CC BY
30OECD+WoS: 1.06+RQ (Mycology) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2021-104-3-15019
Полнотекстовая статья
КОНТАМИНАЦИЯ ЗЕРНА В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ ГРИБАМИ ALTERNARIA И ИХ МИКОТОКСИНАМИ
А.С. Орина1*, О.П. Гаврилова1, Т.Ю. Гагкаева1, Н.Н. Гогина2
'Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург 2Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства, Сергиев Посад
* ответственный за переписку, e-mail: orina-alex@yandex.ru
Впервые, с помощью реал-тайм ПЦР, подтверждена высокая повсеместная встречаемость грибов рода Alternaría, относящихся к двум секциям Alternaría и Infectoriae, в зерне пшеницы, ячменя и овса, выращенных в Западной Сибири в 2018-2019 гг. Содержание ДНК грибов секции Alternaria варьировало от 53*10-4 до 21731*10-4 пг/нг и в среднем превышало содержание ДНК грибов секции Infectoriae в 4.5-14.6 раз, в зависимости от вида зерновой культуры и года урожая. В зерне овса количество ДНК грибов обеих секций в среднем было ниже, чем в зерне пшеницы и ячменя. Наиболее инфицированными грибами секции Alternaria являлись образцы из Алтайского края. С помощью ВЭЖХ-МС/МС микотоксины альтернариол (АОЛ), монометиловый эфир альтернариола (АМЭ), тентоксин (ТЕН) и тенуазоновая кислота (ТК), продуцируемые грибами рода Alternaria, были обнаружены соответственно в 23 %, 6 %, 85 % и 83 % проанализированных образцов зерна. Сочетание двух микотоксинов (преимущественно ТЕН и ТК) выявлено в 61 % образцов, трех микотоксинов - в 19 % образцов, и только один образец содержал все четыре микотоксина. В большинстве случаев, содержание альтернариотоксинов в зерне не превышало 100 мкг/кг, и только для ТК выявлены более высокие количества - от 113 до 14963 мкг/кг. Установлены различия зерновых культур по количеству накапливаемых альтернариотоксинов: в зерне овса обнаружено больше АОЛ, АМЭ, а в зерне ячменя меньше ТЕН. Выявлена высокая достоверная связь между количествами ДНК грибов секции Alternaria и ТК, что указывает на роль грибов этой секции как основных продуцентов этого микотоксина в зерне.
Ключевые слова: ДНК, Alternaria, Infectoriae, реал-тайм ПЦР, ВЭЖХ-МС/МС, микотоксины
Поступила в редакцию: '9.05.202' Принята к печати: '0.09.202'
Сибирский федеральный округ входит в число лидеров зернопроизводящих регионов России. Основной зерновой культурой, возделываемой в этом регионе, является яровая пшеница - её посевные площади ежегодно составляют 40-45 % от общей посевной площади в стране. Также здесь широко выращивают овес (40 % от общей посевной площади) и яровой ячмень (15 %) (Федеральная служба государственной статистики, 2020). Качество зерна существенно влияет как на потребление полученного урожая в пищевых и кормовых целях на территории России, так и на объёмы экспорта.
Мониторинг зараженности зерна грибами всегда актуален, поскольку видовой состав микобиоты динамичен из-за влияния природных и антропогенных факторов. Особенное внимание исследователей привлекают грибы, способные образовывать вторичные токсичные метаболиты - микотоксины, негативно влияющие на организм потребителя зерна.
В последние годы, кроме традиционно используемых методов определения зараженности зерна на питательных агаризованных средах или в рулонах фильтровальной бумаги, начали активно применять молекулярные методы анализа (Гагкаева и др., 2017; КиНк et а1., 2017; Карако-тов и др., 2019; Орина и др., 2020). Метод реал-тайм ПЦР
позволяет быстро и объективно оценить количественное присутствие в зерне различных видов грибов по содержанию их ДНК, исключая ошибки идентификации таксонов, и кардинальным образом меняя многие сложившиеся представления о микобиоте зерна.
Исследования зараженности грибами зерновых культур, выращенных в Западной Сибири, демонстрируют преобладание грибов рода Alternaria Nees в микобиоте зерна (Торопова и др., 2015). Точная морфологическая идентификация этих грибов затруднена из-за расплывчатых границ видов и без привлечения молекулярных методов возможна только до уровня секций (Gannibal, 2018). Показано, что в микобиоте зерна преобладают представители секций Alternaria Lawrence, Gannibal, Peever & Pryor и Infectoriae Woudenb. & Crous (Ганнибал, 2014; Gannibal, 2018; Орина и др., 2020).
Кроме того, потенциал образования вторичных метаболитов у штаммов видов секций Alternaria и Infectoriae может существенно различаться (Tralamazza et al., 2018; Zwickel et al., 2018; Kononenko et al., 2020; Masiello et al., 2020; Jiang et al., 2021). Многие вторичные метаболиты грибов Alternaria являются фитотоксинами, способствующими колонизации растений грибами (Kang et al., 2017), и микотоксинами, оказывающими негативное влияние
© Орина А.С., Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю., Гогина Н.Н. Статья открытого доступа,
публикуемая Всероссийским институтом защиты растений (Санкт-Петербург) и распространяемая на условиях Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
на организм человека или животных (Lou et al., 2013; Tralamazza et al., 2018). К наиболее распространенным альтернариотоксинам в зерне относятся альтернариол (АОЛ), монометиловый эфир альтернариола (АМЭ), тен-токсин (ТЕН) и тенуазоновая кислота (ТК) (Alexander et al., 2011; Fraeyman et al., 2017). Предполагается, что АОЛ и АМЭ могут оказывать генотоксическое, мутагенное и канцерогенное действие на людей и животных (Alexander et al., 2011). ТК является ингибитором синтеза белка и более токсична, чем АОЛ и АМЭ (Lou et al., 2013). Неспецифичный для хозяина фитотоксин ТЕН подавляет развитие хлоропластов, вызывая хлороз растений (Lou et al., 2013).
