CC BY
37
E., Dorrell N., Foynes S. et al. II J. Bacteriol. - 2000. -Vol. 182, N 18. - P. 5274-5277. - 8. Andersen L.P., Espersen
F., Souckova A. et.al. II Clin. Diagn. Lab. Immunol.. - 1995. -Vol. 2, N 2. - P. 156-159. - 9. Aucher P., Petit M.L., Man-nant P.R|. et al. II J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 4. -P. 931-936. - 10. Johansen H.K., Norgaard A., Andersen L.P. et al-J // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1995. - Vol. 2, N 2. -P. 149-155. - 11. Laemmli U. // Nature. - 1970. - Vol. 222. -P. 293-298. - 12. Laheij R.J.F., Staatman H., Jansen J.B. et al. II J. Clin. Microbiol. - 1998. — Vol. 36, N 10. - P. 2803. -13.,Mattsson A., Tinnert A., Hamlet A. et al. ll Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1998. - Vol. 5, N 3. - P. 288-293. -14.Towbin H., Stacytlin Т., Gordon J.//Proc. Natl. Accad.
Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.
УДК 616.24-002-022:616.9
Iі ...
ГЛ.Карбышев, А.Н.Терентьев, Л.М.Веркина, А.Н.Наркевич, Е.В.Безуглова,
И.Р.Симонова, А.П.Кочет|кова
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА Сообщение 1. Конструирование и экспериментальные испытания легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
В работе представлены результаты исследований по конструированию диагностикума легионеллезного серогруппы 1 полимерного для реакции объемной агломерацни.|| Описаны условия получения диагностикума. Представлены результаты экспериментального определения ч>^твительности и специфичности, разработанного диагностикума. Полученные результаты позволяют рекомендовать диагностикум к. практическому использо-
ях заболевания - до 10-го дня [10, 11, 12, 13].
Целью настоящего исследования явилось конструирование полимерного антигенного легионеллезного диагностикума на основе антигенов Legionella prieumophila серогруппы 1 для реакции объемной агломерации (РАО).
Материалы и методы
Для конструирования антигенного диагностического препарата использовали штамм Legionella pneumophila Philadelphia серогруппы 1 штамм 15976, типичный по' культуральным, морфологическим, серологическим, биохимическим свойствам.
Для культивирования микроорганизмов применяли элективную питательную среду (СЭЛ) для выделения и| культивирования возбудителя легионеллеза, разработанную сотрудниками института и рекомендованную в практику при посеве L. pneumophila Philadelphia на питательные среды. Наблюдали рост легионелл в виде синевато-сероватых плоско-выпуклых'; колоний диаметром 1,5-2 мм. В проходящем свете колонии имели зеленоватый оттенок с влажно-волокнистой микроструктурой.
Полимерные микросферы диаметром (2+0,5) мкмоль/г получали методом анионной полимеризации акрилового альдегида в водно-щелочной среде. Окрашенные частицы получали добавлением красителя в полимеризационную смесь в процессе синтеза. Выход полимерного носителя составил 75 %, содержание альдегидных групп - 1,3 ммоль/г.
Растворимый легионеллезный антиген полу-
ванию в учреждениях здравоохранения страны.
i ' ‘
I
Болезни легионеров - острое лихорадочное заболевание, вызываемое группой микроорганизмов, относящихся к семейству Legionellaceae ведущее значение среди которых играет Legionella pneumophila серогруппы 1, с воздушно-капельным механизмом передачи и поражением верхних дыхательных путей в случае непневмонической формы -респираторной лихорадки Понтиак и нижних дыхательных путей - в случае пневмонической формы заболевания [2].
Впервые на территории нашей страны легионеллез зарегистрирован в 1979 г. [4, 5], а в последующем! отмечены спорадические и отдельные групповые вспышки заболеваний [1, 3, 6, 7]. Однако в целом 'это заболевание продолжает оставаться малоизвестным в нашей стране. Сложности бактериологической диагностики, отсутствие коммерческих тест-систем для серологической диагностики и трудности клинической диагностики заболевания делают проблему легионеллеза в настоящее время малодоступной для практического здравоохранения. В то же[ время наиболее доступным для практиче-скЬго здравоохранения являются серологические методы диагностики.
