CC BY
27
иммунология
УДК 616.981.452:576.8.097.3
С.А.Агеев, Р.З.Шайхутдинова, И.В.Бахтеева, Г.М.Титарева, Т.И.Комбарова, С.В.Дентовская,
А.П.Анисимов
конструирование кандидата в вакцинные штаммы YERSINIA PESTIS С пониженной РЕАКТогЕнноСТЬЮ
ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск.
Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих AlpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез, клонирование мутантной аллели MpxM::cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ но-каутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезировал липополисахарид (ЛПС) со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. Степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM, была значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.
Ключевые слова: lpxM, сайт-направленный мутагенез, липополисахарид, эндотоксическая активность, Yersinia pestis.
Применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного штамма У. рв8ІЇ8 ЕУ стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [4]. Однако и эта вакцина имеет значительные ограничения в применении из-за ее высокой реактогенности, связанной с наличием липополисахарида (ЛПС) в составе клеточной стенки У. рв8ІЇ8. Одним из возможных путей уменьшения реактогенности является генно-инженерная модификация ЛПС, предотвращающая встраивание в липид А шестого жирно-кислотного остатка лау-риновой кислоты [2]. Ранее был сконструирован мутант вакцинного штамма ЕУ с нарушенным встраиванием лауриновой кислоты, у которого центральная часть кодирующего ее гена ІрхМ была замещена на ген устойчивости к канамицину. По данным авторов, по сравнению с исходным вакцинным штаммом ЫрхМ::кап мутант обладал сниженной реактогенно-стью [5, 8]. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости [9]. Поэтому целью настоящего иссле-
дования была разработка методики получения мутантного по гену lpxM штамма Y. pestis, лишенного маркеров лекарственной устойчивости как основы для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, плазмиды, клеточные линии и животные. Для мутагенеза использовали вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ. Для проведения генетических манипуляций применяли штаммы Escherichia coli DH5a Xpir (конструирование суицидной плазмиды для мутагенеза) и S17 Xpir (конъюгативный перенос сконструированной суицидной плазмиды в клетки Y. pestis). Штаммы E. coli выращивали на жидких и плотных питательных средах Луриа-Бертани при температуре 37 °С [12]. Клетки Y pestis выращивали на жидких и плотных питательных средах Хоттингера (pH 7,2-7,4) при температуре 28 °С. Использованные в работе плазмиды представлены в таблице.
В качестве клеток-индукторов TNF-a использовали макрофагоподобную мышиную линию J774.1A и линию человеческих промиелоцитов U937. Летальную токсичность ЛПС и индукцию TNF-a in vivo определяли для 8-10-недельных самок мышей
Использованные плазмиды
Плазмида
Характеристика
Источник
pCP20 bla cat cI857 XPRflp pSC101 oriTS [6]
pCVD442 oriR6K, mobRP4, bla, sacB [7]
pCVD442- AlpxM::cat pCVD442, содержащая фрагмент AlpxM::cat Настоящее исследование
pKD3 bla FRT cat FRT PS1 PS2 oriR6K [6]
pKD46 bla PBAd gam bet exo pSC101 oriTS [6]
Рис. 1. Схема конструирования LpxM-варианта штамма Y. pestis EV
линии BALB/c массой (19±2) г.
Конструирование штаммов Y. pestis с инактивированным геном lpxM. Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству T.Maniatis et al. [11].
На основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, предварительно трансформированного RedGam-хелперной плазмидой pKD46, был получен мутант AlpxM::cat путем замены кодирующей последовательности гена на кассету устойчивости к хлорамфениколу [6] (рис. 1). ПЦР-продукт для мутагенеза, амплифицированный с праймерами Cat1-f (ataacgtgtcttctgtaatgatgattagcccaccgccaattctaagagtttcccc gtgtaggctggagctgcttc) и Cat2-r (tggtacgaccaataccagtcg-tatcatccgcgtcgaataagttatttttaagataatgggaattagccatggtcc), представлял собой ген cat плазмиды pKD3, ограниченный FRT сайтами и фланкированный с двух сторон короткими участками гомологии (55 п.н.) гена lpxM. После введения методом электропорации в вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ 100 нг полученного ПЦР-продукта отбирали клоны с фенотипом CmRApR. В дальнейшем мутантную аллель AlpxM::cat сконструированного штамма Y. pestis EVAlpxM::cat/pKD46 амплифицировали с праймерами Cat3-f (agtctgtcagcccatcgtag) и Cat4-r (atggtgc-ccatcacatcgcc) и клонировали в суицидном векторе pCVD442, предварительно гидролизованном SmaI, в клетках E. coli DH5a Xpir. Передачу рекомбинантной плазмиды pCVD442-AlpxM::cat в штамм E. coli S17 Xpir осуществляли методом электропорации, а из него в штамм Y pestis EV линии НИИЭГ - методом конъюгативного переноса. Контрселекцию конъю-гантов Y. pestis и вторичную рекомбинацию проводили, как описано ранее [7].
Удаление кассеты устойчивости к хлорамфе-николу в инактивированном гене и последующую элиминацию плазмиды pCP20 проводили, как описано ранее [6]. В результате был получен лишенный маркера антибиотикоустойчивости штамм Y. pes-tis EVAlpxM (ApSCmS) с инактивированным геном lpxM. Для подтверждения корректности структуры полученных мутантов на каждом из этапов мутагенеза использовали ПЦР (рис. 2). Для определения нуклеотидной последовательности фрагмента AlpxM штамма Y. pestis EVAlpxM использовали прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК.
Выделение и анализ структурыЛПС. Выделение. электрофоретический контроль препаратов и визуализацию ЛПС в полиакриламидных гелях, а также
Рис. 2. Сравнительный анализ продуктов амплификации ДНК штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, EVAlpxMwcat и EVAlpxM:
Треки: 1, 2 - EVAlpxM (1268 п.н.); 5, 4 - EVAlpxM::cat (2198 п.н.);
5, 6 - EV НИИЭГ (2457 п.н.); 7 - ДНК X гидролизованная рестриктазой HindIII. Электрофорез в 0,7 % агарозном геле
определение структуры полученных препаратов ЛПС с помощью масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с Фурье преобразованием и ионизацией электрораспылением (МС ИЭР) проводили, как описано ранее [10]. В качестве отрицательного контроля при изучении индукции цитокинов и определении летальной токсичности использовали ЛПС вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10, не обладающий эндотоксической активностью [3]. В качестве положительного контроля в экспериментах по индукции цитокинов использовали ЛПС штамма E. coli O55:B5 (Sigma).
Индукция TNF-a in vitro и in vivo. В экспериментах in vivo определяли количество TNF-a в сыворотке крови мышей BALB/c, сенсибилизированных актиномицином Д, после введения препаратов ЛПС в дозе 50 мкг/мышь. В экспериментах in vitro определяли количество TNF-a в супернатанте клеток млекопитающих после их инкубации с ЛПС в дозах от 3 до 300 нг/мл в течение 18 ч. Количество TNF-a в клеточном супернатанте или в сыворотке крови мышей методом иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы Bender MedSystems.
Определение летальной токсичности ЛПС. Токсичность ЛПС определяли по величине LD50 после подкожного введения 5-кратных разведений препаратов ЛПС мышам линии BALB/c. Вычисление величин ld50 и доверительных интервалов (для вероятности 95 %) определяли по методу Karber в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [1].
Оценка безвредности. Определение безвредности исследуемых штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.111302 «Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба».