Мониторинговые исследования загрязнения зерновых культур альтернариотоксинами и их продуцентами на территории России начали проводиться сравнительно недавно (Gannibal, 2018; Кононенко и др., 2020; Орина и др., 2020). В первую очередь, это связано с отставанием адекватной приборной базы для проведения молекулярных и
Материалы
Проанализировали 41 образец зерна урожая 2018 г. и 34 образца - 2019 г., собранных в различных областях Западной Сибири (Алтайский край, Кемеровская, Новосибирская, Омская области). Выборка включала 44 образца зерна яровой пшеницы, а также 24 - ячменя и 7 - овса (Приложение 1).
Зерно каждого образца (20 г) размалывали на мельнице Tube Mill Control (IKA, Германия). Выделение ДНК из 200 мг зерновой муки проводили с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва). Содержание ДНК грибов секций Alternaría и Infectoriae рода Alternaría выявляли методом реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green и специфичными молекулярными прайме-рами AAF2/AAR3 (Konstantinova et al., 2002) и AinfF3/ AinfR4 (Gannibal, Yli-Mattila, 2007), соответственно, по адаптированным методикам (Орина и др., 2020). Реакции проводили на термоциклере CFX96 Real-Time System (BioRad, США) минимум в двух повторностях, обработку первичных данных - с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 1.6. Количество ДНК грибов выражали в виде доли от общей ДНК, выделенной из зерновой муки (пг/нг общей ДНК, далее - пг/нг) с нижним пределом обнаружения 5*10-4 пг/нг.
Экстракцию микотоксинов из 5 г зерновой муки проводили 20 мл раствора ацетонитрил:вода:уксусная кислота (79:20:1). Детектирование и количественное определение
хроматографических исследований, и отсутствием нормативной базы, регламентирующей содержание микоток-синов грибов рода Alternaria в зерне. На основе токсикологических исследований в Европейском Союзе было предложено ввести ограничение на содержание ТК в продуктах детского питания - не более 500 мкг/кг (Rychlik et al., 2016). В 2019 г. был выпущен проект рекомендаций комиссии Европейского Союза, предлагающих установить контрольные значения трех микотоксинов грибов Alternaria - АОЛ, АМЭ и ТК в пищевых продуктах на основе злаков для младенцев и детей младшего возраста на уровне 5, 5 и 500 мкг/кг, соответственно (Food Chemistry Institute..., 2020).
Целью исследования являлось определение загрязнения зерновых культур, выращиваемых в разных областях Западной Сибири в 2018-2019 гг., грибами Alternaria и продуцируемыми ими микотоксинами.
и методы
четырех микотоксинов, образуемых грибами Alternaria: АОЛ, АМЭ, ТЕН, ТК, выполняли методом высокоэффективной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) согласно общепринятым руководствам (Malachova et al., 2014) с применением комплекса оборудования, состоящего из хроматографа Agilent Infinity 1290 (Германия) и масс-спектрометра AB SCIEX Triple Quad 5500 (США). Для хроматографического разделения применялась колонка, заполненная обращенно-фазовым сорбентом С18 с размером частиц не более 5 мкм, длиной 150 мм и внутренним диаметром 4.6 мм. (Gemini, Phenomenex, США). Для построения калибровочных графиков и в качестве внутренних стандартов были использованы стандартные растворы микотоксинов серии Biopure (Romer Labs, Австрия). Лимиты обнаружения АОЛ, АМЭ, ТЕН, и ТК составляли 2.0, 1.5, 2.0 и 6.3 мкг/кг, соответственно.
Расчёт средних значений и доверительного интервала проводили в программе Microsoft Excel 2010. Корреляционный анализ связей между количественными признаками с помощью коэффициента Пирсона (r) и дисперсионный анализ (ANOVA) для определения влияния конкретного фактора на анализированные параметры рассчитывали в программе STATISTICA 10.0. Достоверность различий и корреляционных связей принимали при уровне значимости р<0.05.
Результаты
Результаты реал-тайм ПЦР показали, что все проанализированные образцы зерна содержали ДНК грибов Alternaria секций Alternaria и Infectoriae. Количества ДНК грибов секции Alternaria варьировали от 53*10-4 до 21731*10-4 пг/нг и значительно превышали количества ДНК грибов секции Infectoriae (от 35*10-4 до 1472*10-4 пг/ нг) во всех образцах зерна. Разница средних значений, в зависимости от вида зерновой культуры и года урожая, составляла 4.5-14.6 раз (рис.1).
Результаты дисперсионного анализа показали достоверные различия между образцами по содержанию
ДНК грибов обеих секций в урожае зерна разных лет - в среднем, в 2019 г. их количества были ниже, чем в 2018 г. Кроме того, выявили существенное влияние факторов «географическое происхождение образца» на контаминацию зерна ДНК грибов секции Alternaria - образцы из Алтайского края содержали ДНК этих грибов в количестве (4265±849)*10-4 пг/нг, что в 1.7-2.5 раза больше, чем образцы из других областей, - а также «вид зерновой культуры» на контаминацию зерна ДНК грибов секции Infectoriae - в зерне овса ДНК грибов этой секции было ниже, чем в зерне двух других культур.
3 2 42
gx в ~
E-g g g
< с ■ Ä Ь£ ^ <D .
0 О
■g Sä
(В .со
1
«С J3 m S о ^
5000
4000
3000
2000
1000 —
0
2018
2019
пшеница wheat
i
î
2018
2019
ячмень barley
i
2018
2019
овес oat
155
1200
1000 1—
= F
5>
о u-
800 aj .со x О CD
600 tsg ■s! S Î3 -г «
400 CD . и О # Sä
200 со .со II ч; _jd о 5 о 4
0 s ° I °
Рисунок 1. Среднее содержание ДНК грибов рода Alternaria в образцах зерна из Западной Сибири Figure 1. The average amount of DNA of Alternaria fungi in grain samples from West Siberia
Микотоксины АОЛ, АМЭ, ТЕН и ТК обнаружены соответственно в 23 %, 6 %, 85 % и 83 % образцов зерна. Только два образца ячменя из Новосибирской области урожая 2018 г. не были загрязнены ни одним из четырёх анализированных микотоксинов грибов Alternaria. Большинство (61 %) образцов содержало в зерне два микотоксина (преимущественно ТЕН и ТК), 19 % образцов - три микотокси-на и только один образец (овёс из Новосибирской области урожая 2019 г.) - все четыре микотоксина совместно.
