CC BY
29
КОНСТРУИРОВАНИЕ САМООРГАНИЗУЮЩИХСЯ НАНОЧАСТИЦ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К DEC-205 (CD205) РЕЦЕПТОРАМ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАТИОНОВ ДЛЯ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ДНК-ВАКЦИНЫ, КОДИРУЮЩЕЙ AG85B MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ И ОЦЕНКА ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА В ОПЫТАХ IN VIVO НА МЫШАХ
© Абрамов В.М.1, Хлебников B.C.2, Хотина И.А.3,
Кабачий Ю.А.3, Косарев И.В.2, Василенко Р.Н.2,
2 2 2 Чикилева И.О. , Куликова Н.Л. , Потапов В.Д. ,
Косарев Н.В.2, Логинова Т.П.3, Кочев С.Ю.3,
Мещерякова А.А.2, Корпела Т.4
Институт инженерной иммунологии, Московская область, пос. Любучаны, Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН,
г. Москва,
Университет Турку, Финляндия, г. Био-Сити
Технология получения адресных систем доставки ДНК актуальна для конструирования безопасных и эффективных ДНК-вакцин против различных инфекционных болезней. Целью исследований явилось конструирование наночастиц на основе катионных блоксополимеров, обладающих высоким сродством к DEC-205 (CD205) рецепторам и обеспечивающих адресную доставку ДНК в дендритные клетки. Синтезированы блоксополимеры с различной молекулярной массой и степенью разветвленности. Наиболее пригодным для адресной доставки оказался блоксополимер pDMAEM-g-PEO-2. Для изучения взаимодействия блоксополимеров с ДНК использовался плазмидный вектор, несущий ген протективного антигена Ag85B M. tuberculosis (ДНК Ag85B) под контролем CVM промотора. С помощью электронной микроскопии было установлено, что после взаимодействия ДНК Ag85B c pDMAEM-g-PEO-2 происходит самоорганизация наночастицы диаметром 50-100 нм. Процесс самоорганизации включает упаковку плазмидной ДНК Ag85B внутри наночастицы. Методом радиолигандного анализа было обнаружено, что поверхность образовавшейся наночастицы приобрета-
1 Руководитель отдела биохимии иммунитета и биозащиты Института инженерной иммунологии, доктор биологических наук, профессор.
2 Институт инженерной иммунологии.
3 Институт элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова РАН.
4 Университет Турку.
ет свойства акцептора для рекомбинантного модифицированного белка - активатора плазминогена Pla99a-2Q6A (Kd (M) = 1Q-11), имеющего сродство к DEC-2Q5 (CD2Q5) рецепторам на поверхности дендритных клеток. Белок Pla99a-2Q6A, адсорбированный на поверхности наночастиц сохранял способность связываться с DEC-2Q5 (CD2Q5) рецепторами, обеспечивая специфическое взаимодействие наночастиц с дендритными клетками (Kd (M) = 1Q-14). Проведены сравнительные исследования эффективности поствакцинальной защиты мышей, иммунизированных:
1. ДНК - вакциной, представляющей собой комплекс полимер /
ДНК Ag85B (Pla99a-2Q6A - и Pla99a-2Q6A +);
2. субъединичной вакциной Ag85B [Al(OH)3];
3. БЦЖ.
Полиплексы, состоящие из комплексов (Pla99a-2Q6A - pDMAEM-g-PEO-2 / ДНК Ag85B) и (Pla99a-2Q6A - pDMAEM-g-PEO-3 / ДНК Ag85B) индуцировали высокий уровень защиты иммунных мышей от вирулентного штамма H37Rv M. tuberculosis, сравнимый с БЦЖ и субъединичной вакциной Ag85B [Al(OH)3]. Резуньтаты исследований свидетельствуют о перспективности использования полиплексов, содержащих на своей поверхности белок Pla, обеспечивающий взаимодействие наночастицы с DEC-2Q5 (CD2Q5) рецепторами и адресную доставку ДНК в дендритные клетки.
