CC BY
57
Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 4-5, стр. 409-414 © 2012, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
КОНЦЕНТРАЦИИ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ И ЛАКТОФЕРРИНА В КРОВИ И СУПЕРНАНТАНТАХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
Школьникова Т.В., Зорина В.Н., Коняхина И.Г., Рябичева Т.Г., Бурдина А.В., Зорина Р.М.
Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Минсоцздравразвития России, г. Новокузнецк
Закрытое акционерное общество «Вектор-Бест», Кольцово, г. Новосибирск
Резюме. Исследовались сыворотка и супернатанты суточных культур клеток периферической крови больных псориазом и здоровых доноров на содержание цитокинов (IFNy, TNFa, IL-6, IL-1 в, IL-8, IL-17) и лактоферрина. Было установлено, что спонтанная продукция большинства исследуемых цитокинов (TNFa, IL-6, IL-1 в, IFNy) у пациентов, больных псориазом, достоверно выше в сравнении с контролем, тогда как при индуцированном синтезе статистически значимым оказалось повышение только IFNy и IL-8. Индекс стимуляции TNFa, IL-6, а при тяжелой форме псориаза также IL-8 и IFNy, был статистически достоверно ниже в супернатантах культур клеток периферической крови больных по сравнению со здоровыми донорами. Кроме того, нами выявлено повышение уровней лактоферрина в сыворотке крови и супернатантах при спонтанном и индуцированном синтезе у всех обследуемых пациентов. Мы полагаем, что данный метод кратковременной культивации может быть использован в качестве дополнительного диагностического и прогностического критериев при определении тяжести процесса, а также для индивидуального подбора системной цитокинотерапии.
Ключевые слова: псориаз, цитокины, супернатанты культур, мононуклеары, лактоферрин, функциональная активность клеток.
Shkolnikova T.V., Zorina V.N., Konyakhina I.G., Ryabicheva T.G., Burdina A.V., Zorina R.M. CONCENTRATIONS OF SOME CYTOKINES AND LACTOFERRIN IN BLOOD SERUM AND SUPERNATANTS Of pERIpHERAL Blood CELLs From RATIENTs wITH psORIAsis
abstract. We had investigated serum samples and supernatants of blood cells (24-h culture) from healthy donors (controls) and patients with verified psoriasis, to evaluate IFNy, TNFa, IL-6, IL-1e, IL-8, IL-17 and lactoferrin (Lf) levels in the samples. Spontaneous production of IFNy, TNFa, IL-6, IL-1e was shown to be significantly increased in clinical samples from patients with psoriasis, as compared with controls. Moreover, mitogen-induced cell proliferation was accompanied by significant increase of IFNy and IL-8 levels. Accordingly, a significantly decreased stimulation index was revealed for TNFa and IL-6 synthesis in cell supernatants from patients with psoriasis as compared with healthy donors, and, in addition, a lower stimulation index for IFNy and IL-8 in a group with severe psoriasis. We have also revealed a significant increase of Lf levels in blood serum and supernatants from patients with psoriasis, either with or without mitogen stimulation. We guess
that such an approach of cytokine detection after a 24-h incubation may be used as an additional diagnostic and prognostic criterion to evaluate the disease severity, and to perform individual selection of drugs for systemic cytokine therapy. (Med. Immunol., 2012, vol. 14, N 4-5, pp 409-414)
Адрес для переписки:
Зорина Вероника Николаевна,
ГБОУ ДПО НГИУВ, НИЛ иммунологии 654005, Кемеровская обл., г. Новокузнецк, пр. Строителей, 5.
Тел.: (3843) 45-84-18.
E-mail: macroglobulin@yandex.ru
Keywords: psoriasis, cytokines, culture supernatants, mononuclear cells, lactoferrin, cellular functional activity.
409
Школьникова Т.В. и др.
