CC BY
284
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ
УДК 615.35:543.544.5
КОНТРОЛЬ СОПУТСТВУЮЩИХ ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИИ КОКАРБОКСИЛАЗА ГИДРОХЛОРИД МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
В статье изложены результаты разработки методики определения сопутствующих примесей субстанции кокарбоксилаза гидрохлорид, методом прямофазной жидкостной хроматографии. Приведена подробная методика и результаты определения валидационных характеристик. В отличие от используемых в настоящее время методик, разработанная методика позволяет исключить применение органических растворителей, при этом сократить время получения одной хроматограммы до 10 мин. Результаты валидационных исследований свидетельствуют о соответствии методики требованиям фармакопеи.
Ключевые слова: кокарбоксилаза, фосфотиамин, тиамин, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Препараты витамина Ві широко используется в медицинской практике. Одним из таких препаратов является «кокарбоксилаза», представляющий собой хлорид эфир тиамина и пиро-фосфорной кислоты. Этот препарат применяют при легочной и печеночной недостаточности, диабете, сердечной недостаточности, хроническом алкоголизме и ряда других заболеваний [і, 2]. В промышленности кокарбоксилазу получают из тиамина по схеме (рис. і):
ТИАМИНА ГИДРОХЛОРИД КОКАРБОКСИЛАЗЫ ГИДРОХЛОРИД
Рис. 1. Схема получения кокарбоксилазы
В процессе получения кокарбоксилазы образуются также эфир тиамина и о фосфорной кислоты (фосфотиамин), эфир дитиаминмонофосфорной кислоты, а также эфир тиамина и три-о-фосфорной кислоты (рис. 2). Основная часть этих соединений удаляется из конечного продукта в процессе очистки кокарбоксилазы, однако частично, эти вещества попадают в готовую субстанцию кокарбоксилазы.
АА ЗИНЧЕНКО
Украинский научный фармакопейный центр качества лекарственных средств
e-mail:
Zincheno@phukr.kharkov.ua
эфир тиамина и о- фосфорной кислоты эфир тиамина и три-о-фосфорной кислоты (фосфотиамин)
эфир дитиаминмонофосфорной кислоты Рис. 2. Возможные примеси субстанции кокарбоксилазы гидрохлорида
Другой возможной примесью этого препарата может быть не вступивший в реакцию тиамин, а также фосфорная кислота. Таким образом, все перечисленные выше соединения могут быть примесями субстанции кокарбоксилазы, причем как технологическими, так и продуктами распада, за исключением эфира тиамина и три-о-фосфорной кислоты и эфира дитиаминмонофосфорной кислоты. В соответствии с современными требованиями к контролю качества лекарственного препарата, все возможные примеси субстанции кокарбоксилазы подлежат контролю и методика их определения должна быть включена аналитический нормативный документ.
Субстанция кокарбоксилазы в фармакопеях ведущих стан не описана. В СССР было производство этого препарата и по действующей в то время фармакопейной статье содержание примесей контролировали методом ВЭЖХ с использованием колонки размером 80 мм х 2,0 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом. В качестве подвижной фазы применяли раствор фосфатного буферного раствора рН 6,0 с тетрабутиламмонием гидросульфатом и ацетонитрилом в соотношении 95:5. Условия хроматографирования этой методики были ориентированы на использование микроколоночного хроматографа «Милихром», и методика позволяла определять основную примесь кокарбоксилазы - фосфотиамин.
За прошедшие с момента развала СССР годы в Российской Федерации и в некоторых станах СНГ было организовано несколько производств субстанции кокарбоксилазы. Поскольку технологическая схема производства этого препарата практически не изменилась, в нормативную документацию с небольшими изменениями, связанными с размерами колонки и температурным режимом хроматографирования, включали методику, разработанную еще в СССР. Однако с ростом требований к качеству субстанции и появлением на рынке СНГ препаратов европейских и китайских производителей [3] возникла практическая необходимость в методике, которая позволит провести определение всех возможных примесей кокарбоксилазы при минимальных затратах на проведение анализа.