Различия между образцами пшеницы, ячменя и овса по встречаемости альтернариотоксинов в зерне представлены на рисунке 2. Наиболее контаминированными являлись образцы овса урожая 2019 г., в их зерне встречаемость АОЛ, ТЕН и ТК составила 100 %, а наименее контаминированными оказались образцы зерна ячменя урожая 2018 г., в которых были выявлены только два микотоксина: ТЕН - в 87 % образцов, а ТК - в 47 %.
Содержание анализированных альтернариотоксинов в большинстве случаев не превышало 100 мкг/кг зерна. Только ТК выявлена в 31 % проанализированных образцов в значительных количествах (табл. 1), в том числе четыре образца из Алтайского края и Новосибирской области (три пшеницы и один овёс) содержали этот микотоксин в зерне в диапазоне 594-14963 мкг/кг.
Установлено, что содержание ТЕН и ТК в зерне варьировало существенно, в зависимости от года урожая и вида зерновой культуры. Для всех культур урожая 2019 г. содержание ТЕН в зерне было ниже, по сравнению с 2018 г (рис. 3).
Количество АОЛ и АМЭ в зерне овса в среднем были достоверно выше, чем в пшенице и ячмене, а среднее количество ТЕН было достоверно ниже в зерне ячменя. Кроме того, на содержание ТЕН в зерне существенно влиял фактор «географическое происхождение образцов».
I—I АОЛ I—I АОН
I—I АМЭ I—I АМЕ
ПТЕН I—I TEN
ТК ТеА
100
СО
84 о. о Е О (0 zs со <*> 1-1
&2 Ю CG
0 2
Ч Е
1 s
I g
s 8
n 's R ° е- с
СО О га t к О
Se
CD
80
■Щ 60
40
20
2018
пшеница wheat
2019
2018
ячмень barley
2019
2018
2019
овес oat
Рисунок 2, Figure 2. The
Встречаемость микотоксинов грибов рода Alternaria в зерне из Западной Сибири. АОЛ - альтернариол, АМЭ - монометиловый эфир альтернариола, ТЕН - тентоксин, ТК - тенуазоновая кислота occurrence of Alternaria mycotoxins in grain samples from West Siberia. AOH - altemariol, AME - altemariol monoethyl ether, TEN - tentoxin, TeA - tenuazonic acid
Таблица 1. Содержание микотоксинов грибов Alternaria в образцах зерна из Западной Сибири
Зерновая культура
Год урожая (число образцов)
Диапазон выявленных количеств микотоксина, мкг/кг АОЛ АМЭ ТЕН ТК
Пшеница
Ячмень
Овёс
2018 (21) 2019 (23)
2018 (13)
2019 (9)
2018 (3)
2019 (2)
3-14 7-17 О
4; З 4
7; З3
3; 4 4-б О О О
0; 22
4-83 3-3б З-38 3-б 13-88 1З; 1З
34-149б3 1б-241 30-349 9-113 1б4-40З 280; 1379
АОЛ - альтернариол, АМЭ - монометиловый эфир альтернариола, ТЕН - тентоксин, ТК - тенуазоновая кислота. Table 1. The content of Alternaria mycotoxins in grain samples from West Siberia
Cereal Crop year Range of mycotoxin amounts, ^g/kg
(number of samples) AOH AME TEN TeA
Wheat 2018 (21) 3-14 3; 4 4-83 34-149б3
2019 (23) 7-17 4-б 3-3б 1б-241
Barley 2018 (15) О О 3-38 30-349
2019 (9) 4-3 О 3-б 9-113
Oat 2018 (5) 4 О 13-88 1б4-40З
2019 (2) 7-33 22 13 280-1379
AOH - altemariol, AME - altemariol monoethyl ether, TEN - tentoxin, TeA - tenuazonic acid.
□
if s О)
tí Н ш
as
CD g ËS
60
50
40
30
20
10
2018
пшеница wheat
2019
i^L
2018
ячмень barley
2019
2018
овёс oat
2019
1800
1500
1200
900
600
300
,<D аз Is t z о со
Sí с о. œ Ä =
О и
Рисунок 3. Загрязненность микотоксинами грибов рода Alternaria зерна из Западной Сибири Figure 3. The contamination of grain samples from West Siberia by Alternaria mycotoxins
В образцах зерна из Алтайского края этот микотоксин встречался в количестве 24±4 мкг/кг - в 2.2-2.4 раза выше, чем в образцах зерна из других областей. Влияние
географического происхождения и вида зерновой культуры на содержание ТК в зерне не установлено.
Обсуждение
Грибы Alternaria обильно представлены в микобиоте зерна (Ганнибал, 2014; Kulik et al., 2015; Gannibal, 2018; Орина и др., 2020), в т.ч. выращенного на территории Сибири (Торопова и др., 2015; Казакова и др., 2016). До настоящего времени существовало мнение, что представители секции Infectoriae часто встречаются в западной части России, редко - на Урале и в Сибири, и отсутствуют на востоке страны (Ганнибал, 2014). Однако полученные данные показали значительную представленность грибов секции Infectoriae в зерне из Западной Сибири, и согласуются с
результатами исследования зерна, выращенного на Урале (Орина и др., 2020).
