CC BY
80
УДК 637:616.98:579.869.1
КОНТРОЛЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА
Бровкина Анна Николаевна к.в.н., докторант
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН, Москва, Россия
Показана возможность выявления сальмонелл группы В иммунохроматографическим методом в пищевых продуктах, воде и воздухе
Ключевые слова: ЭКСПРЕСС-ИНДИКАЦИИ, ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ, ИНДИКАЦИЯ
UDC 637:616.98:579.869.1
CONTROL OF ACTIVATORS OF SHARP INTESTINAL INFECTIONS ON THE BASIS OF METHOD OF IMMUNOCHROMATOGRAPHY
Brovkina Anna Nikolaevna Cand.Vet.Sci., competitor for doctor's degree
All-Russia Scientific research institute of veterinary sanitary, hygiene and ecology, The Russian academy of agricultural sciences, Moscow, Russia
The opportunity of revealing of salmonellas of group H with immunochromatography method in foodstuff, water and air is shown
Keywords: EXPRESS-INDICATIONS, IMMUNOCHROMATOGRAPHY ANALYSIS, ACTIVATORS OF VIRUS AND BACTERIAL NATURE, INDICATION
В настоящее время большой интерес представляет разработка и внедрение в практику систем экспресс-индикации возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и бактериальной природы, использование которых возможно как в лабораторных, так и в полевых условиях. Задачей при создании таких систем является как можно более раннее выявление возбудителя заболевания в кратчайшие сроки при упрощении процедуры анализа. Перспективной с этой точки зрения являются методы на основе иммунохроматографии (1).
Метод иммунохроматографического анализа основан на течении иммунной реакции «антиген-антитело» при движении тестируемого жидкого образца по композитной мембране и визуальном учете результатов по наличию или отсутствию окрашенных зон с иммобилизованными иммунореагентами.
Иммунохроматографические индикаторные элементы (ИИХЭ) представляют собой сборку из нескольких мембран, плотно прилегающих друг к другу и обеспечивающих свободное перемещение жидкой пробы под действием капиллярных сил от подложки для нанесения исследуемого
образца к подложке для впитывания образца. Принцип достижения аналитического эффекта заключался в следующем. Жидкую пробу, содержащую микроорганизмы, наносили на подложку для впитывания образца, затем пробу перемещали вдоль сборки мембран, реагируя с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом. Образованный комплекс имел вишневую окраску. Полученный иммунный комплекс под действием капиллярных сил перемещался по нитроцеллюлозной мембране, достигает аналитической зоны, где происходило его иммобилизация на мембране за счет связывания с антителами аналитической зоны. В этой зоне образовывался ярко-окрашенный «сэндвич» коньюгата коллоидного золота, связанного с микробными клетками, и антител,
иммобилизованных на мембране. В аналитической зоне наносили антитела к другим антигенным эпитопам инфекционного агента. Часть жидкой пробы продолжала перемещение по нитроцеллюлозной мембране, связываясь с антителами контрольной зоны и впитываясь в положку для сбора образца. Образование окраски в контрольной зоне подтверждает наличие связанных с золем золота антител, косвенно указывая на иммунохимическую активность конъюгата.
Неоценимое значение такие тест-системы имеют при решении широкого диапазона вопросов эпизоотического и эпидемического надзора, в том числе таких актуальных проблем, как надзор за кишечными инфекциями.
Цель работы
Адаптация методов иммунохроматографического определения возбудителей острых кишечных инфекций, в частности, бактерий рода Salmonella (группа В) в объектах окружающей среды, кормах и продуктах питания.
Материалы и методы
Исследовали пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов, кормов для животных и объектов окружающей среды.
Индикацию бактерий рода Salmonella группы В проводили в 743 объектах окружающей среды, 51 образце кормов для животных и 175
образцов пищевых продуктов, 200 образцов продовольственного сырья.
Для выявления бактерий рода Salmonella. с помощью иммунохроматографических тест-систем использовали «Набор ИИХЭ для индикации сальмонелл».
Подтверждение результатов, полученных при
иммунохроматографических исследованиях, проводили
бактериологическим методом. Отбор и подготовку проб пищевых продуктов для исследований бактериологическим методом проводили в соответствии с НД на данный вид продукции. Исследования проводили в соответствии ГОСТ на определенный вид пищевых продуктов и кормов.