В настоящее время для серологической диагностики легионеллеза в мире используют три метода: реакцию^ непрямой иммунофлюоресценции, имму-ноферментный анализ и реакцию агломерации латекса [9]. Ранее в литературе было описано, что реакция латексной агломерации является более чувствительной, чем реакция непрямой иммунофлюоресценции, и выявляет диагностические титры на ранних стади-
E.A.Bereznyak, G.L.Karbyshev, A.N.Terentiev, V.N.Neklyaev, A.N.Narkevich
I Construction
of a Helicobacterial Antigenic Polymer Diagnosticum Preparation-
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Summarized in the.paper are the results of the efforts to optimize the combination of conditions for the production of helicobacterial antigenic polymer diagnosticum for agglomeration reactions. The evidence thus obtained makes impossible to conclude that the diagnosticum is an efficient tool to verify the helicobacterial infection which can be used in populational epidemiologic investigations.
1 Поступила 05.07.05.
чали тремя способами: дезинтеграцией ультразвуком при режиме 18 килоциклов в течение 30 мин на дезинтеграторе MSE, лизисом микробной массы дезоксихолатом натрия (0,5 мл 1 % раствора на 2 мл? бактериальной массы с концентрацией 7-10 м.к./мл) и комбинацией ультразвука и дезо-ксихолата натрия с последующим центрифугированием при 8 тыс. об./мин в течение 30 мин. Полученный супернатант использовали в качестве сенси-тина. Во всех случаях микробную взвесь предварительно инактивировали прогреванием при 80 °С на водяной бане в течение 1 ч. Содержание белка в супернатанте определяли методом Лоури, углеводов по Дюбо, липидов по биотесту Хемапол, нуклеиновых кислот по Спирину.
Лиофилизацию диагностикума легионеллезно-го антигенного серогруппы 1 полимерного для РАО осуществляли в 3 % желатозо-сахарозной средой высушивания с предварительным замораживанием спиртовым охлаждением при температуре минус (45+5) °С в течение (10+2) мин. Лиофилизацию диагностикума проводили в течение (23+1) ч.
При получении легионеллезной кроличьей сыворотки для иммунизации использовали убитую кипячением в течение 30 мин бактериальную массу Legionella pneumophila серогруппы 1 штамм 15976. Для иммунизации кроликов использовали модифицированную нами схему с предварительным введением иммуномодулятора Т-активина. Активность легионеллезной кроличьей сыворотки контролировали в сравнении с коммерческой кроличьей сывороткой (институт им. Н.Ф.Гамалеи). Титры полученной сыворотки должны быть не ниже 1:640 - 1:1280.
Результаты и обсунедение
В качестве сенситина для получения диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного сухого для РАО применяли специфический растворимый легионеллезный антиген, полученный комбинированным методом с применением ультразвука и последующей обработкой дезоксихолатом натрия. Экспериментально показано, что комбинированное разрушение клеток ультразвуком и дезоксихолатом приводит к существенному увеличению выхода белка и других основных веществ. В полученных препаратах сенситинов концентрация белка варьировала 0,8-1,2 мг/мл, углеводов 0,55-0,74 мг/мл, липидов 4,4-5,2 мг/мл.
Исследование белкового спектра растворимого легионеллезного антигена методом диск-электрофореза в полиакриамидном геле в присутствии 0, 1 % додецилсульфата натрия (SDS) показало, что комбинированный метод разрушения клетки приводит к получению пула белков, которые хорошо видны в областях 19, 20-23, 28-30, 48, 58-60 и 84 KD. В области 28-30 KD выявлялась более крупная и окрашенная зона, которая соответствует главному белку собственной мембраны - МОМР, выполняющему функцию порина бактериальной клетки. Остальные полосы в зонах 20-23, 48, 58-60 KD соответствуют основным антигенным структурам Legionella pneumophila, описанным в литературе: МЕР-белку, фла-геллину и Hsp-60 - белку теплового шока соответственно, которые являются факторами вирулентности микроорганизма.