Выявлено преобладание представителей секции Alternaria над представителями секции Infectoriae в анализированных образцах зерна: содержание ДНК грибов секции Alternaria в среднем составило 2814±314*10-4 пг/ нг, что оказалось в 8.3 раз больше, чем среднее содержание ДНК грибов секции Infectoriae (338±34*10-4 пг/нг). В этой связи интересно отметить, что грибы, относящиеся к секции Alternaria, быстрее растут, образуют более плотный
пигментированным воздушный мицелии, и, вероятно, оказываются более конкурентоспособными при колонизации зерна, чем представители секции Infectoriae. Между количеством в зерне образцов ДНК грибов, относящихся к двум секциям, выявлена достоверная положительная связь (г=0.57). Ранее отмечалось, что зерно пшеницы и ячменя в Западной Сибири более подвержено заражению видами грибов секции Alternaria, чем грибами из других секций (Gannibal, 2018), также превалирующее содержание ДНК этих грибов установлено в зерне из Уральского региона (Орина и др., 2020) и из провинции Хубэй в Китае (Jiang et al., 2021). Соотношение представителей секций Alternaria и Infectoriae в микобиоте зерна может варьировать и, в значительной степени, зависит от климатических условий, а также от растения-хозяина (Kosiak et al., 2004; Gannibal, 2018).
Среди анализированных микотоксинов, в зерне из Западной Сибири ТК и ТЕН встречались в 3.7-14 раз чаще, чем АОЛ и АМЭ, что подтверждает статус ТК и ТЕН как наиболее распространённых микотоксинов в зерне, выращиваемом на территории Азии (Xu et al., 2016; Орина и др., 2020; Jiang et al., 2021).
В среднем за два года наиболее контаминированными были образцы овса, в их зерне встречаемость АОЛ, АМЭ, ТЕН и ТК составила 43 %, 14 %, 100 % и 100 %, соответственно. Тогда как наименее контаминированными оказались образцы зерна ячменя, в которых АМЭ не был найден, а АОЛ, ТЕН и ТК были выявлены в 8 %, 83 % и 67 % образцов, соответственно. Сходные закономерности были установлены при анализе 76 образцов зерна из южной части Норвегии: встречаемость ТЕН и ТК в зерне овса была значительно выше, по сравнению с ячменем и пшеницей, хотя выявленные содержания микотоксинов были низкими (Uhlig et al., 2013).
Согласно нашим результатам, содержание анализированных альтернариотоксинов в большинстве случаев не превышало 100 мкг/кг зерна, что согласуется с опубликованной ранее информацией о выявленных уровнях микотоксинов грибов Alternaria (Fraeyman et al., 2017). Однако в 31 % проанализированных образцов ТК выявлена в более значительных количествах, причем один образец пшеницы из Алтайского края содержал этот микотоксин
в экстремально высоких количествах - 14963 мкг/кг. По нашим сведениям, это максимальная выявленная естественная контаминация зерна ТК, опубликованная в научной литературе. Ранее этот микотоксин выявляли в количествах 4179 мкг/кг в зерне пшеницы в Германии (Müller, Korn, 2013) и 6432 мкг/кг в зерне пшеницы из Китая (Li, Yoshizawa, 2000). Между тем, ТК является остро токсичным веществом со значениями LD50 при пероральном приеме от 81 до 225 мг/кг массы тела для мышей (Crudo et al., 2019).
Ожидаемо, между AОЛ и АМЭ, являющихся производными одного химического предшественника - дибен-зопирона, выявлена высокая достоверная положительная связь (r=0.93). В нашем исследовании АМЭ встречался только в тех же образцах, где был выявлен АОЛ, но в более низких количествах. Число образцов зерна, где содержание хотя бы одного из этих микотоксинов превышало 5 мкг/кг, составило 15 %. Также достоверная слабая положительная связь установлена между количествами АОЛ и ТК (r=0.26). Совместная встречаемость пары АОЛ и АМЭ, так же, как и АОЛ и ТК в зерне отмечена неоднократно, и относительное содержание ТК было выше, чем других ми-котоксинов (Uhlig et al., 2013; Xu et al., 2016; Fraeyman et al., 2017; Jiang et al., 2021). Нельзя исключать синергетиче-ские или аддитивные взаимодействия между альтернари-отоксинами, которые могут усиливать негативный эффект для здоровья потребителя (Zhao et al., 2015).
Грибы, относящиеся к видам секции Alternaria, широко распространённые в зерне пшеницы и ячменя на территории Азии, продуцируют основные альтернариотоксины - АОЛ, АМЭ и ТК (Nguyen et al., 2018; Jiang et al., 2021). В нашей работе выявлена высокая достоверная положительная связь между количествами ТК и ДНК грибов секции Alternaria (r=0.79), что указывает на роль грибов этой секции как основных продуцентов ТК в зерне. В данном исследовании между содержанием ДНК грибов из секции Infectoriae и анализированными микотоксинами достоверные связи в зерне из Западной Сибири не установлены, однако ранее нами обнаружена достоверная связь между содержанием ДНК этих грибов и ТЕН в образцах зерна из Уральского региона (Орина и др., 2020).
Заключение
Проведенные исследования демонстрируют повсеместное присутствие грибов Alternaria секций Alternaria и Infectoriae и продуцируемых ими микотоксинов в зерне пшеницы, ячменя и овса, выращенных на территории Западной Сибири. Установление факторов, оказывающих влияние на численность грибов Alternaria и их способность продуцировать вторичные токсичные метаболиты,
требует уточнения. Частая совместная контаминация зерна разными альтернариотоксинами и выявленные экстремально высокие количества ТК в зерне показывают необходимость дальнейших исследований этой проблемы, а также разработки мер контроля встречаемости этих ми-котоксинов и стратегий для снижения риска, связанного с загрязнением ими зерна.