Целью данной работы являлась разработка методики количественного определения возможных примесей, субстанции кокарбоксилазы и изучение основных метрологических характеристик разработанной методики.
Сама субстанция тиамина хлорида описана во всех фармакопеях ведущих стан [4-8]. В фармакопейных монографиях на этот препарат, для определения сопутствующих примесей применяют метод ВЭЖХ. Поскольку тиамин является катионом, в состав подвижной фазы вводят гексансульфонат натрия (или аналогичный реагент), который модифицирует сорбент, превращая колонку фактически в катионо-обменную, что обеспечивает приемлемые характеристики колонки для разделения примесей тиамина. В процессе производства кокарбоксилазы, при введении в структуру молекулы фрагмента пирофосфорной кислоты (рис. 1) тиамин уже входит в структуру аниона. Поэтому для разделения близких по природе сопутствующих примесей можно либо использовать соответствующий йон-парный реагент, как это было сделано в методике, разработанной в СССР, либо применить анионо-активную колонку. Сравнивая основные характеристики двух вариантов методики, такие как время получения одной хроматограммы,
стоимость растворителей, реактивов и расходных материалов, предпочтение отдали второму варианту.
В литературе описано несколько методик совместного определения тиамина, фосфоти-амина и кокарбоксилазы. В большинстве работ определение проводят на колонке с обращенно-фазовым сорбентом с группами С18 или амид-С1б [9-11] или на двух последовательно соединенных колонках с октильными и аминными группами [12]. Во всех этих работах в качестве подвижной фазы применяют смесь фосфатного буферного раствора и ацетонитрила или метанола. В разработанной авторами методике использовали одну колонку, заполненную сорбентом с привитыми пропиламинными группами. Этот сорбент позволяет получить приемлемое разделение определяемых веществ с использованием подвижной фазы, состоящей только из воды с добавками фосфорной кислоты. Изменяя концентрацию фосфорной кислоты, можно менять время удерживания и коэффициент симметрии пика кокарбоксилазы, а также коэффициент разделения пиков тиамина и фосфотиамина и время получения одной хроматограммы (рис. 3).
2330303;
Рис. 3. Хроматограммы модельного раствора, полученные при использовании подвижной фазы с концентрацией фосфорной кислоты от 0,025% до 0,500%
Характеристики хроматографической системы при использовании подвижной фазы с концентрацией фосфорной кислоты от 0,025% до 0,500% представлены в табл. 2.
Таблица 2
Характеристики хроматографической системы, при использовании подвижной фазы с концентрациями фосфорной кислоты от 0,025% до 0,500%
Наименование вещества Характеристика Концентрация фосфорной кислоты в ПФ (в %)
0,025 0,050 0,100 0,250 0,500
Тиамин Время удерживания (мин.) 2,231 2,291 2,383 2,522 2,628
Коэффициент симметрии Тю% 1,339 1,337 1,329 1,326 1,321
Эффективность хроматографической системы (теор. тарелки) 2906 3061 3359 3758 3932
Фосфотиамин Время удерживания (мин.) 2,574 2,680 2,842 3,050 3,187
Коэффициент симметрии Тю% 1,393 1,369 1,355 1,340 1,338
Эффективность хроматографической системы (теор. тарелки) 3473 3709 4217 4823 5090
Коэффициент разделения тиамин/фосфотиамин 2,015 2,272 2,703 3,108 3,229
Кокарбоксилаза Время удерживания (мин.) 12,407 9,942 8,773 8,021 7,652
Коэффициент симметрии Тю% 2,801 2,641 2,508 2,198 2,096
Эффективность хроматографической системы (теор. тарелки) 7277 7301 7459 8313 8624
Уменьшение времени удерживания пиков кокарбоксилазы с увеличением концентрации фосфорной кислоты в подвижной фазе можно объяснить процессом вытеснения фосфат-
ионами фосфорной кислоты фрагментов пирофосфорной кислоты кокарбоксилазы с активных центров сорбента. При этом возрастает количество фосфат-ионов, которые взаимодействуют с аминными группами неподвижной фазы, т.е. на определенный момент времени эта часть фосфат-ионов становится неподвижной. С этими неподвижными ионами взаимодействуют фос-фотиамин и тиамин, за счет чего происходит увеличение времени удерживания и возрастает коэффициент разделения этих веществ.