Медицинская Иммунология
Введение
Патогенетические механизмы псориаза до сих пор остаются неуточненными и вызывают споры среди исследователей. В последнее время ведущая роль в патогенезе заболевания отводится Т-хелперам 1-го типа (Th1), продуцирующим интерферон —у (IFNy), интерлейкин 2 (IL-2), фактор некроза опухоли (TNFa) и другие цитокины, способствующие реализации опосредованных клетками иммунных реакций. Кроме того, недавно установлено, что не менее важная роль принадлежит другой самостоятельной линии CD4+ эф-фекторных клеток — Th17, дифференцировка которых инициируется интерлейкинами IL-1 в, IL-6 и TNFa. [2]. На сегодняшний день активно изучаются и внедряются методы цитокинотерапии [10]. Однако данные по уровням отдельных цитокинов в крови и культурах мононуклеаров при псориазе достаточно противоречивы. Так, одни авторы обнаруживали увеличение, а другие — отсутствие изменений или даже снижение содержания IFNy [10]. Предполагается, что данные различия связаны с выраженным локальным синтезом цитокинов при псориазе, по-разному влияющим на их общее содержание в циркуляции. Еще одной причиной расхождений в результатах может быть применение различных методик для культивации клеток и определения уровней цитокинов. Необходимо также отметить, что в большинстве своем использованные для описанных в литературе научных исследований методы культивации мононуклеаров достаточно трудоемки, длительны и потому малоприменимы в условиях клинической практики. В то же время своевременная оценка функциональной активности клеток при псориазе в условиях клиники могла бы значительно повысить эффективность назначаемого лечения путем его оптимизации в соответствии с индивидуальной оценкой состояния клеточного иммунитета пациента.
Таким образом, целью нашей работы было изучение сывороточных концентраций, а также спонтанной и митоген-индуцированной продукции ряда цитокинов (TNFa, IL-1 в, IL-6, IL-8, IFNy, IL-17) и лактоферрина (ЛФ), синтез которого взаимосвязан с синтезом IL-8 [6] в супернатантах клеток периферической крови, при помощи нового метода, предусматривающего кратковременное (суточное) культивирование цельной крови in vitro, с использованием тест-системы «Цитокин-Стимул-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) при легкой и тяжелой формах псориаза до назначаемого лечения для оценки эффективности применения данного метода в клинической практике.
Материалы и методы
Обследовано 20 пациентов в возрасте от 22 до 45 лет с установленным диагнозом: Вульгарный псориаз, прогрессирующая стадия, легкой и тяжелой степени тяжести, без предварительного специфического лечения в течение последних 6 месяцев. Пациенты прошли первичное стандартное обследование, при сборе анамнеза внимание обращалось на давность заболевания, частоту рецидивов, их сезонность, наследственную отя-гощенность по данному заболеванию. Для определения тяжести течения псориатического процесса использовался индекс PASI (Psoriasis area and severity index), согласно которому оценивались эритема, инфильтрация, шелушение бляшек и площадь поражения кожи [1]. Давность заболевания при тяжелой форме: от 27 до 36 лет, с обострениями выше 3 раз в год либо с непрерывно рецидивирующим течением процесса, индекс PASI составлял > 50. Давность заболевания при легкой форме: от 9 до 34 лет, с обострениями 1-2 раза в год, индекс PASI составлял < 10. В исследовании участвовали только пациенты, не имеющие сопутствующих аутоиммунных заболеваний и другой хронической патологии в стадии обострения.
Контрольную группу составили 10 практически здоровых, сопоставимых по возрасту доноров, отобранных по результатам плановой диспансеризации.