Работа выполнена при поддержке РНФ (проект № 19-76-30005). Библиографический список (References)
Гагкаева ТЮ, Гаврилова ОП, Орина АС, Казарцев ИА и др (2017) Сравнение методов выявления в зерне токси-нопродуцирующих грибов рода Fusarium. Микология и фитопатология 51(5):292-298
Ганнибал ФБ (2014) Альтернариоз зерна - современный взгляд на проблему. Защита и карантин растений (6):11-15
Казакова ОА, Торопова ЕЮ, Воробьева ИГ (2016) Взаимоотношения фитопатогенов семян ячменя в Западной Сибири. АПК России 23(5):931-934
Каракотов СД, Аршава НВ, Башкатова МБ (2019) Мониторинг и контроль заболеваний пшеницы в Южном Зауралье. Защита и карантин растений (7):18-25 Кононенко ГП, Буркин АА, Зотова ЕВ (2020) Ми-котоксикологический мониторинг. Сообщение 2. Зерно пшеницы, ячменя, овса, кукурузы. Ветеринария сегодня 2(33):139-145. http://doi. org/10.29326/2304-196X-2020-2-33-139-145 Орина АС, Гаврилова ОП, Гагкаева ТЮ, Ганнибал ФБ (2020) Микромицеты Alternaria spp. и Bipolaris sorokiniana и микотоксины в зерне, выращенном в Уральском Федеральном Округе. Микология и фитопатология 54(5):365-377. http://doi.org/10.31857/ S0026364820050086 Торопова ЕЮ, Кириченко АА, Казакова ОА, Порсев ИН (2015) Альтернариоз зерна яровой пшеницы и ячменя в Западной Сибири и Восточном Зауралье. Защита и ка-рантинрастений (1):20-22 Федеральная служба государственной статистики. Бюллетени о состоянии сельского хозяйства (электронные версии). https://www.gks.ru/compendium/document/13277 (17.05.2021)
Alexander J, Benford D, Boobis A, Ceccatelli S et al (2011) Scientific opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food. EFSA Journal 9(10):2407-2504. http://doi.org/10.2903/j. efsa.2011.2407
Crudo F, Varga E, Aichinger G, Galaverna G et al (2019) Co-occurrence and combinatory effects of Alternaria mycotoxins and other xenobiotics of food origin: current scenario and future perspectives. Toxins 11(11):640. http:// doi.org/10.3390/toxins11110640 Food Chemistry Institute of the Association of the German Confectionery Industry (2020) Alternaria toxins: occurrence, toxicity, analytical methods, maximum levels. https://www.lci-koeln.de/deutsch/veroeffentlichungen/ lci-focus/alternaria-toxins-occurrence-toxicity-analytical-methods-maximum-levels (17.05.2021) Fraeyman S, Croubels S, Devreese M, Antonissen G (2017) Emerging Fusarium and Alternaria mycotoxins: occurrence, toxicity and toxicokinetics. Toxins 9:228. http:// doi.org/10.3390/toxins9070228 Gannibal PhB (2018) Factors affecting Alternaria appearance in grains in European Russia. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya 53(3):605-615. http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2018.3.605eng Gannibal PhB, Yli-Mattila T (2007) Morphological and UP-PCR analyses and design of a PCR assay for differentiation of Alternaria infectoria species-group. Mikologiya i fitopatologiya 41(4):313-322. Jiang D, Wei D, Li H, Wang L et al (2021) Natural occurrence of Alternaria mycotoxins in wheat and potential of reducing associated risks using magnolol. J Sci Food Agric 101:3071-3077. http://doi.org/10.1002/jsfa.10901 Kang Y, Feng H, Zhang J, Chen S et al (2017) TeA is a key virulence factor for Alternaria alternatа (Fr.) Keissler infection of its host. Plant Physiol Biochem 115:73-82. http://doi.org/10.1016Zj.plaphy.2017.03.002 Kononenko GP, Piryazeva EA, Burkin AA (2020) Production of alternariol in the populations of grain feed-associated small spore Alternaria species. Sel'skokhozyaistvennaya
Biologiya 55(3):628-637. http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2020.3.628eng Konstantinova P, Bonants PJM, van Gent-Pelzer MPE, van der Zouwen P et al (2002) Development of specific primers for detection and identification of Alternaria spp. in carrot material by PCR and comparison with blotter and plating assays. Mycol Res 106(1):23-33. https://doi.org/10.1016/j. cropro.2012.03.021 Kosiak B, Torp M, Skjerve E, Andersen B (2004) Alternaria and Fusarium in Norwegian grains of reduced quality - a matched pair sample study. Int J Food Microbiol 93(1):51-62. https://doi.org/10.1016/jijfoodmicro.2003.10.006 Kulik T, Treder K, Zaluski D (2015) Quantification of Alternaria, Cladosporium, Fusarium and Penicillium verrucosum in conventional and organic grains by qPCR. J Phytopathol 163:522-528. https://doi.org/10.1111/ jph.12348
Li FQ, Yoshizawa T (2000)Alternaria mycotoxins in weathered wheat from China. J Agric Food Chem 48(7):2920-2924. http://doi.org/10.1021/jf0000171 Lou J, Fu L, Peng Y, Zhou L (2013) Metabolites from Alternaria fungi and their bioactivities. Molecules 18;5891-5935. http://doi.org/10.3390/molecules18055891 Malachova A, Sulyok M, Beltran E, Berthiller F et al (2014) Optimization and validation of a quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometric method covering 295 bacterial and fungal metabolites including all regulated mycotoxins in four model food matrices. J Chromatogr A 1362:145-156. http://doi.org/10.1016/j. chroma.2014.08.037 Masiello M, Somma S, Susca A, Ghionna V et al (2020) Molecular identification and mycotoxin production by Alternaria species occurring on durum wheat, showing black point symptoms. Toxins 12(4):275. https://doi.org/10.3390/ toxins12040275 Müller ME, Korn U (2013) Alternaria mycotoxins in wheat — a 10 years survey in the Northeast