При исследовании растворимого легионеллезного антигена методом иммуноблоттинга с легио-
неллезной кроличьей сывороткой серогруппы 1 показана высокая иммуногенность вышеперечисленных антигенов. После обработки проназой полосы в иммуноблоттинге исчезали, что может свидетельствовать об их белковой природе.
Таким образом, представленные данные позволяют полагать, что полученный нами растворимый легионеллезный антиген содержит полноценные антигенные компоненты Legionella pneumophila, отвечающие за антигенность, вирулентность и йм-муногенность возбудителя.
Для сенсибилизации полимерного носителя использовали препараты растворимого легионеллезного антигена с концентрацией по белку от 1,0 до 2,5 мг/мл. Варьирование концентрации белка в препарате осуществляли путем разведения препарата фосфатным буферным раствором концентрацией 0,15 моль/л, pH 7,1+0,1. Оптимальная сенсибилизирующая доза специфического растворимого легионеллезного антигена составляла 2,2 мг по белку на 25 мг полимерного носителя. Иммобилизацию антигена на частицах носителя осуществляли в фосфатном буферном растворе концентрацией 0,15 моль/л, pH 7,1+0,1.
Экспериментальное изучение чувствительности диагностикума легионеллезного антигенного полимерного проводили на пяти сериях сывороток: четырех сериях кроличьих легионеллезных сыворотках, полученных в Ростовском НИПЧИ, и сыворотки производства института им. Н.Ф.Гамалеи. Чувствительность диагностикума составила в реакции объемной агломерации 1:320 до 1:1280.
Разработанный препарат специфичен. Для подтверждения специфичности отработана реакция торможения: при добавлении микробной взвеси Legionella pneumophila в концентрации 108 м.к./мл наблюдали укорочение ряда специфической агломерации на четыре лунки.
Изучение специфичности диагностикума проводили с панелью гетерологичных гипериммунных коммерческих сывороток различных серий. Были использованы следующие гетерологичные сыворотки: чумная, туляремийная, лептоспирозная к 15 се-рогруппам, холерная, бруцеллезная, псевдотуберкулезная, стафилококковая, сальмонеллезная, шигел-лезная, эшерихиозная, дифтерийная, риккетсиозная (Провачека), риккетсиозная Q и нормальный человеческий донорский у-глобулин, который представляет собой пул сывороток, собранных от 2-3 тыс. доноров. Результаты представлены в таблице.
Выявлены следующие результаты: титры 1:40 с сыворотками двух сероваров лептоспир - L. hebdo-madis, L. canicola, титры 1:20 с сыворотками L. pyrogenes и лихорадки Q. По данным литературы, наиболее часто выявляются перекрестные серологические реакции легионелл с антигенами лептоспир и риккетсий Бернета, однако разработанный нами диагностический препарат выявляет указанные гете-рологические сыворотки в титрах, не превышающих диагностические (диагностический титр 1:80).
Полученный диагностикум прошел Государственные испытания в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и рекомендован к внедрению в практику здравоохранения [8].
Таким образом, разработан и внедрен в практику простой высокочувствительный и специфичный диагностический препарат для реакции объемной
Наименование иммунной сыворотки , Разведения сывороток Контр.
1:20 1:40 1:80 1 1:160 1 1:320 1:640 1 1:1280 НКС
Результаты исследования чувствительности и специфичности диагностикума легионеллезного серогруппы I
антигенного полимерного сухого
Легионеллезная V.
