykh test-kul'tur. M., 2014. 48 s.
Terekhova V.A., Gershkovich D.M., Gladkova M.M., Ipatova V.I., Isakova E.F., Nikolaeva O.V., Rakhleeva A.A., Fedoseeva E.V. Biotestirovanie v eko-logicheskom kontrole / Pod red. V.A. Terekhovoi. M.: GEOS, 2017. 70 s.
Filenko O.F., Isakova E.F., Gershkovich D.M., Ipatova V.I., Dmitrieva A.G. Biotestirovanie kachestva sredy s ispol'zovaniem gidrobiontov. Razdel bol'nogo prakti-kuma po gidrobiologii: Uchebno-metodicheskoe poso-bie. M., 2015. 44 s.
Demirezen D., Aksoy A., Uruc K. Effect of population density on growth, biomass and nickel accumulation capacity of Lemna gibba (Lemnaceae) // Chemosphere, 2007. Vol. 66. P. 553-557.
Dosnon-Olette R., Couderchet M., Arfaoui A., Sayen S., Eullaffroy Ph. Influence of initial pesticide concentrations and plant population density on dimethomorph toxicity and removal by two duckweed species // Sci. Total Environ. 2010. Vol. 408. P. 2254-2259.
Franklin N.M., Stauber J.L., Apte S.C., Lim R.P. Effect of initial density on the bioavailability and toxicity of copper in microalgal bioassays // Environ. Toxicol. Chem. 2002. Vol. 21. P. 742-751.
Gillmore M., Golding L., Angel Br., Adams M., Jolley D. Toxicity of dissolved and precipitated aluminium to marine diatoms // Aquat. Toxicol. 2016. Vol. 174. P. 82-91.
Kaplan H. A model for the toxic dose under time-varying concentration // J. Hazard. Mater. 2009. Vol. 167. N 1-3. P. 351-356.
Kinley C.M., Iwinski K.J., Hendrikse M., Geer T.D., Rodgers J.H. Jr. Cell density dependence of Microcystis aeruginosa responses to copper algaecide concentrations: Implications for microcystin-LR release //Ecotoxicol. Environ. Saf. 2017. Vol. 145. P. 591-596.
McLarnon-Riches C.J., Rolph C.E, Greenway D.L.A., Robinson P.K. Effects of environmental factors and metals on Selenastrum capricornutum lipid // Phyto-chemistry. 1998. Vol. 49. N 5. P. 1241-1247.
Simöes-Gongalves M.L.S., Vilhena M.F.C., Sampayo M.A. Effect of nutrients, temperature and light on uptake of cadmium by Selenastrum capricornutum Printz // Water Res. Vol. 22. N 11. P. 1429-1435.
Vasseur P., Pandard P., Burnel D. Influence of some experimental factors on metal toxicity to Selenastrum capricornutum // Envir. Toxicol. 1988. Vol. 3. N 3. P. 331-343.
Zhang R., Saito R., Mano Y., Kanamori M., Sonoda Y, Kumabe T., Tominaga T. Concentration rather than dose defines the local brain toxicity of agents that are effectively distributed by convection-enhanced delivery // J. Neurosci. Methods. 2014. Vol. 222. P. 131-137.
Информация об авторах
Ипатова Валентина Ивановна - ст. науч. сотр. кафедры общей экологии и гидробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, доцент, канд. биол. наук (viipatova@hotmai1.com, artioukhova@mai1.ru);
Лазарева Анна Максимовна - аспирант кафедры общей экологии и гидробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (1azanna1998@mai1.ru).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Contribution of the authors
the authors contributed equally to this article.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflicts of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 25.03.2022; одобрена после рецензирования 18.09.2022; принята к публикации 06.11.2022.
The article was submitted 25.03.2022; approved after reviewing 18.09.2022; accepted for publication 06.11.2022.