Исследования проводили как с искусственно контаминированными пробами, так и с нативными образцами, с одновременной постановкой необходимых контролей.
Для искусственной контаминации образов пищевых продуктов, объектов окружающей среды, кормов использовали десятикратные разведения культур микроорганизмов в концентрации от 106 до 10 м.к./мл.
При исследовании проб воздуха для концентрирования использовали импакторы (происходит принудительное осаждение микроорганизмов из прокачиваемого через прибор воздуха на плотные питательные среды) и импинджеры (микроорганизмы концентрируются при барбатации через стерильный физиологический раствор).
При использовании импакторов микроорганизмы смывали с поверхности плотных питательных сред стерильным физиологическим раствором, центрифугировали, осадок ресуспендировали в буфере для проведения иммунохроматографического анализа.
При использовании импинджеров со стерильным физиологическим раствором, концентрирование микроорганизмов проводили высокоскоростным центрифугированием с последующим
ресуспендированием осадка в буфере для проведения
иммунохроматографического анализа.
Дальнейшие исследования проводили с помощью ИИХЭ, непосредственно исследуя сконцентрированные микроорганизмы (экспресс-анализ), а также проводили обогащение материала в соответствующих питательных средах для повышения чувствительности иммунохроматографического метода.
Пробы почвы отбирали в стерильные колбы. Из общей пробы отбирали навеску для исследований массой (25±1) г, разводили 1:5 - 1:9 стерильным физиологическим раствором, фильтровали через бумажный фильтр. Надосадочную жидкость использовали для дальнейших исследований. Для концентрирования микроорганизмов использовали высокоскоростное центрифугирование или фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм. Осадок ресуспендировали в буфере для проведения иммунохроматографического анализа, встряхивая на вортексе. Затем исследования проводили с помощью ИИХЭ, непосредственно исследуя сконцентрированные микроорганизмы (экспресс-анализ), а также проводили обогащение материала в соответствующих питательных средах.
При исследовании воды в стерильную колбу, отбирали не менее 500 мл пробы (две параллельные пробы) и фильтровали с помощью вакуумной установки через мембранные фильтры («Millipor») с диаметром пор 0,45 мкм. При исследовании воды из открытых водоемов в случае присутствия в образце значительного количества механических примесей, пробу предварительно фильтровали через бумажный фильтр. Для исследований использовали 2 фильтра. Далее проводили элюирование осадка с первого
фильтра, помещая фильтр в стерильный физиологический раствор в объеме 5 мл (при дальнейшем исследовании ИИХЭ). Второй фильтр использовали для дальнейших исследований методом ИИХЭ после обогащения в соответствующей питательной среде. Для проведения процедуры обогащения использовали мясо-пептонный бульон или сердечно-мозговой бульон. Исследуемые образцы инкубировали при температуре 37°С в течение 6- 12 часов.
Смывы с объектов брали с поверхности, размером 10х10 см стерильным тампоном, закрепленном на зонде, смоченном стерильным физиологическим раствором. Отобранную тампоном пробу быстро вносили в пробирку, не доводя до дна 5 мм. Обламывали конец ручки тампона и закрывали крышкой.
При исследовании образцов продовольственного сырья и пищевых продуктов твердые образцы измельчали в гомогенизаторе.
Для проведения экспресс-анализа без обогащения, образцы после гомогенизирования в физиологическом растворе, подвергали низкоскоростному центрифугированию, отбирали надосадочную жидкость, центрифугировали высокоскоростным центрифугированием, осадок ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора. Затем, добавляли 300 мкл буфера для проведения иммунохроматографических исследований. Переносили 120-150 мкл этого раствора по каплям в лунку для внесения образца на иммунохроматографический индикаторный элемент, согласно инструкции по применению ИИХЭ.
При проведении анализа с процедурой обогащения проводили следующую процедуру пробоподготовки.
Из общей пробы отбирают навеску анализируемого образца массой (25±0,1) г или объемом (25±0,1) мл для исследований.