of Germany. Food Control 34:191-197. http://doi.org/10.1016/jibodcont.2013.04.018 Nguyen TTT, Kim J, Jeon SJ, Lee CW et al (2018) Mycotoxin production of Alternaria strains isolated from Korean barley grains determined by LC-MS/MS. Int J Food Microbiol 268:44-52. http://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2018.01.003 Rychlik M, Lepper H, Weidner C, Asam S (2016) Risk evaluation of the Alternaria mycotoxin tenuazonic acid in foods for adults and infants and subsequent risk management. Food Control 68:181-185. http://doi.org/10.1016/j. foodcont.2016.03.035 Tralamazza SM, Piacentini KC, Iwase CHT, de Oliveira Rocha L (2018) Toxigenic Alternaria species: impact in cereals worldwide. Curr Opin Food Sci 23:57. http://doi. org/10.1016/j.cofs.2018.05.002 Uhlig S, Eriksen G, Hofgaard I, Krska R et al (2013) Faces of a changing climate: semi-quantitative multi-mycotoxin analysis of grain grown in exceptional climatic conditions in Norway. Toxins 5:1682-1697. http://doi.org/10.3390/ toxins5101682
Xu W, Xiaomin H, Li F, Zhang L (2016) Natural occurrence of Alternaria toxins in the 2015 wheat from Anhui province, China. Toxins 8:308. https://doi.org/10.3390/toxins8110308
Zhao K, Shao B, Yang D, Li F et al (2015) Natural occurrence of Alternaria toxins in wheat based products and their dietary exposure in China. PLoS ONE 10:e0132019. http:// doi.org/10.1371/journal.pone.0132019
Zwickel T, Kahl SM, Rychlik M, Müller MEH (2018) Chemotaxonomy of mycotoxigenic small-spored Alternaria fungi - do multitoxin mixtures act as an indicator for species differentiation? Front Microbiol 9:1368. http://doi. org/10.3389/fmicb.2018.01368
Translation of Russian References
grain] Veterinariya segodnya 2(33):139-145 (in Russian) http://doi.org/10.29326/2304-196X-2020-2-33-139-145 Orina AS, Gavrilova OP, Gagkaeva TYu, Gannibal PhB (2020) [Micromycetes Alternaria spp. and Bipolaris sorokiniana and mycotoxins in the grain from the Ural region] Mikologiya i Fitopatologiya 54(5):365-377 (in Russian) http://doi.org/10.31857/S0026364820050086 Toropova EYu, Kirichenko AA, Kazakova OA, Porsev IN (2015) [Alternaria disease of grain of spring wheat and barley in Western Siberia and Eastern Trans-Urals] Zashchita i karantin rasteniy (1):20-22 (in Russian) Federal State Statistics Service. Bulletins on the state of agriculture (electronic versions). https://www.gks.ru/ compendium/document/13277 (17.05.2021) (in Russian)
Gagkaeva TYu, Gavrilova OP, Orina AS, Kazartsev IA et al (2017) [Comparison of methods for identification of toxin-producing Fusarium fungi in the cereal grain] Mikologiya i Fitopatologiya 51(5):292-298 (in Russian)
Gannibal PhB (2014) [Alternaria desease of grain - modern view of the problem] Zashchita i karantin rasteniy (6):11-15 (in Russian)
Kazakova OA, Toropova EYu, Vorobyeva IG (2016) [The interrelations between phytopathogens of barley seeds in western Siberia] APKRossii 23(5):931-934 (in Russian)
Karakotov SD, Arshava NV, Bashkatova MB (2019) [Monitoring and control of wheat diseases in the Southern Trans-Urals] Zashchita i karantin rasteniy (7):18-25 (in Russian)
Kononenko GP, Burkin AA, Zotova EV (2020) [Mycotoxi-logical monitoring. Part 2. Wheat, barley, oat and maize
Plant Protection News, 2021, 104(3), p. 153-162
OECD+WoS: 1.06+RQ (Mycology) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2021-104-3-15019
Full-text article
CONTAMINATION OF GRAIN IN WEST SIBERIA BY ALTERNARIA FUNGI AND THEIR MYCOTOXINS
A.S. Orina1*, O.P. Gavrilova1, T.Yu. Gagkaeva1, N.N. Gogina2
1All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia 2All-Russian Poultry Institute, Sergiev Posad, Russia
*corresponding author, e-mail: orina-alex@yandex.ru
The ubiquitous occurrence of Alternaria fungi belonging to sections Alternaria and Infectoriae was confirmed using real-time PCR in wheat, barley and oat grain grown in West Siberia in 2018-2019. The DNA amount of Alternaria section Alternaria fungi varied from 53*10-4 to 21731*10-4 pg/ng and on average exceeded the DNA amount of Alternaria section Infectoriae fungi by 4.5-14.6 times, depending on the crop and harvest year.The average DNA amount of Alternaria fungi belonging to both sections in the oat grain was lower than in wheat and barley grain. The grain samples from Altay region were the most infected with Alternaria fungi. The alternariol (AOH), alternariol monomethyl ether (AME), tentoxin (TEN), and tenuazonic acid (TeA) mycotoxins produced by Alternaria fungi were detected by HPLC-MS/MS in 23 %, 6 %, 85 %, and 83 %% of analyzed grain samples, respectively. The majority (61 %>) of the samples contained two Alternaria mycotoxins in the grain (mainly TEN and TeA), 19 % of the samples three mycotoxins, and only one sample all four together. In the most of samples the content of Alternaria mycotoxins did not exceed 100 ^g/kg, and only TeA content was higher (from 113 to 14963 ^g/kg) than others. The significant differences in grain crops by the Alternaria mycotoxins content were revealed: more amounts of AOH, AME, and less amount of TEN were found in oat grain then in barley grain. A high positive significant correlation between the DNA amount of Alternaria section Alternaria fungi and TeA was established that indicates the role of these fungi as the main producers of TeA in the grain.