Исходя из хроматограмм, представленных на рис. 3, предпочтение, с точки зрения критериев хроматографического разделения, можно было бы отдать подвижной фазе с максимальной концентрацией фосфорной кислоты - 0,5%. Но учитывая, что с ростом концентрации кислоты время эксплуатации колонки снижается, была выбрана подвижная фаза, содержащая
0,1% фосфорной кислоты.
В ходе проведения предварительных исследований на 5 сериях препарата производства ГП «Завод химических реактивов», Украина, было установлено, что эфир тиамина и три-о-фосфорной кислоты в препарате отсутствует, поэтому в разработанную методику не было включено определение этого вещества.
Материалы и оборудование.
При разработке методики и изучении валидационных характеристик использовали жидкостный хроматограф модели LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония) следующей комплектации: два насоса LC-20AD, спектрофотометрический детектор SPD-20AV, автоматический инжектор SIL-20, термостат колонок СТО-20А.
Колонка стальная, размером 150 мм х 4,0 мм, заполненная сорбентом «ReproSil-Pur NH2», размер частиц 3 мкм, производство «Dr. Maisch», Германия.
Тиамин монофосфат хлорид дигидрат (фосфотиамин) - производство Sigma-Aldrich, кат № Т8637, с содержанием основного вещества 99,9 %.
Кокарбоксилаза, субстанция - производства ГП «Завод химических реактивов», Украина, содержание основного вещества 99,88 %.
Образец эфира дитиаминмонофосфорной кислоты получен в лабораторных условиях, при реакции избытка тиамина гидрохлорида с фосфорным ангидридом.
При хроматографировании использовали трижды перегнанную воду с электропроводимостью 0,9 мкСм.
Методика.
Приготовление испытуемого раствора. Около 50 мг (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл подвижной фазы (ПФ), доводят объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фторопластовый фильтр с размером пор не более 0,5 мкм.
Приготовление раствора сравнения фосфотиамина. Около 30 мг (точная навеска) стандартного образца (СО) фосфотиамина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 80 мл ПФ, доводят объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивают (исходный раствор фосфотиамина).
3.0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора ПФ до метки и перемешивают.
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы. 30 мг тиамина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 80 мл ПФ, доводят объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивают.
3.0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 3,0 мл исходного раствора фосфотиамина, доводят объём ПФ до метки и перемешивают.
Измерение:
По 5 мкл испытуемого раствора, раствора сравнения фосфотиамина и раствора для проверки пригодности хроматографической системы хроматографируют на жидкостном хроматографе в следующих условиях:
- колонка стальная, размером 150 мм х 4,0 мм, заполненная сорбентом «ReproSil-Pur NH2», размер частиц 3 мкм;
- подвижная фаза - 0,1 % раствор кислоты фосфорной;
- скорость ПФ - 0,5 мл/мин;
- температура колонки - 35 оС;
- длина волны детектирования - 250 нм.
Содержание фосфотиамина и любой другой примеси в препарате (Х), в процентах, рассчитывают по формуле:
Si х mo х 50 х Эх P х100 Si х mo х Эх P
X =--------------------=-------------,
So х m х100 х100 х100 So х m х 200
где So - среднее значение площади пика фосфотиамина, рассчитанное из хроматограмм раствора сравнения фосфотиамина;
Si - среднее значение площади пика фосфотиамина или любой другой примеси, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора;
mo - масса навески фосфотиамина, в миллиграммах; m - масса навески препарата, в миллиграммах;
Р - содержание основного вещества в СО фосфотиамина, в процентах.