Для оценки функциональной активности клеток цельной крови в реакции in vitro по суточной спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов (TNFa, IL-6, IL-1 в, IFNy, IL-8, IL-17) и лактоферрина (ЛФ) у всех обследуемых производился забор крови из вены (утром — натощак). Для проведения анализов использовался набор для культивирования и митогенной активации клеток крови «Цитокин-Стимул-БЕСТ». Согласно рекомендациям производителя, 1 мл цельной крови от каждого больного вводили во флакон № 1, содержащий 4 мл стерильной питательной среды с гентамицином и гепарином в концентрациях 2,5 Ед/мл и 100 мкг/мл соответственно. Далее 1 мл разбавленной в 5 раз крови из флакона №1 переносили во флакон № 2, содержащий стерильный лиофилизированный комплексный митоген (2 мкг липополисахарида и по 4 мкг фитогемагглютинина и конкана-валина А). После аккуратного, но тщательного перемешивания флаконы помещали в термостат (+37 °С) на 1 сутки, после чего клетки крови осаждали центрифугированием при 1,5 тыс. оборотов, а в надосадочной жидкости (супернатан-
410
2012, Т. 14, № 4-5
Цитокины и ЛФ в крови и супернатантах при псориазе
ТАБЛИЦА 1. СЫВОРОТОЧНЫЕ УРОВНИ И СОДЕРЖАНИЕ В СУПЕРНАТАНТАХ СПОНТАННО ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ
и мигогЕн-индуцировАнных клеток периферической крови провоспалительных
И ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ ЦИТОКИНОВ, А ТАКЖЕ ЛАКТОФЕРРИНА ПРИ ПСОРИАЗЕ
Группы обследо- ванных Показа- тель ЛФ (мкг/мл) IL-8 (пкг/мл) IL-6 (пкг/мл) IFNy (пкг/мл) TNFa (пкг/мл) IL-1P (пкг/мл) IL-17 (пкг/мл)
Здоровые доноры КР 1,36±0,09 4,11±0,79 0,04±0,04 1,38±0,49 1,81±0,49 1,00±0,33 0±0
СП 0,46±0,12 1858±287 147±49 0,17±0,12 2,97±0,77 10,1±2,4 6,0±2,1
ИНД 1,94±0,38 18720±1804 22773±5598 480±126 1422±301 631±221 52±8,3
ИС 4,60±0,98 18,86±2,68 280,3±89,4 590±117 585±157 90,7±19,7 15±5,6
Легкая форма псориаза КР 2,43±0,21* 8,33±1,36* 2,57±0,83* 4,45±0,55* 2,47±0,47 0,05±0,03 0,4±0,3
СП 1,23±0,32* 3414±1014 778±271* 6,78±0,90* 13,4±2,7* 28,2±9,2* 3,3±0,3
ИНД 6,63±0,99** 27890±7266 31784±10655 1272±394* 1405±295 849±360 40±4,4
ИС 6,18±0,81 8,98±2,07 52,2±15,3* 188±57,9 135±40,6* 32,1±10,4 13±1,8
Тяжелая форма псориаза КР 2,74±0,18* 12,20±1,24*, ** 4,57±0,83* 4,16±0,53* 3,18±0,56 0,26±0,12 0,2±0,1
СП 1,73±0,41* 7239±1134*, ** 1643±398* 10,6±2,27* 26,8±8,74* 51,4±13,8* 4,2±1,4
ИНД 7,63±1,05* 41031±8139* 29159±6014 1021±377 1901±377 1565±498 47±9,1
ИС 5,36±0,80 6,36±1,32* 47,5±31,2* 102±47,1* 94,2±23,1* 50,2±24,0 23±8,7
Примечание. КР - содержание в сыворотке крови, СП - содержание в супернатантах при спонтанной пролиферации клеток, ИНД - содержание в супернатантах при митоген-индуцированной пролиферации клеток, ИС - индекс стимуляции; * - достоверное отличие (р < 0,05) от контроля, ** - достоверное отличие (р < 0,05) от легкой формы псориаза.
411
Школьникова Т.В. и др.
Медицинская Иммунология
ты) определяли концентрации цитокинов и лак-тоферрина.
Уровни TNFa, IL-6, IL-ip, IFNy, IL-8, IL-17 и лактоферрина в сыворотке крови и супернатантах клеточных культур определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих коммерческих тест-систем (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Индекс стимуляции (И.С.) рассчитывался отношением концентраций исследуемых цитокинов и лактоферрина в митоген-стимули-рованных супернатантах к спонтанной продукции.
Статистическая обработка результатов проводилась при помощи программы для биостатистики InStat-II (Sigma, США). Для обработки полученных данных применялась парная t-статистика. Параметры, приводимые в работе и таблицах: n — количество обследованных, M±m — среднестатистическое значение ± ошибка средней, p — достоверность различий (значимо < 0,05).
Результаты и обсуждение
Изучение общих сывороточных концентраций провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-ip), а также иммунорегуляторных (IL-6, IFNy), хемоаттрактанта IL-8, IL-17 и лактофер-рина, синтез которого стимулирует синтез IL-8 [5] при псориазе, продемонстрировало следующее (табл. i).