Результаты и обсуждение
Разработанная методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоу-стойчивости неревертирующих мутантов Y. pestis,
сочетающая прямой саит-направленныи мутагенез, клонирование мутантной аллели AlpxMwcat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику позволила нам получить AlpxM мутант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Препарат ЛПС, выделенный из мутантного штамма, мигрировал в ДСН-ПААГ быстрее и с образованием более компактной полосы, чем препарат исходного штамма EV линии НИИЭГ, подтверждая меньший размер молекул. Согласно результатам проведенной МС ИЭР, масс-спектр липида А EVAlpxM включал только те-траацильные и пентаацильные варианты, в то время как в масс-спектре исходного штамма EV НИИЭГ присутствовали тетраацильные, пентаацильные и гексаацильные производные липида А.
Мы оценили TNF-a-индуцирующую активность препаратов ЛПС, выделенных из мутантного штамма Y. pestis EVAlpxM и вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, используя мышиную макрофагоподобную клеточную линию J774A.1 и линию человеческих промиелоцитов U937. Индукция синтеза TNF-a препаратом ЛПС из штамма Y pestis EV НИИЭГ для обеих клеточных культур была дозозависимой и не отличалась от таковой контрольного ЛПС штамма E. coli O55:B5. Модифицированный ЛПС слабее индуцировал синтез TNF-a макрофагами по сравнению с ЛПС «дикого типа». Использование клеток-мишеней различной видовой принадлежности позволило установить, что уменьшение эн-дотоксической активности мутантного ЛПС более выражено на человеческих, и менее - на мышиных клетках-мишенях (рис. 3). Количество TNF-a в супернатанте моноцитарных клеток U937 увеличивалось незначительно и практически не отличалось от уровня, индуцируемого ЛПС F. tularensis 15/10, который был использован в качестве отрицательного контроля. Выявленное различие провоспалительного ответа макрофагов разной видовой принадлежности на действие исходного и мутантного ЛПС, скорее всего,
обусловлено разной специфичностью рецепторов к ЛПС у человека и мыши [13].
Данные, полученные нами на мышиной макрофагоподобной клеточной линии J774A.1 in vitro, согласовались с данными, полученными на мышах линии BALB/c в экспериментах in vivo. Внутрибрюшинное введение обоих препаратов ЛПС мышам, сенсибилизированным актиномицином Д, приводило к индукции синтеза TNF-a. Уровень TNF-a в сыворотке мышей после введения ЛПС исходного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ достоверно превышал аналогичный показатель для препарата ЛПС EVAlpxM - (52,9±5,9) нг/мл и (38,0±4,1) нг/мл соответственно. Уровень TNF-a у животных контрольной группы не поднимался выше 50 пкг/мл. Введение ЛПС F. tularensis не приводило к повышению уровня сывороточного TNF-a у мышей.
Уровни LD50 для ЛПС родительского штамма Y. pestis EV НИИЭГ и мутантного штамма EVMpxM для мышей линии BALB/c составили 648,3 (2055149,3) и 129,7 (32,6-516,2) мг/мышь соответственно. Таким образом, делеция гена lpxM приводила к пятикратному снижению токсичности мутантного ЛПС.
Оценка безвредности штамма EVMpxM для белых мышей линии BALB/c по сравнению с исходным штаммом EV НИИЭГ также продемонстрировала снижение его токсических свойств. Иммунизация мышей мутантным штаммом EVAlpxM не вызывала гибели животных при подкожном введении его в дозах от 102 до 107 КОЕ, тогда как введение эталонного штамма EV НИИЭГ в дозах 105 и 107 КОЕ на мышь приводило к гибели 10 и 40 % животных.
Таким образом, разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости lpxM мутантов Y. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью, а также может быть легко адаптирован для других грамотрицательных бактерий. Созданный на основе
Рис. 3. Уровни ТОТ-а в супернатанте макрофагоподобных мышиных клеток J774.1A (А) и моноцитарных клеток человека Ш37 (Б) после стимуляции препаратами ЛПС из штаммов У. резйз ЕУ НИИЭГ и ЕУА1рхМ
вакцинного штамма Y pestis EV линии НИИЭГ но-каутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезировал ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. Степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM, была значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.
Работа выполнена по государственным контрактам J№ 124-Д от 11.06.2009 г. и J№ 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (20092013 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы; 1962, 104 с.