Навеску анализируемого образца массой (25±0,1) г или объемом (25±0,1) мл вносили в стерильную колбу и добавляли 225 мл одной из
следующих питательных сред: трипказо-соевый бульон, сердечномозговой бульон, забуференная пептонная вода. При необходимости анализа других масс (объемов) образца, проводили их посев в перечисленные жидкие питательные среды, в соотношении 1:9 по объему. рН поддерживали в диапазоне ~ 7,2 - 7,6. С целью выравнивания рН питательных сред использовали 0,1 М фосфатно-солевой буферный раствор.
Образцы масла сливочного расплавляли на водяной бане при температуре 35°С - 40°С.
Образцы кондитерских изделий с шоколадом после стадии гомогенизации подвергали фильтрованию через бумажный фильтр до получения прозрачного аналита.
Исследования молочных продуктов (молоко, кисломолочные продукты) не проводили.
Инкубировали пробы в термостате при температуре 37°С в течение 6-12 часов при постоянном перемешивании. Из жидкой питательной среды на различных этапах инкубирования (через 6 и 12 часов) отбирали по 2 мл жидкой фракции, подвергали высокоскоростному центрифугированию, осадок ресуспендировали в 300 мкл физиологического раствора. Экспериментальным путем установлено, что оптимальное время инкубирования при проведении этапа обогащения составляло 12 часов при температуре 37°С. Затем, добавляли 300 мкл буфера для проведения иммунохроматографических исследований. Переносили 120-150 мкл этого раствора по каплям в лунку для внесения образца на иммунохроматографический индикаторный элемент, согласно инструкции по применению ИИХЭ.
Образцы исследовали на месте или отправляли в лабораторию. Транспортирование образцов к месту проведения исследований осуществляли в как можно более сжатые сроки в термоизолирующих
плотно закрывающихся контейнерах, приспособленных для
транспортирования биологического материала. В лабораторных условиях отобранные образцы извлекали и подготавливали для дальнейших исследований.
Подготовка проб для исследований и проведение исследований представлена на схеме (рисунок 1).
Отбор проб
і
Твердые образцы вода воздух
1 і і
Г омогенизирование (для твердых образцов) К онцентрирование фильтрованием Концентрирование (с помощью импинджера)
и 21 и 21 1і 2і
Концентрированные образцы 1 Концентрированные образцы 2
і і
добавление среды обогащения в соотношении 1:5 (для образцов Добавление буфера для проведения иммунохроматографии
окружающей среды,
продовольственного пищевых продуктов) (для проб кормов - сырья и 1:10)
і
инкубирование при оптимальных режимах в течение 12 часов
Концентрование микроорганизмов центрифугированием______________
і
Добавление буфера для проведения ______иммунохроматографии______
і
Иммунохроматографическая реакция с помощью ИИХЭ
Рис. 1. Схема индикации микроорганизмов с помощью
иммунохроматографии
Объем пробы, необходимой для анализа с помощью ИИХЭ составлял 100-150 мкл. На пластину ИИХЭ в окошко для внесения пробы по каплям (20 мкл) вносили исследуемый аналит. Время экспозиции составляло 20-30 мин.
Результаты исследований оценивали визуально по наличию 2-х окрашенных полос на мембране ИИХЭ. Четкое появление двух окрашенных полос указывает на наличие в пробе искомых микроорганизмов.
Полученные результаты показывают, что чувствительность аналитических систем на основе иммунохроматографии с использованием коллоидного золота составляла 105...1х106 м.к./мл. Объем пробы для анализа с помощью ИИХЭ не превышал 100-150 мкл, а время 20-30 мин. Таким образом, 105...1х106 микробных клеток нанесенных на ИИХЭ приводил к аналитическому эффекту.
При отсутствии в пробе определяемого антигена меченые антитела доходят до участка полоски с иммобилизованным антигеном. Далее иммунный комплекс продвигается до участка полоски с иммобилизованными антивидовыми антителами. На этом месте начнет формироваться антивидовой иммунный комплекс, который приведет к образованию окрашенной контрольной зоны. Окраска в контрольной зоне должна образовываться всегда и служить контролем сохранности тест-полоски для использования. Отсутствие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что иммунореагенты на тест-полоске неактивны и, следовательно, результаты анализа оценить нельзя.
При проведении исследований на модельных системах различных микроорганизмов положительная реакция наблюдалась только в гомологичных системах. Перекрестных реакций с гетерологичными бактериями, включая близкородственные виды, не наблюдалось.