с. 1097. ' + - +
с. 1098 '■ ' + • + ; + +
с. 1099 + + + + i +
с. <145 + + + + + +
I
Реакция торможения + + + - :
Чумная кроличья С. 37 с. 38
лошадиная (1:100), с. 133 Туляремийная кроличья, с. 892 лошадиная (1:100) с. 77 •
с. 99
7
Бруцеллезная, с. 1117 Холерная О лошадиная (1:100), с.(
Стафилококковая, с. 16 Дифтерийная Сальмонеллезная, с. 6 Шигеллезная, с. 79 Эщерихнозная груп. полив.
Риккетсиозная Провачека Нормальный Y-глобулин человека Лептоспирозные Mini
Pyrogenes,
Cynopteri Australis Javanica Autiimnalis Bataviae Ballùm Sejroe
Grippotyphosa Tarasovi
lcterohaemorragiae Pomona Canicola Hebdomadis
Псевдотуберкулезная поливалёнтная, с. 1124 -
Риккетсиозная Q + -
агломерации с целью серологической диагностики легионеллеза.
Í ■ ¡ '
: { СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Беленький С.Н. // Сб. науч. тр. 1-го Моск. мед. ин-та иМ. И.М.Сеченова. - М., 1984. - С. 57—61. — 2. Прозоровский С.В., П[6кровский В.И., Тартаковский Й.С. Болезнь легионеров. - М., 1988. - 3. Покровский В.И., Тартаковский И.|С. и др. // Сов. медицина. - 1982. - № 3. - С. 96-98. -
4.!Прозоровский С.В. // Журн. микробиол. - 1979. - № 2. -С. 8-14. - 5. Прозоровский С.В., Васильева В.И., Тартаковский И.С. и др. // Журн. микробиол. - 1980. - № 7. -!С. 105--1.07. - 6: Прозоровский С.В., Русакова Е.В., Рычнев ¡A.E. и др. // Журн. микробиол. - 1987. -№ 4..- С. 34-37. - 7. Сакварелидзе JI.A., Нерсесов В. А., Мгеладзе Ю.Г. и др. // Журн. микробиол. - 1990. - № 1. - С. 42-44. -8.;Саяпина JI.B., Адамова Г.В., Анисимова Т.Н. и др. // Про'бл. особо опасных инф. - 2004. - Вып. 1 (18). - С. 61-63. - 9. Эпидемиология, профилактика легионеллеза и борьба с ним: меморандум совещания ВОЗ // Бюлл. ВОЗ. - 1990. -Т: 68, № 2. - С. 7-17. - 10. Harrison Т.С., Dournon Е.( Taylor AL С. // J. Clin. Pathol. - .1987. - Vol. 10, N. 1. - P. 77-
82. - 11. Friis-Moller A., Rechnitzer C., Black F.T. et al. // ScandJiJ. infect. Dis. - 1986. - Vol. 18, N 4. - P. 321-328. -
12. MarrieilT.J., George J., Macdonald S., Haase D. // Am. J. Infebt. Control. - 1986. - Vol. .14, N. 5. - P. 209-213. -
13. Scarlini G., Carlino G., Coletti C. el al. II Boll. Inst. Sieroter. Milan. - 1986. - Vol. 65, N 4. - P. 298-303.
G.L.Karbyshev, A.N.Terentiev, L.M.Verkina, A.N.Narkevich,
; E.V.Bezuglova, I.R.Simonova, A.P.Kochetkova'
Construction of a Preparation for Legionellosis Serologic Diagnosis Communication 1. Construction and Experimental Trials of Legionellosis Serogroup 1 Antigenic Polymer Diagnosticum
: Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Described in the paper are investigations into designing a legionellosis serogroupj,l polymer diagnosticum of to be used in the reaction of volumetric agglomeration. Specific conditions for preparing the diagnosticum are described!! The results of experimental assessment of the sensitivity and specific properties of the diagnosticum are analyzed and the information thus obtained is considered favorable enough for the diagnosticum to be recommended for practical use in medical facilities of Russia,
Поступила 26.05.05.