Содержание фосфотиамина в препарате должно быть не более i,o %.
Содержание любой другой примеси, в пересчете на фосфотиамин, в препарате должно быть не более o,l %.
Суммарное содержание фосфотиамина и других примесей, в пересчете на фосфотиамин, должно быть не более i,o %.
В качестве критериев пригодности хроматографической системы использованы:
- эффективность хроматографической системы, рассчитанная по пику фосфотиамина на хроматограммах раствора сравнения фосфотиамина которая должна быть не менее 3500 теоретических тарелок;
- коэффициент разделения пиков тиамина и фосфотиамина, рассчитанный из хроматограмм раствора для проверки пригодности хроматографической системы, должен быть не менее 2;
- относительное стандартное отклонение площадей пиков фосфотиамина, рассчитанное из хроматограмм раствора сравнения фосфотиамина, должно быть: для з параллельных введений - не более 1,з4 %; для 4 параллельных введений - не более 1,92 %; для 5 параллельных введений - не более 2,з7 % [13].
Типичные хроматограммы раствора сравнения испытуемого раствора препарата, СО фос-фотиамина и раствора для проверки хроматографической системы представлены на рис. 4-6.
Рис. 4. Хроматограмма испытуемого раствора
Рис. 5. Хроматограмма раствора сравнения фосфотиамина
Рис. 6. Хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографической системы
Валидация методики:
В соответствии с [l4], валидацию методики проводили по характеристикам селективность, правильность, прецизионность (сходимость), линейность и диапазон применения.
Кроме того, была рассчитана предельная расчетная неопределенность методики количественного определения фосфотиамина и определен предел обнаружения фосфотиамина. Все расчеты критериев приемлемости валидационных характеристик были рассчитаны и приняты как для испытаний количественного определения сопутствующих примесей, т.е. неопределенность результата методики не должна превышать 5%.
Селективность методики подтверждается полным разделением пиков тиамина, фос-фотиамина, эфира дитиаминмонофосфорной кислоты и кокарбоксилазы. А также совпадением времен удерживания перечисленных веществ на хроматограммах испытуемого раствора или модельных растворов с временем удерживания основных пиков на хроматограммах растворов сравнения (рис. 7).
Рис. 7. Хроматограммы модельного раствора препарата с добавкой фосфотиамина (l), испытуемого раствора (2), раствора сравнения фосфотиамина (з), раствора для проверки пригодности хроматографической системы (4), раствора тиамина (5), раствора эфира дитиаминмонофосфорной кислоты (6) и растворителя (7)
Исследование характеристик правильность, прецизионность (сходимость), линейность и диапазон применения проводили на модельных растворах препарата с добавками фосфотиа-мина в концентрациях, соответствующих диапазону от 25% до 225% по отношению к предельно допустимой концентрации (для данного случая - 1,0%). Выбор этого диапазона обусловлен значительным разбросом предельно допустимой концентрации фосфотиамина в кокарбоксила-зе разных производителей (от 1% до 4%) и данными производителей субстанции о реальном содержании фосфотиамина в препарате.
Полученные при хроматографировании модельных растворов результаты приведены в
табл.3.
