CC BY
23
Since 1999 «JxJJT Ö ttvL«, P " ISSN 2226-7425
E - ISSN 2412-9437
The journal of scientific articles Журнал научных статей
iSSji Здоровье
& millennium '^L^^yjp^^Ijs/ ^ в XXI веке
Education ^образование
УДК 615.072:543.544.5.068.7
КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ СУБСТАНЦИИ Э-МЕТИЛ-8-ПИПЕРАЗИНО-7-(ТИЕТАНИЛ-3)-1-ЭТИЛКСАНТИНА ГИДРОХЛОРИДА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Валиева А.Р., Исакова А.В., Халиуллин Ф.А.
ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа, Российская Федерация.
Аннотация. Исследована возможность применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в контроле чистоты субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. Изучено хроматографическое поведение субстанции и примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в разных системах элюента. Разработана методика определения и проведена стандартизация содержания примеси исходного продукта 8-бром-3-метил-7-(тие-танил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. Ключевые слова: ксантины, высокоэффективная жидкостная хроматография, примеси.
Производные ксантина широко применяются в качестве средств, корректирующих систему гемостаза [1]. В настоящее время среди них продолжается поиск более эффективных и менее токсичных биологически активных соединений [2]. Синтезированы новые тие-тансодержащие производные 1-этилксантина, среди которых обнаружены соединения, проявляющие ан-тиагрегационную активность [3]. Одним из перспективных соединений, оказывающих выраженное антиа-грегационное действие, является 3-метил-8-пипера-зино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид [4]. Для получения разрешения на проведение клинических испытаний, помимо доклинического исследования биологической активности, необходимо разработать методики контроля качества синтезированного соединения, в том числе контроль посторонних примесей в субстанции.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) широко применяется в анализе лекарственных веществ и включена практически во все действующие фармакопеи [5, 6]. Данный метод отличается высокой чувствительностью и разделяющей способностью, возможностью исследования практически любых веществ за короткий промежуток времени. Поэтому ВЭЖХ является наиболее оптимальным методом для определения примеси исходного продукта в субстанции 3 -метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1 -этилксантина гидрохлорида.
Цель работы. Разработка методики определения примеси исходного продукта в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида методом ВЭЖХ.
Материалы и методы. В качестве объектов исследования нами использованы 6 опытных серий субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксан-тина гидрохлорида и образец исходного продукта 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина.
Исследование проводили на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence фирмы Shimadzu. Для проведения анализа были выбраны следующие хроматогра-фические условия:
- хроматографическая колонка из нержавеющей стали (150 х 4,6 мм), заполненная обращённо-фазовым сорбентом Discovery® С18 с размером частиц 5 мкм;
- объем раствора вводимой пробы - 20 мкл;
- подвижная фаза (ПФ): смесь ацетонитрила и 0,125 % водного раствора фосфорной кислоты в объемном соотношении 6:4;
- режим элюирования - изократический;
- скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин;
- детектор спектрофотометрический при двух длинах волн (X) - 282 нм и 290 нм.
Для проведения исследования приготовлены следующие растворы:
- испытуемый раствор: 0,01 г (точная навеска) субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора ПФ до метки и перемешивают;
- раствор примеси: 0,01 г (точная навеска) примеси 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл ПФ при нагревании, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора ПФ до метки и перемешивают;
- раствор сравнения: 1 мл раствора примеси переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора ПФ до метки и перемешивают, далее 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора ПФ до метки и перемешивают;
- раствор для проверки пригодности хроматографи-ческой системы: к 1 мл испытуемого раствора добавляют 1 мл раствора примеси и перемешивают.
Результаты и обсуждение. Синтез субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3 )-1-этилксантина гидрохлорида осуществляют реакцией 8-бром-3-ме-тил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина с пиперазина гек-сагидратом в среде этанола с последующим взаимодействием полученного 3-метил-8-пиперазино-7-(тие-танил-3)-1-этилксантина с хлороводородной кислотой в диоксане (схема 1) [4].
(3)
Схема 1
С целью контроля чистоты проводили хроматогра-фирование субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тие-танил-3)-1-этилксантина гидрохлорида в разных условиях. В результате установили, что на хроматограмме помимо пика основного вещества, содержится один пик посторонней примеси. Наиболее вероятной примесью в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида может быть исходный 8-бром-3 -метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантин. Поэтому в аналогичных условиях проводили хромато-графирование исходного продукта. По результатам хроматографирования в разных условиях время удерживания 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксан-тина совпадало со временем удерживания пика примеси, содержащейся в субстанции 3-метил-8-пипера-зино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. В связи с этим возникла необходимость подобрать оптимальные условия для эффективного разделения ве-
ществ за минимальное время анализа и стандартизовать содержание примеси исходного 8-бром-3-метил-
7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-
8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. Наиболее приемлемое разделение достигалось при объемном соотношении ацетонитрила и 0,125 % водного раствора фосфорной кислоты 6:4. В подобранной ПФ изучен характер спектров поглощения в УФ области и выбраны аналитические длины волн для исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксан-тина и субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида, которые составили 282 нм и 290 нм соответственно. Определение примеси проводили одновременно при двух длинах волн. Последовательно хроматографировали раствор для проверки пригодности хроматографической системы (рис. 1а, 1б), испытуемый раствор (рис. 2а, 2б) и раствор сравнения (рис. 3а, 3б). Определение проводили на всех 6 сериях субстанции.