Результаты изучения специфичности иммунохроматографического метода представлены в таблице 1.
Результаты исследований, полученные иммунохроматографическим методом, были специфичны с гомологичными и гетерологичными культурами микроорганизмов.
Таблица 1.
Изучение специфичности иммунохроматографического метода при исследовании объектов внешней среды
Наименования культур микроорганизмов (105 м. к./мл) ИИХЭ на сальмонеллы группы В
1 Escherichia coli HB 101 -
2 Escherichia coli штамм K88 -
3 Escherichia coli штамм 0139 -
4 Salmonella thyphimurium (B) +
5 Salmonella dublin (D) -
6 Salmonella enteritidis (D) -
7 Salmonella anatum -
8 Klebsiella pneumonia 53(4/53) -
9 Klebsiella pneumonia 72(4/72) -
10 Yersinia pseudotuberculosis II (12/2) -
11 Yersinia pseudotuberculosis III (12/3) -
12 Yersinia enterocolitica O3 (12/4) -
13 Yersinia enterocolitica O9 (12/5) -
14 Pseudomonas aeruginosa H-1 (1/25) -
15 Pseudomonas aeruginosa РАО-1 (1/32) -
16 Pseudomonas putida1301 (1/54) -
17 Pseudomonas fluorescens 4125 (1/18) -
18 Proteus mirabilis (0/6) -
19 Proteus vulgaris (0/7) -
20 Morganella morganii 01 (3/41) -
21 Morganella morganii 045 (3/44) -
«+» - положительный результат реакции «-» - отрицательный результат реакции
Проверку чувствительности метода индикации с помощью ИИХЭ проводили с десятикратными разведениями культур микроорганизмов. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Результаты индикации сальмонелл группы В
при искусственной контаминации
Наименование, микроорганизма Концентрация, м.к./мл Иммунохроматографический метод
без стадии После обогащения (12 обогащения ч)
Исследование проб воздуха
Salmonella thyphimuriun (группа В) 109 + +
108 + +
107 + +
106 + +
105 + +
104 - +
103 - +
102 - +
10 - +
Исследование проб воды
Salmonella thyphimuriun (группа В) 109 + +
108 + +
107 + +
106 + +
105 + +
104 - +
103 - +
102 - +
10 - +
Исследование проб почвы
Salmonella thyphimuriun (группа В) 109 + +
108 + +
107 + +
106 + +
105 + +
104 - +
103 - +
102 - +
10 -
Исследование смывов
Salmonella thyphimuriun (группа В) 109 + +
108 + +
107 + +
106 + +
105 + +
104 - +
103 - +
102 - +
10 - +
С помощью указанной методики, проводили мониторинговые исследования различных объектов на присутствие сальмонелл группы В. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Результаты исследований объектов внешней среды при анализе нативных образцов на наличие бактерий рода Salmonella
Наименование объекта исследований Иммунохроматографический метод
без стадии обогащения После обогащения (12 ч)
Исследование проб воздуха 1 - -
Исследование проб воды 2 - -
Исследование проб почвы 3 - -
Исследование смывов 4 - 5
1 - всего исследовано 144 пробы воздуха
2 - всего исследовано 205 проб воды
- всего исследовано 144 пробы почвы 4 - всего исследовано 250 смывов Заключение
Проведена адаптация иммунохроматографических индикаторных элементов для выявления бактерий рода Salmonella группы В в объектах окружающей среды, продовольственном сырье, пищевых продуктах и кормах для животных. Разработаны схемы индикации бактерий в конкретных объектах. Полученные на основе проведенных исследований результаты позволяют рекомендовать данный метод для проведения экспресс-анализов как в лабораторных, так и в полевых условиях.
Список использованной литературы:
1. Ярков С.П., Третьяков С.И., Башарова Л. А., Злобин В.Н. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа.- Вестник Российской АМН.- № 12.- 2007.- С. 22-26.
2. Ярков С. П., Скопинская С. Н., Шиленко И. В., Злобин В. Н. /Люминесцентный иммунохроматографический анализ антигенов микроорганизмов// Вестник Российской Академии Медицинских Наук.-М.-2009.- №3.-С. 17-25.