Keywords: DNA, Alternaria, Infectoriae, real-time PCR, HPLC-MS/MS, mycotoxins
Submitted: 19.05.2021
Accepted: 10.09.2021
© Orina A.S., Gavrilova O.P., Gagkaeva T.Yu., Gogina N.N., published by All-Russian Institute of Plant Protection
(St. Petersburg). This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Приложение 1. Образцы зерна, включенные в исследование
Год Содержание ДНК грибов рода Содержание микотоксинов,
Регион Культура Alternaria, *10-4 пг/нг мкг/кг
урожая Секц. Alternaria Секц. Infectoriae АОЛ АМЕ ТЕН ТК
Алтайский край 2018 пшеница 1809 210 0 0 12 99
Алтайский край 2018 пшеница 3009 170 0 0 18 0
Алтайский край 2018 пшеница 3361 292 0 0 22 68
Алтайский край 2018 пшеница 3113 208 0 0 16 0
Алтайский край 2018 пшеница 2495 91 3 0 13 84
Алтайский край 2018 пшеница 4445 300 0 0 50 215
Алтайский край 2018 пшеница 3583 232 0 0 18 92
Алтайский край 2018 пшеница 3196 267 0 0 15 55
Алтайский край 2018 пшеница 2080 217 0 0 4 47
Алтайский край 2018 пшеница 21731 817 14 3 0 14963
Алтайский край 2018 пшеница 3472 310 0 0 46 594
Алтайский край 2018 пшеница 3415 278 0 0 78 165
Алтайский край 2018 овес 905 113 4 0 88 405
Алтайский край 2018 овес 1997 134 0 0 34 184
Алтайский край 2018 овес 2036 112 0 0 20 187
Алтайский край 2018 овес 3472 79 0 0 13 164
Алтайский край 2018 овес 2752 327 0 0 19 188
Алтайский край 2018 ячмень 3722 346 0 0 38 349
Алтайский край 2018 ячмень 10526 1176 0 0 18 90
Алтайский край 2018 ячмень 4359 706 0 0 5 0
Алтайский край 2018 ячмень 6696 551 0 0 22 48
Алтайский край 2018 ячмень 2349 452 0 0 6 0
Алтайский край 2018 ячмень 1161 262 0 0 6 0
Алтайский край 2018 ячмень 6667 810 0 0 19 38
Кемеровская обл. 2018 пшеница 3030 652 0 0 20 48
Кемеровская обл. 2018 пшеница 2861 349 0 0 19 50
Кемеровская обл. 2018 пшеница 2234 184 3 0 83 37
Кемеровская обл. 2018 ячмень 4802 1472 0 0 8 30
Кемеровская обл. 2018 ячмень 2260 281 0 0 14 0
Кемеровская обл. 2018 ячмень 3780 423 0 0 29 0
Новосибирская обл. 2018 пшеница 2106 278 12 0 10 0
Новосибирская обл. 2018 пшеница 1213 111 10 4 6 0
Новосибирская обл. 2018 пшеница 3652 627 4 0 4 0
Новосибирская обл. 2018 пшеница 5177 1187 0 0 6 801
Новосибирская обл. 2018 пшеница 3193 296 4 0 27 135
Новосибирская обл. 2018 пшеница 2404 183 0 0 42 222
Новосибирская обл. 2018 ячмень 2429 454 0 0 0 0
Новосибирская обл. 2018 ячмень 1285 366 0 0 0 0
Новосибирская обл. 2018 ячмень 2246 444 0 0 5 127
Омская обл. 2018 ячмень 53 252 0 0 8 83
Омская обл. 2018 ячмень 5731 923 0 0 9 0
Кемеровская обл. 2019 пшеница 915 137 7 0 0 26
Кемеровская обл. 2019 пшеница 1517 117 9 0 10 16
Кемеровская обл. 2019 пшеница 1655 124 0 0 6 59
Кемеровская обл. 2019 пшеница 1609 159 0 0 6 20
Кемеровская обл. 2019 пшеница 3323 394 0 0 3 21
Кемеровская обл. 2019 пшеница 2588 399 0 0 4 23
Кемеровская обл. 2019 пшеница 1859 152 11 0 3 185
Кемеровская обл. 2019 пшеница 2256 251 14 5 0 60
Кемеровская обл. 2019 пшеница 1809 191 17 4 0 47
Кемеровская обл. 2019 пшеница 2225 236 16 6 0 40
Кемеровская обл. 2019 овес 624 139 7 0 15 280
Кемеровская обл. 2019 ячмень 1662 318 0 0 3 59
Кемеровская обл. 2019 ячмень 2340 535 4 0 5 80
Кемеровская обл. 2019 ячмень 2146 333 0 0 6 66
Кемеровская обл. 2019 ячмень 2855 153 0 0 3 9
Кемеровская обл. 2019 ячмень 4776 388 5 0 5 43
Продолжение приложения 1
Год Содержание ДНК грибов рода Содержание микотоксинов,
Регион Культура Alternaría, *10-4 пг/нг мкг/кг
урожая Секц. Alternaría Секц. Infectoriae АОЛ АМЕ ТЕН ТК
Новосибирская обл. 2019 пшеница 1081 68 0 0 9 98
Новосибирская обл. 2019 пшеница 958 97 0 0 36 178
Новосибирская обл. 2019 пшеница 957 73 0 0 13 147
Новосибирская обл. 2019 пшеница 973 214 0 0 0 25
Новосибирская обл. 2019 пшеница 956 144 0 0 5 31
Новосибирская обл. 2019 пшеница 1724 217 0 0 12 30
Новосибирская обл. 2019 пшеница 2164 35 0 0 20 241
Новосибирская обл. 2019 пшеница 523 130 0 0 0 48
Новосибирская обл. 2019 пшеница 1023 86 0 0 3 129
Новосибирская обл. 2019 овес 526 91 53 22 15 1579
Новосибирская обл. 2019 ячмень 1052 133 0 0 0 60
Новосибирская обл. 2019 ячмень 1165 103 0 0 3 113
Новосибирская обл. 2019 ячмень 820 176 0 0 0 54
Омская обл. 2019 пшеница 3851 968 0 0 24 60
Омская обл. 2019 пшеница 1700 312 0 0 6 30