Таблица 3
Результаты анализа модельных растворов, содержащих от 25 % до 225 % фосфотиамина по отношению к предельно допустимой концентрации, и их статистическая обработка
№ раствора Введено в % от номинальной концентрации (Xi, факт., %) Найдено в % от номинальной концентрации (Yi, %) Найдено в % к введенному Zi = 100 • (Yi/Xi)
1 25 24,86 99,43
2 50 49,49 98,99
3 75 75,60 100,80
4 100 100,38 100,38
5 125 125,22 100,17
6 150 149,79 99,86
7 175 174,28 99,59
8 200 199,00 99,50
9 225 225,58 100,26
Среднее, Zcp, % = 99,886
Относительное стандартное отклонение, RSDz, % = 0,566
Относительный доверительный интервал Az % = t (95 %, 9 - 2) x RSDz = 1,895 x 0,566 = 1,076
Критическое значение для сходимости результатов Aas, % = 1,6
Систематическая ошибка 5 % = | Zср - 100 | = 0,114
Критерий незначимости систематической ошибки:
1) статистическая незначимость: 5 < Az : V9 = 1,076 : 3 = 0,359 % > 0,114 % Выполняется
Если не выполняется 1), то 5 < max 5: 2) практическая незначимость: 5% < 0,32 х 1,6 = 0,51 % > 0,114 % Выполняется
Общий вывод о методике КОРРЕКТНА
Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что методика количественного определения фосфотиамина не имеет статистически значимой систематической ошибки, характеризуется достаточной правильностью и сходимостью (прецизионность) во всем диапазоне концентраций (от 25 % до 225%) и является корректной.
График линейной зависимости найденного количества фосфотиамина от введенного и результаты статистической обработки представлены на рис. 8 и в табл. 4.
Рис. 8. Линейная зависимость найденной концентрации фосфотиамина от его введенной концентрации (в нормализованных координатах)
= 100
=
>
1 I 1 I 1 I 1 I linear Regression for Phosph-in В:
Y = A + В * X
Param Value sd
A 0,06112 0.4428
-B 0,9988 0,00315 m -
R = 0.99997 ¿S
SD = 0,60951, N = 9
P = 8.1484E-16 ^
- Jr -
О 50 100 1S0 200
X введенная концентрация фосфотиамина, в % по отношению к ЦДК
Таблица 4
Метрологические характеристики линейной зависимости найденной концентрации фосфотиамина от его введенной концентрации
Параметры Значения Требования l Требования 2 Заключение
b 0,9988
Sb 0,00315
a 0,006112 < |1,88 I <| 0,6831 Выдерживается по l критерию
Sa 0,4428
RSDo 0,60951
RSDo/b 0,6102 < 10,841 Выполняются
r 0,99997 >|o,99988| Выполняются
Как следует из представленных данных, требования к параметрам линейной зависимости выполняются, то есть линейность методики количественного определения фосфотиамина подтверждается в диапазоне концентраций от 25% до 225% от предельно допустимого значения.
Неопределенность методики (Ла) складывается из неопределенности внесенной пробо-подготовки Ç^sp) и неопределенности конечной аналитической операции - хроматографирования и расчета площадей пиков определяемого вещества (Леао):
AAs = V ASP + AFAO
Расчетная неопределенность операций приготовления испытуемого раствора и раствора сравнения препарата составляет o,87 %. Неопределенность конечной аналитической операции рассчитывали по результатам хроматографирования модельного раствора с концентрацией фосфотиамина соответствующей предельно допустимой (l%) и раствора сравнения фосфотиа-мина. Суммарное значение неопределенности результатов конечной хроматографической операции, по трем параллельным хроматограммам каждого из растворов составляет o,95%. Отсюда следует, что суммарная неопределенность методики (4as) составляет l,3%. Это значение не превышает предельно допустимую величину - 1,6%.
Проведенные исследования основных валидационных характеристик методики определения фосфотиамина и других сопутствующих примесей препарата кокарбоксилаза, субстанция показывают, что по характеристикам селективность, правильность, прецизионность (сходимость), линейность, разработанная методика удовлетворяет фармакопейным требованиям [l4] к методикам количественного определения сопутствующих примесей.
Выводы.
1. Разработана методика определения сопутствующих примесей в субстанции кокар-боксилазы методом ВЭЖХ. Методика отличается от используемой в настоящее время низкой себестоимостью одного анализа и значительным сокращением времени получения одной хроматограммы (менее lo мин.).
2. Исследование основных валидационных характеристик методики показало, что методика соответствует требованиям, предъявляемым к методикам количественного определения сопутствующих примесей.
1. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая Волна, 2006. - 1200 с.