2. Дентовская С.В., Шайхутдинова Р.З., Книрель Ю.А. Иванов С.А., Анисимов А.П. Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенно-стью. Мол. генет. 2006; 2:3-8.
3. Дентовская С.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Шайхутдинова Р.З., Кондакова А.Н., Быстрова О.В. и др. Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липо-полисахарида Yersinia pestis. Биохимия. 2008; 73(2):237-46.
4. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17(2):434-64.
5. Anisimov A.P., Shaikhutdinova R.Z., Pan’kina L.N., Feodorova V.A., Savostina E.P., Bystrova O.V. et al. Effect of deletion of the lpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice. J. Med. Microbiol. 2007; 56( 4):443-53.
6. Datsenko K., Wanner B. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97:6641-45.
7. Donnenberg M.S., Kaper J.B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 1991; 29(12):4310-7.
8. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Sayapina L.V., Motin V.L., Dentovskaya S.V et al. A Yersinia pestis lpxM-mu-tant live vaccine induces enhanced immunity against bubonic plague in mice and guinea pigs. Vaccine. 2006; 25:7620-8.
9. Frey J. Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines. Vaccine. 2006; 25:5598-605.
10. Knirel Y.A., Lindner B., Vinogradov E.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Shaikhutdinova R.Z. et al. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopoly-saccharide of Yersinia pestis. Biochemistry. 2005; 44(5):1731-43. "
11. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning:
a laboratory manual. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982; 281 p.
12. Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics. 1972.
280 p.
13. Walsh C., GangloffM., Monie T., Smyth T., WeiB., McKinley T.J. et al. Elucidation of the MD-2/TLR4 interface required for signaling by lipid IVa. J. Immunol. 2008; 181(2):1245—54.
S.A.Ageev, R.Z.Shaikhutdinova, I.V.Bakhteeva, G.M.Titareva, T.I.Kombarova, S.V. Dentovskaya, A.P.Anisimov
Construction of Candidate Yersinia pestis Vaccine Strains with Reduced Reactogenicity
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
The technology of directed constructing of non-reverting Y. pestis AlpxM mutants, lacking antibiotic resistance markers was developed. It included direct site-specific mutagenesis, cloning of mutant AlpxM::cat allele in pCVD442 suicide vector, homologous recombination in vivo and deletion of the antibiotic resistance cassette. lpxM gene knockout mutant created on the basis of vaccine Y. pestis EV NIIEG strain lacking antibiotic resistance markers synthesized a lipopolysaccharide (LPS) with reduced ability to stimulate TNF-a production. The level of reduction of anti-inflammatory activity of the LPS synthesized by the mutant Y. pestis EVA lpxM strain was significantly higher in the test with human target cells in comparison with mouse model.
Key words: lpxM, site-specific mutagenesis, lipopolysaccharide, endo-toxic activity, Yersinia pestis.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Ashmarin I.P., Vorob’ev A.A. [Statistic Methods in Microbiological Investigations]. Leningrad: Gos. Izd. Med. Lit.; 1962. 104 p.
2. Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Knirel’ Yu. A., Ivanov S.A., AnisimovA.P. [Constructing of Gram-Negative Bacteria Vaccine Strains with Reduced Reactogenicity]. Mol. Gen. 2006; 2:3-8.
3. Dentovskaya S.V, Bakhteeva I.V, Titareva G.M., Shaikhutdinova R.Z., Kondakova A.N., Bystrova O.V, Lindner B., Knirel Y.A., Anisimov A.P. [Structural Diversity and Endotoxic Activity of the Lipopolysaccharide of Yersinia pestis]. Biochemistry. 2008; 73(2):192-9.
Authors:
Ageev S.A., Shaikhutdinova R.Z., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kombarova T.I., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: anisimov@obolensk.org
Об авторах:
Агеев С.А., Шайхутдинова Р.З., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: anisimov@obolensk.org
Поступила 27.01.11.