Рис. 1а. Хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографической системы при X = 290 нм
СНз
mV
200
150-
100
50
10.0 min
Рис. 1б. Хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографической системы при X = 282 нм
400
200-
100
i.'J 3.0 4.0 50
—I—
7.5
0.0 2.5 5.0
Рис. 2а. Хроматограмма испытуемого раствора при X = 290 нм
mV
0.0 2.5 5.0 7.5
Рис. 26. Хроматограмма испытуемого раствора при X = 282 нм
0.0 2.5 5.0 7.5
Рис. За. Хроматограмма раствора сравнения при X = 290 нм
10.0 min
400 f
300 ; ,
I •J CD
ÜU0- I ■O 25 -O 50 -O 75
100 \ s 0
_ J
f
10.0 min
m V
-0.5
-1.0
-1-1-1-1-1-1-i-1-.-1-.-1-i-1 ] I I I I
0.0 2.5 5.0 7.5 100
min
Рис. 36. Хроматограмма раствора сравнения при X = 282 нм
Проведенное исследование показало, что методика хроматографирования является специфичной, поскольку на хроматограммах растворов для проверки пригодности системы наблюдаются четкое разделение пиков анализируемых веществ (рис. 1а, б). По полученным результатам анализа на всех 6 сериях были оценены параметры, характеризующие пригодность хро-матографической системы (табл. 1). Фактор асимметрии для субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиета-нил-3)-1-этилксантина гидрохлорида составляет 2,1,
для примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина - 1,8, разрешение пиков составляет не менее 3 при обеих длинах волн. Представленные данные позволяют рекомендовать подобранную систему для определения примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3 )-1-этилксантина гидрохлорида.
Таблица 1
Хроматографические параметры растворов для проверки пригодности хроматографической системы
Номер Время удерживания, Площадь Фактор асимметрии Разрешение
серии мин
282 290 282 290 282 нм 290 282 нм 290 нм
нм нм нм нм нм
1 2,160 2,159 4052057 4663333 2,171 2,171 0,000 0,000
3,878 3,877 4115118 3575558 1,807 1,806 3,064 3,064
2 2,164 2,162 4420565 5082084 2,119 2,119 0,000 0,000
3,865 3,863 4404379 3825769 1,777 1,777 3,043 3,043
3 2,162 2,160 4217907 4853149 2,100 2,097 0,000 0,000
3,864 3,863 4174904 3626443 1,777 1,777 3,024 3,024
4 2,175 2,174 4000992 4598902 2,113 2,111 0,000 0,000
3,880 3,878 3956609 3440547 1,770 1,768 3,030 3,029
5 2,177 2,175 3840652 4413693 2,103 2,100 0,000 0,000
3,874 3,872 3844317 3343301 1,757 1,756 3,023 3,023
6 2,173 2,171 4100028 4718442 2,126 2,125 0,000 0,000
3,880 3,879 4075919 3543297 1,783 1,782 3,043 3,043
Таким образом, хроматографический анализ 6 опытных серий субстанции показал, что в 3 сериях из 6 содержится примесь исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина (табл. 2). Площадь пика примеси на хроматограмме испытуемого раствора не превышает площади пика на хроматограмме раствора сравнения. Согласно ОФС.1.1.0006.15 «Фармацевтические субстанции» родственные примеси в фармацевтических субстанциях с содержанием выше 0,05% должны контролироваться, а выше 0,1% должны быть
идентифицированы. Максимальное содержание примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина не превышает 0,069% при 282 нм и 0,056% при 290 нм. Полученные результаты анализа показывают, что разработанную методику можно рекомендовать для определения примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. Для более объективного
контроля чистоты необходимо разработать государственный стандартный образец примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина.
Таблица 2
Данные хроматограммы испытуемых растворов и растворов сравнения
Номер серии Название растворов Время удерживания, мин Площадь Площадь, %
282 нм 290 нм 282 нм 290 нм 282 нм 290 нм
1 Испытуемый раствор 2,156 2,154 8247560 9519187 99,950 99,966
3,874 3,862 4165 3270 0,050 0,034
Раствор сравнения 3,880 3,889 9088 8018 100,000 100,000
2 Испытуемый раствор 2,172 2,170 8437277 9727343 99,956 99,964
3,859 3,849 3723 3525 0,044 0,036
Раствор сравнения 3,848 3,846 9315 7924 100,000 100,000
3 Испытуемый раствор 2,162 2,160 8264251 9528482 100,000 100,000
- - - - - -
Раствор сравнения 3,839 3,840 8695 7831 100,000 100,000
4 Испытуемый раствор 2,168 2,167 8397222 9678050 100,000 100,000
- - - - - -
Раствор сравнения 3,844 3,850 9228 7820 100,000 100,000
5 Испытуемый раствор 2,164 2,162 8304472 9575338 99,931 99,944
3,857 3,852 5742 5326 0,069 0,056
Раствор сравнения 3,872 3,861 9431 8086 100,000 100,000
6 Испытуемый раствор 2,176 2,175 8008734 9228296 100,000 100,000
- - - - - -
Раствор сравнения 3,858 3,863 9403 7809 100,000 100,000
Выводы
1. Разработана методика определения примеси исходного продукта 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида с помощью метода ВЭЖХ. Для более объективного контроля чистоты необходимо разработать государственный стандартный образец примеси исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина.