2. Островский Ю.М. Кокарбоксилаза и другие тиамин'-фосфаты / Ю.М. Островский. - Минск: Наука и техника, 1974.
3. Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. - 15-й вып / Гл.ред. Г.Л.Вышковский, - М.: РЛС-2007, 2006. - С.1488.
4. European Pharmacopoeia. 7th ed. - Strasbourg: Council of Europe, V1,V2. 2010. - 3265 p
5. The Japanese Pharmacopeia XVI ed. - 2011. - 2319 p.
6. United States Pharmacopeia. 30 ed.- Rockville, 2010 - 2569 p
7. Pharmacopeia of the people’s Rebublic of China (English Edition 2005) Vol. Ila, ^emical Industry
Press, Beijng, 2005 - p 830
8. Кузьмин, С.В. Ион-парная обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография в идентификации и количественном определении примеси фосфотиамина в гидрохлориде ко-карбоксилазы / С.В. Кузьмин, Е.Е. Ишина, М.Л. Шишкова, В.А. Козлов // Хим-фарм. журн. - 1997. - Т 31, № 5. - С.54-56.
9. F. Aguilar, U.R. Charrondiere, B. Dusemund, P. Galtier, J. Gilbert, D.M. Gott, S. Grilli, R. Guertler, G.E.N. Kass, J. Koenig, C. Lambre, J-C. Larsen, J-C. Leblanc, A. Mortensen, D.Parent-Massin, I. Pratt, I. Rietjens, I. Stankovic, P. Tobback, T. Verguieva, R. Woutersen., Benfotiamine, thiamine monophosphate chloride and thiamine pyrophosphate chloride, as sources of vitamin B1 added for nutritional purposes to food supplements., The EFSA Journal (2008) 864, p. 1-31.
10. Бендрышев А.А. Определение водорастворимых витаминов в витаминных комплексах, премиксах, биологически-активных добавках и фармацевтических препаратах методом высокоэффективной хроматографии с градиентным элюированием / А.А. Бендрышев, Е.Б. Пашкова, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Химия. - 2010. - Т.51, №4.
11. Rada Amidzic, Jasmina Brboric, Ol.Ivera Cudina and Sote Vladimirov, RP-HPLC Determination of vitamins B1, B3,B6, folic acid and B12 in multivitamin tablets, О. Serb. Chem. Soc. 70 (10) 1229-1235 (2005).
12. S. Backermann, C. Poel, W. Ternes., Thiamine Phosphates in Egg Yolk Granules and Plasma of Regular and Embryonated Eggs of Hens and in Five - and Seven-Day-Old Embryos. Poult. Sci., (2008) 87, 108-115.
13. Державна Фармакопея Украши / Держ. Пвдпр-во «Науково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид. - Харюв: Р1РЕГ, 2001. - Доповнення 1, 2004. - 520 с.
14. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств / Под ред. Н.В. Юргеля, А.Л. Младенцева, А.В. Бурдейна и др.; Разработчики В.Л. Багирова, А.И. Гризодуб, Т.Х. Чибиляев, Д.А. Леонтьев, Н.А. Ляпунов и др. - М.: Фармацевтическая промышленность, 2007. - 58 с.
CONTROL OF RELATED SUBSTANCE IMPURITIES IN COCARBOXYLASE HYDROCHLORIDE BY METHOD OF HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Литература
Ukrainian research center pharmaceutical grade quality of medicines
E-mail:
zinchenko@phukr.kharkov.ua
A.A. ZINCHENKO
The article presents results of the development of methods for determining the substance associated impurities kokarboksilaza hydrochloride pryamofaznoy by liquid chromatography. Provides a detailed definition of the method and results validation characteristics. Unlike the currently used techniques developed method avoids the use of organic solvents , and the time of reception of a chromatogram to 10 minutes . The results of validation studies suggest methods according to Pharmacopeia.
Key words: kokarboksilaza , fosfotiamin , thiamine, high performance liquid chromatography