Дендритные клетки выполняют функции триггерного механизма в запуске адаптивного иммунитета. Доставка иммуногена в дендритные клетки через DEC-2Q5 (CD 2Q5) рецептор индуцирует in vivo развитие адаптивного иммунитета [1]. Ранее нами было показано, что рекомбинантный белок - активатор плазминогена Pla обладает высоким сродством к DEC-2Q5 (CD 2Q5) рецепторам на поверхности дендритных клеток [2].
Цель наших исследований - конструирование наночастиц на основе катионных блоксополимеров, обладающих высоким сродством к DEC-2Q5 (CD2Q5) рецепторам и обеспечивающих адресную доставку ДНК в дендритные клетки.
Материалы и методы
Синтез катионных блоксополимеров. В данной работе катионный полимер - poly[(2-dimethylaminoethyl) methacrylate] (pDMAEM) получен радикальной полимеризацией мономера в толуоле при 6Q °С. Блоксополиме-ры pDMAEM-g-PEO-2 и pDMAEM-g-PEO-З получены сополимеризацией pDMAEM и поли(этиленоксид)монометилметакрилата (PEOMA). Молекулярно-массовые характеристики получали из седиментационного анализа с расчетом по методу Арчибальда, или методом ГПХ. Молекулярные массы блоксополимеров составляли MSD = 392 тыс. иMSD = 165 тыс., соответственно.
Активатор плазминогена Pla Y.pestis. Был использован рекомбинантный модифицированный белок - активатор плазминогена Pla99a-206A, лишенный протеолитической активности, но сохранивший способность связываться с DEC-205 (CD205) рецепторами дендритных клеток. Известно, что замена каталитических аминокислотных остатков в белке Pla:S99A и S206D приводит к потере протеолитической активности [3, 4].
Иммунизация мышей. Для проведения исследований мыши BALB / с (возраст 6-8 недель) были закуплены в Питомнике «Столбовая», Московская обл., РАМН. Все исследования были согласованы с этическим комитетом Института. В начале эксперимента вес мышей составлял 18-20 г. Мышей содержали при 22 °Си 55 % влажности, доступ к воде и пище был свободен. Для забивки мышей применяли CO2.
1. Иммунизация мышей полимер / ДНК комплексами. Контрольные группы.
Мышам вводили плазмидную ДНК, кодирующую Ag85B (100 in saline) в.м. трехкратно с трехнедельным интервалом (контроль). Мышам вводили векторную ДНК по аналогичной схеме (отрицательный контроль).
Экспериментальные группы.
Мышей C57BL/6 иммунизировали комплексами полимер/ДНК, кодирующая Ag85B подкожно трехкратно с трехнедельным интервалом в дозе 50^g ДНК. Опыты проводили через три недели после последней иммунизации.
2. Иммунизация белком Ag85B [Al(OH)3].
Ag85B [Al(OH)3] (alhydrogel) был получен путем контролируемой сорбции стерильного рекомбинантного Ag85B на [Al(OH)3] как адъюванте.
Ag85B [Al(OH)3] в дозе 0,2 ml/мышь (10 ^g Ag85B) вводили подкожно трехкратно с 2-х недельным интервалом и использовали в опытах через 3 недели после последней иммунизации.
3. Иммунизация БЦЖ.
Мышей C57BL/6 иммунизировали однократно подкожно (5 х 104 CFU/ мышь).
Заражение экспериментальных животных.
Через три недели после последней иммунизации мышам внутривенно вводили 5 х 104 CFU штамма H37Rv. Две недели спустя мышей усыпляли в атмосфере CO2 и исследовали обсемененность селезенки путем высева на агар. В эксперименте 2 проведена оценка ингибирования роста вирулентных бактерий в легких мышей.
Радилигандный анализе еязыеания 125I-Pla.