Концентрации IL-6 и IL-8 при псориазе были достоверно выше, чем в контрольной группе, что согласуется с литературными данными [i0], однако сравнение между собой больных, разделенных по степени тяжести процесса, выявило значимые различия только при изучении IL-8. Уровни IFNy были достоверно увеличены при псориазе, без отличий между группами больных различными степенями тяжести. Содержание TNFa имело тенденцию к повышению при утяжелении процесса, но достоверных отличий от контроля, как у других авторов [4, 5], нами не обнаружено (р = 0,0729 при сравнении здоровых и больных тяжелой формой), что, вероятно, можно объяснить большой индивидуальной вариабельностью показателей. Нами не выявлено различий между нормой и патологией при изучении содержания IL-ip и IL-17, при том, что, по литературным данным, концентрации IL-ip при псориазе могут снижаться [8], а IL-17, как правило, повышены [2]. Сывороточные концентрации ЛФ были высоко достоверно (р > 0,0001) повышены при псориазе, вне
зависимости от тяжести процесса. Необходимо отметить, что индивидуальная вариабельность результатов при изучении IFNy, TNFa, IL-ip была в целом сопоставима в норме и при патологии. При этом колебания в концентрациях IL-8, IL-6 и, в меньшей степени, IL-i7 при псориазе были выражены значительно сильнее, чем у здоровых. Обращает на себя внимание, что повышенные уровни острофазового лактофер-рина (> i,8 мкг/мл) определялись только в 20% случаев у здоровых и в 75% случаев у больных псориазом.
Известно, что в культурах клеток моноциты, полученные от пациентов, больных псориазом, способны стимулировать хемотаксис нейтрофилов, фагоцитоз и продукцию О2 даже без предварительной стимуляции липополисахаридами, предположительно за счет гиперсинтеза TNFa [ii] и других цитокинов, включая IFNy и грану-лоцит / макрофаг — колония — стимулирующий фактор (GM-CSF) [i2]. При изучении активности хемотаксиса, добавление супернатантов кератоцитов, культивированных в присутствии TNFa, напрямую приводило к миграционному ответу нейтрофилов и Т-лимфоцитов, и в 80% случаев данная миграция ингибировалась антисывороткой к IL-8 [3, 9]. При этом известно, что около 2,5% CD4(+) Т-лимфоцитов периферической крови синтезируют IL-8, вызывающий хемотаксис нейтрофилов, регулирующий их инфильтрацию и подавляющий их апоптоз, что, как предполагают, и является причиной псориатического поражения кожи [i2]. В этой связи, представляет интерес изучение спонтанного и индуцированного синтеза цитокинов культурами клеток больных, в зависимости от тяжести псориаза, для уточнения патогенетических механизмов данного заболевания.
Применение метода изучения уровней цитокинов и ЛФ в супернатантах суточных культур клеток периферической крови продемонстрировало следующее (табл. i). Спонтанная продукция практически всех исследуемых цитокинов (TNFa, IL-6, IL-ip, IFNy) у пациентов, больных псориазом, была достоверно выше в сравнении с контролем, что подтверждает их значимую роль в патогенезе данного заболевания. Исключение составил IL-8, статистически значимое повышение содержания которого зафиксировано только при тяжелом псориазе (отличия между легкой формой и контролем недостоверны — р = 0,0800), а также, как ни парадоксально, IL-i7. При этом в случае IL-ip, IFNy, IL-6 и IL-8 достоверность отличий от здоровых при тяжелой форме псориаза была выше, чем при легкой, но статистически
4i2
2012, Т. 14, № 4-5
Цитокины и ЛФ в крови и супернатантах при псориазе
значимых различий между больными, разделенными по степеням тяжести, не обнаружено. Продукция ЛФ была достоверно повышена в культурах клеток больных псориазом по сравнению с контролем. При тяжелой форме это отличие было более выраженным, но статистически значимых различий между тяжелой и легкой формами обнаружено не было.
При стимуляции клеток крови здоровых и больных псориазом митогеном из набора «Цитокин-стимул» in vitro, индуцированная таким образом продукция TNFa, IL-6, IL-17 при псориазе, вне зависимости от степени тяжести, достоверно не отличалась от контрольных значений. Выявлено статистически значимое повышение продукции IL-1 в и IL-8 при тяжелой форме псориаза и IFNy — при легкой. Обнаружено высоко достоверное повышение продукции ЛФ по сравнению со здоровыми, вне зависимости от тяжести заболевания.
Необходимо отметить, что у больных псориазом колебания индивидуальных значений уровней интерлейкинов в супернатантах митоген-стимулированных клеток были, как и в случае со спонтанной продукцией, намного существеннее, чем в контрольной группе.
При сопоставлении индекса стимуляции клеток, синтезирующих цитокины и лактоферрин, выявлено достоверное снижение данного индекса при псориазе в случае изучения TNFa, IL-6 вне зависимости от степени тяжести процесса. В случае IL-1p достоверные различия с контрольной группой наблюдались только при легкой форме, а в случае IFNy и IL-8 — при тяжелой. Не выявлено достоверных различий между нормой и патологией при исследовании индекса стимуляции IL-17 и ЛФ. Выраженное снижение индекса стимуляции синтеза ряда цитокинов при псориазе демонстрирует уменьшение синтетического потенциала клеток иммунной системы и придает особое значение в его патогенезе локальному синтезу медиаторов воспаления клетками, находящимися непосредственно в зонах локализации пораженных тканей.