2. Примесь исходного 8-бром-3-метил-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина в субстанции 3-метил-8-пипера-зино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида не превышает 0,1%.
3. Разработанная методика определения примеси может быть использована при составлении проекта нормативной документации на субстанцию 3-метил-8-пиперазино -7-(тиетанил-3)-1 -этилксантина гидрохлорида.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородова А.И., Халиуллин Ф.А., Муратаев Д.З. Влияние новых солей
3-метил-1-этилксантина на систему гемостаза // Современные проблемы науки и образования. 2012. №6. С. 247.
[2] Валеева Л.А., Давлятова Г.Г., Шабалина Ю.В., Ураз-баев М.А., Халиуллин Ф.А. Антидепрессивные свойства 3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)-8-циклогекси-ламино-1-этилксантина // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2016. Т. 18. № 1. С.319-323.
[3] Шабалина Ю.В., Халиуллин Ф.А., Спасов А.А., Науменко Л.В., Сысоева В.А. Синтез и антиагрегантная активность 8-аминозамещенных 1-алкил-3-метил-7-(тиетанил-3) ксантинов // Химико-фармацевтический журнал. 2009. Т.43. №12. С. 7-9.
[4] 3-Метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид, проявляющий антиагрегационную и дез-агрегационную активность: пат. 2404181 Рос. Федерация. №. 2009121001/04; заявл. 02.06.2009; опубл. 20.11.2010. Бюл. № 32. - 5 с.
[5] Государственная Фармакопея Российской Федерации. Изд. XIII. Т.1. М. 2015. URL: http://feml.scsml.rssi.ru/feml.
[6] Европейская фармакопея: в 3 т. пер. с англ. - ООО «ГРУППА РЕМЕДИУМ», Москва, 2014. - Т. 1. - 2032 с.
PURITY CONTROL OF THE 3-METHYL-8-PIPERAZINO-7-(THIETHAN-3)-1-ETHYLXANTHINE HYDROCHLORIDE SUBSTANCE BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Valieva A. R., Isakova A. V., Khaliullin F. A.
Federal State-Funded Educational Institution, Ufa, Russian Federation.
Annotation. The applicability of high-performance liquid chromatography for the purity control of the substance of 3-methyl-8-pi-perazino-7-(thiethan-3-yl)-1-ethylxanthine hydrochloride was investigated. The chromatographic behaviors of the substance and the starting 8-bromo-3-methyl-7-(thiethan-3-yl)-1-ethylxanthine impurity were studied for different eluent systems. In the selected system, the UV spectra of the compounds were measured and the maximum absorption wavelengths were chosen. A procedure for determining and standardizing the content of the starting 8-bromo-3-methyl-7-(thiethan-3-yl)-1-ethylxanthine impurity in the 3-methyl-8-piperazino-7-(thiethan-3-yl)-1-ethylxanthine hydrochloride substance was developed. Key words: xanthines, high-performance liquid chromatography, impurities.
REFERENCES
[1] Kamilov F. Kh., Timirkhanova G.A., Samorodova A.I., Khaliullin F.A., Murataev D.Z. The screening of active compounds in derivative 3-methyl-1-ethylxanthine affecting hemostasis // Modern problems of science and education. 2012. №6. C. 247.
[2] Valeeva L.A., Davlyatova G.G., ShabalinaJu.V., Urazbaev M.A., Khaliullin F.A. Antidepressant prorerties of 3-me-thyl-7-(1,1-dioxothiethanyl-3)-8-cyclogexiamino-1-ethylxantin // Zhurnal nauchnykh statei «Zdorov'e i obra-zovanie v XXI veke», 2016, vol. 18, № 1, pp. 319-323 (in Russian).
[3] Shabalina Yu.V., Khaliullin F.A., Spasov A.A., Naumenko L.V., Sysoeva V.A. Synthesis and antiaggregant activity of
8-amino-substituted 1-alkyl-3-methyl-7- (thietanyl-3)xan-thines // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2009. Vol.43. №12. pp. 649-651.
[4] 3-Methyl-8-piperazino-7-(thiethan-3-yl)-1-ethylxanthine hydrochloride, which exhibits antiaggregation and disaggregation activity: patent 2404181 Russian Federation. №. 2009121001/04; date of filing: 02.06.2009; date of publication: 20.11.2010. Bull. 32. - 5 pp.
[5] Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii. Izd. XIII. Vol.1. Moscow, 2015. Available at: http://feml.scsml.rssi.ru/feml.
[6] Evropejskaja farmakopeja: v 3 t. per. s angl. - OOO «GRUPPA REMEDIUM», Moscow, 2014. - Vol. 1. - 2032 pp.