Мечение Pla 99A-2o6A и связывание 125I-Pla 99А-2обА с полиплексами.
125I-Pla 99A-206A (0,11 mCu/^g) был получен с помощью Iodo-Gen (Pierce, Rockford, IL.) и не связавшийся 30Na125I был удален хроматографией на Sephadex G-25. 125I-Pla с различной активностью инкубировали с поли-
плексами в объеме 3QQ (^L) 1 час при 37 °C. Не связавшийся с полиплек-сами 125I-Pla был удален хроматографией на колонке Polymer Laboratories PL aquagel-OH mixed H8 micrometers.
Результаты
С помощью электронной микроскопии было установлено, что после взаимодействия ДНК Ag85B c pDMAEM-g-PEO-2 происходит самоорганизация наночастицы диаметром 5Q-1QQ нм. Процесс самоорганизации включает упаковку плазмидной ДНК Ag85B внутри наночастицы. Электронные микрофотографии комплексов ДНК pDMAEM-g-PEO-2 с различным содержанием P:N представлены на рис. 1 и 2. При соотношении P:N = 1:4 на микрофотографии можно видеть как кольцевые фрагменты ДНК, так и нитевидные, покрытые макромолекулами поликатиона (рис. 1).
200 пт
Рис. 1. Электронная микрофотография комплекса ДНК / рБМАЕМ^-РЕО-2 в буферном растворе при соотношении P:N = 1:4
С увеличением соотношения поликатиона в комплексе ДНК / ПДМАЕМ-^-ПЭО-2 до 8 происходит образование наночастиц размером 50-100 нм с темным ядром внутри, образованным конденсированной плазмидной ДНК (рис. 2).
Рис. 2. Электронная микрофотография комплекса ДНК рБМАЕМ^-РЕО-2 в буферном растворе при соотношении Р: N = 1:8
С помощью радиолигандного анализа было установлено, что поверхность образовавшейся наночастицы приобретает свойства акцептора для Р1а99а-206А. Взаимодействие Р1а99а-2обА с поверхностью наночастицы характеризуется Кй (М) = 10-11. В комплексе (Р1а- рБМАЕМ^-РЕО-З / ДНК Ag85B) все пять гидрофильных петель Р1а99а-206А доступны МАТ (анти Ь-1, Ь-2, Ь-3, Ь-4, Ь-5) и анти Р1а99а-206А поликлональным кроличьим антителам. Петли ЬЗи Ь5 являются наиболее важными для связывание Р1а-полиплекса с БЕС-205 (СБ205) рецепторами на поверхности дендритных клеток (Кй (М) = 10-14). Согласно полученным данным за взаимодействие с поверхностью наночастицы отвечает мембраносвязывающая область, обеспечивающая заякоривание Р1а на поверхности бактериальной клетки. Все пять гидрофильных петель Р1а99а-206А находятся в экстраполиплексном пространстве. Петли Ь-Зи Ь-5 являются наиболее важными для взаимодействия Р1а-полиплекса с БЕС-205 (СБ205) рецепторами на поверхности дендритных клеток (Кй (М) = 10-14).
Проведено сравнение эффективности защиты мышей, иммунизированных комплексами полимер / ДНК, Ag85B (Р1а- и Р1а+), Ag85B [А1(ОН)3] и БЦЖ (табл. 1).
Таблица 1
Защита мышей иммунизированных полиплексами
Полиплексы, используемые при иммунизации мышей Значения log1Q CFU ofM. Tuberculosis в селезенке (M і m).
рБМАЕМ^-РЕО-Э / ДНК вектор 6,43 і 0,03
Р1а- pDMAEM-g-PEO-3 / ДНК вектор 6,45 і 0,04
Незащищенная ДНК Ag85B 5,84 і 0,06 *
pDMAEM-g-PEO-3 / ДНК Ag85B 5,76 і 0,05 **
pDMAEM-g-PEO-2 / ДНК Ag85B 5.78 і 0,04 **
Р1а- pDMAEM-g-PEO-3 / ДНК Ag85B 5,57 і 0,06 ***
Р1а- pDMAEM-g-PEO-2 / ДНК Ag85B 5,66 і 0,07 ***
Белок Ag85B 5,61 і 0,08 ***
БЦЖ 5,47 і 0,05 ***
Примечание: Мыши (n = 5 / группа).