Таким образом, используемый нами новый метод краткосрочной культивации клеток периферической крови позволяет оценить их активность и получить результаты, сопоставимые с более длительными методиками культивации мононуклеаров, по крайней мере, в том, что касается неизменности продукции IL-ip, повышения синтеза IL-8 [10] и TNFa [7]. Особо интересны данные, полученные по синтезу ЛФ культурами клеток. Данный показатель не подвержен такой значительной индивидуальной вариабельности,
как уровни цитокинов, в то время как повышение его уровней при спонтанном и, в меньшей степени, при индуцированном синтезе в культурах имеет явную тенденцию к взаимосвязи со степенью тяжести заболевания. Мы предполагаем, что широкое внедрение подобного краткосрочного метода культивации клеток крови в клиническую практику при псориазе перед назначением цитокинотерапии позволит оценить целесообразность ее назначения и прогнозировать эффективность лечения.
Список литературы
1. Адаскевич В.П. Диагностические индексы в дерматологии // М.: Медицинская книга,
2004. - С.107-108
2. Кочергин Н.Г. Псориаз: последние новости // Consilium Medicum Дерматология. — 2007. — № 2. — Прил. 1. — С. 8-10.
3. Barker J.N., Jones M.L., Mitra R.S., Crockett-Torabe E., Fantone J.C., Kunkel S.L., Warren J.S., Dixit VM., Nickoloff B.J. Modulation of keratinocyte-derived interleukin-8 which is chemotactic for neutrophils and T lymphocytes // Am. J. Pathol. — 1991. — Vol. 139 (4). — P. 869-876.
4. Bonifati C., Carducci M., Cordiali Fei P, Trento E., Sacerdoti G., Fazio M., Ameglio F. Correlated increases of tumour necrosis factor-a, interleukin-6 and granulocyte monocyte — colony stimulating factor levels in suction blister fluids and sera of psoriatic patients — relationship with disease severity // Clin. Exp. Dermatol. — 1994. — Vol. 19. — P. 383-387.
5. Chodorowska G. Plasma concentrations of IFNy and TNFa in psoriatic patients before and after local treatment with dithranol ointment // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. — 1998. — Vol. 10. — P. 147-151.
6. Legrand D., Elass E., Carpenter M., Mazurer J. Lactoferrin: a modulator of immune and inflammatory response // Cell. Mol. Life Sci. —
2005. — Vol. 62. — P. 2549-2559.
7. Mizutani H., Ohmoto Y, Mizutani T., Murata M., Shimizu M. Role of increased production of monocytes TNFa? IL-1 and IL-6 in psoriasis: relation to focal infection, disease activity and responses to treatments // J. Dermatol. Sci — 1997. — Vol. 14. — P 145-153.
8. Okubo Y., Koga M. Peripheral blood monocytes in psoriatic patients overproduce cytokines // J. Dermato. Sci. — 1998. — Vol. 17. — P. 233-232.
413
Школьникова Т.В. и др.
Медицинская Иммунология
9. Peter J., Aronson A. Review of the role of neutrophils in psoriasis and related disorder // Dermatology Online Journal. — 2008. — Vol. 14 (7).
10. Pietrzak A.T., Zolewska A., Chodorowska G., Krasowska D., Michalak-Stoma A., Nockowski P, Osemlak P, Paszkowski T., Rolinski J.M. Cytokines and anticytokines in psoriasi // Clin. Chi. Act. — 2008. - Vol. 394. - P 7-21.
11. Pigatto PD., Pigatto L.B., Bigardi A., Altomare G., Finzi A.F. Factors secreted by untreated psoriatic monocytes enhance neutrophil functions //
J. Invest. Dermatol. — 1990. — Vol. 94 (3). — P 372376.
12. Schaerli P, Britschgi M., Keller M., Steiner U.C., Steinmann L.S., Moser B., Pichler WJ. Characterization of human T cells that regulate neutrophilic skin inflammation // J. Immunol. — 2004. — Vol. 173 (3) — P 2151-2158.
поступила в редакцию 30.09.2011 отправлена на доработку 04.01.2012 принята к печати 13.02.2012
414