Омская обл. 2019 пшеница 426 116 0 0 3 113
Омская обл. 2019 пшеница 3454 1204 0 0 16 30
Омская обл. 2019 ячмень 2733 231 0 0 5 71
АОЛ - альтернариол, АМЭ - монометиловый эфир альтернариола, ТЕН - тентоксин, ТК - тенуазоновая кислота
Appendix 1. Grain samples analyzed in the present study
Region Crop year Cereal Content of DNA x10-4 of Alternaria spp., Pg/ng Con tent of myc otoxins, Ц g/kg
sect. Alternaria sect. Infectoriae AOH AME TEN TeA
Altay region 2018 wheat 1809 210 0 0 12 99
Altay region 2018 wheat 3009 170 0 0 18 0
Altay region 2018 wheat 3361 292 0 0 22 68
Altay region 2018 wheat 3113 208 0 0 16 0
Altay region 2018 wheat 2495 91 3 0 13 84
Altay region 2018 wheat 4445 300 0 0 50 215
Altay region 2018 wheat 3583 232 0 0 18 92
Altay region 2018 wheat 3196 267 0 0 15 55
Altay region 2018 wheat 2080 217 0 0 4 47
Altay region 2018 wheat 21731 817 14 3 0 14963
Altay region 2018 wheat 3472 310 0 0 46 594
Altay region 2018 wheat 3415 278 0 0 78 165
Altay region 2018 oat 905 113 4 0 88 405
Altay region 2018 oat 1997 134 0 0 34 184
Altay region 2018 oat 2036 112 0 0 20 187
Altay region 2018 oat 3472 79 0 0 13 164
Altay region 2018 oat 2752 327 0 0 19 188
Altay region 2018 barley 3722 346 0 0 38 349
Altay region 2018 barley 10526 1176 0 0 18 90
Altay region 2018 barley 4359 706 0 0 5 0
Altay region 2018 barley 6696 551 0 0 22 48
Altay region 2018 barley 2349 452 0 0 6 0
Altay region 2018 barley 1161 262 0 0 6 0
Altay region 2018 barley 6667 810 0 0 19 38
Kemerovo region 2018 wheat 3030 652 0 0 20 48
Kemerovo region 2018 wheat 2861 349 0 0 19 50
Kemerovo region 2018 wheat 2234 184 3 0 83 37
Kemerovo region 2018 barley 4802 1472 0 0 8 30
Kemerovo region 2018 barley 2260 281 0 0 14 0
Kemerovo region 2018 barley 3780 423 0 0 29 0
Novosibirsk region 2018 wheat 2106 278 12 0 10 0
Novosibirsk region 2018 wheat 1213 111 10 4 6 0
Appendix 1 continued
Region Crop year Cereal Content of DNA x10-4 of Alternaria spp., Pg/ng Con tent of myc otoxins, ц g/kg
sect. Alternaria sect. Infectoriae AOH AME TEN TeA
Novosibirsk region 2018 wheat 3652 627 4 0 4 0
Novosibirsk region 2018 wheat 5177 1187 0 0 6 801
Novosibirsk region 2018 wheat 3193 296 4 0 27 135
Novosibirsk region 2018 wheat 2404 183 0 0 42 222
Novosibirsk region 2018 barley 2429 454 0 0 0 0
Novosibirsk region 2018 barley 1285 366 0 0 0 0
Novosibirsk region 2018 barley 2246 444 0 0 5 127
Omsk region 2018 barley 53 252 0 0 8 83
Omsk region 2018 barley 5731 923 0 0 9 0
Kemerovo region 2019 wheat 915 137 7 0 0 26
Kemerovo region 2019 wheat 1517 117 9 0 10 16
Kemerovo region 2019 wheat 1655 124 0 0 6 59
Kemerovo region 2019 wheat 1609 159 0 0 6 20
Kemerovo region 2019 wheat 3323 394 0 0 3 21
Kemerovo region 2019 wheat 2588 399 0 0 4 23
Kemerovo region 2019 wheat 1859 152 11 0 3 185
Kemerovo region 2019 wheat 2256 251 14 5 0 60
Kemerovo region 2019 wheat 1809 191 17 4 0 47
Kemerovo region 2019 wheat 2225 236 16 6 0 40
Kemerovo region 2019 oat 624 139 7 0 15 280
Kemerovo region 2019 barley 1662 318 0 0 3 59
Kemerovo region 2019 barley 2340 535 4 0 5 80
Kemerovo region 2019 barley 2146 333 0 0 6 66
Kemerovo region 2019 barley 2855 153 0 0 3 9
Kemerovo region 2019 barley 4776 388 5 0 5 43
Novosibirsk region 2019 wheat 1081 68 0 0 9 98
Novosibirsk region 2019 wheat 958 97 0 0 36 178
Novosibirsk region 2019 wheat 957 73 0 0 13 147
Novosibirsk region 2019 wheat 973 214 0 0 0 25
Novosibirsk region 2019 wheat 956 144 0 0 5 31
Novosibirsk region 2019 wheat 1724 217 0 0 12 30
Novosibirsk region 2019 wheat 2164 35 0 0 20 241
Novosibirsk region 2019 wheat 523 130 0 0 0 48
Novosibirsk region 2019 wheat 1023 86 0 0 3 129
Novosibirsk region 2019 oat 526 91 53 22 15 1579
Novosibirsk region 2019 barley 1052 133 0 0 0 60
Novosibirsk region 2019 barley 1165 103 0 0 3 113
Novosibirsk region 2019 barley 820 176 0 0 0 54
Omsk region 2019 wheat 3851 968 0 0 24 60
Omsk region 2019 wheat 1700 312 0 0 6 30
Omsk region 2019 wheat 426 116 0 0 3 113
Omsk region 2019 wheat 3454 1204 0 0 16 30
Omsk region 2019 barley 2733 231 0 0 5 71
AOH - altemariol, AME - altemariol monoethyl ether, TEN - tentoxin, TeA - tenuazonic acid.