* - p < 0,05;
** - p < 0,01;
*** - p < 0,001 в сравнении pDMAEM-g-PEO-3/DNA вектор.
Комплексы (Pla- pDMAEM-g-PEO-3/ДНК Ag85B) и (Pla- pDMAEM-g-PEO-2/ДНК Ag85B) индуцировали уровень защиты, сравнимый с БЦЖ и Ag85B [Al(OH)3]. Эти результаты свидетельствуют о перспективности по-липлексов, содержащих на своей поверхности белок Pla 99A-206A обеспечивающий взаимодействие с DEC 205 (CD205) DCs.
* * *
Комплексы (Pla- pDMAEM-g-PEO-2/ ДНК Ag85B) и (Pla- pDMAEM-g-PEO-3/ ДНК Ag85B) индуцируют высокий уровень защиты, сравнимый с субъединичной вакциной Ag85B [Al(OH)3] и БЦЖ.
Список литературы:
1. Do Y, Park C., Kang V. et al. Broad T cell immunity to the LcrV virulence protein is induced by targeted delivery to DEC-205 (CD205)-positive mouse dendritic cells // Eur. J. Immunol. - 2008. - Vol. 38. - P. 20-29.
2. Abramov, V.M., Khlebnikov VS., Vasilicv A.M., Kosarev I.V. Vasilenko R.N., Kulikova N.L., Motin VL., Smimov G.B., Evstigneev V.I., Karkischenko N.N., Uversky V.N., Brubaker R.R. A study of the interaction of Yersinia pestis virulence factors with 1L-1R/TLR recognition system: a key to the understanding of plaque pathogenesis mechanisms and the creation of specific protection means of a new generation. Frontiers in Research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Bethesda, MD (Vassil St. Georgiev. Series Editor). Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC, ISBN 978-1-934115-77-0. 2008. - Vol. 1. - P. 215-225.
3. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N., Egmond M.R., Gros (2001) Crystal structure of the outer membrane protease Omp T from Escherichia coli suggests a novel catalytic site // EMBO J. - Vol. 20. - P. 5033-5039.
4. Kukkonen M., Lahteenmaki K., Suomailen M. et al. Protein regions important for plasminogen activation and inactivation of a2-antiplasmin in the surface protease Pla of Y. pestis // Mol. Microbiol. - 2001. - Vol. 40. - P. 1097-1111.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНАЛАПРИЛА И ЭНАЛАПРИЛАТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭЖХ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ И ОСОБЕННОСТИ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ЭНАЛАПРИЛА И ЭНАЛАПРИЛАТА У ЛИЦ СТАРЧЕСКОГО ВОЗРАСТА С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ
© Боброва О.П.*, Гребенникова В.В.4
Красноярский медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск
У пациентов старческого возраста с артериальной гипертонией изучены фармакокинетические параметры ингибитора ангиотензинпрев-ращающего фермента эналаприла. У лиц старше 75 лет проведено сравнение фармакокинетических кривых эналаприла и эналаприлата (Нидерланды) и эналаприла и эналаприлата (Сербия).
* Ассистент кафедры Фармакологии с курсом фармтехнологии, клинической фармакологии и последипломного образования. Научный руководитель: Гребенникова В.В., заведующий кафедрой Фармакологии с курсом фармтехнологии, клинической фармакологии и последипломного образования, доктор медицинских наук, профессор.
* Заведующий кафедрой Фармакологии с курсом фармтехнологии, клинической фармакологии и последипломного образования, доктор медицинских наук, профессор.
